人类外周血hPer1基因节律性表达的研究

目的生物节律广泛存在于人类生活和工作中,为研究正常人节律基因表达特点,定量检测正常年轻人外周血中节律基因Per1(humanPeriod1,hPer1)的表达。方法实验对象为7名大学生(H1-H7),年龄24￣30岁,男性3名,女性4名。其中H7于实验前1天晚上值夜班。分别在09:00,15:00,21:00,03:00,09:00点抽取肘静脉血6mL,抽提全血总RNA。应用竞争性RT-PCR方法定量检测实验对象外周血中每人每个时间点hPer1基因的表达。结果人类外周血中hPer1基因的表达有显著节律性。表达高峰在09:00而低峰在21:00,两者之间的差异达2.29±0.9倍(P<0.01),第2天09:00hPer1基因表达水平又回到最高峰。结论hPer1基因的表达在外周血中存在节律性。     

阿尔茨海默病患者皮质额叶基因表达谱研究

目的：通过研究阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)患者皮质额叶中发生差异表达的基因，揭示AD发生、发展的分子基础。方法：利用基因芯片分析3例AD患者皮质额叶中基因表达谱，通过与4例正常对照间的比对，寻找存在表达差异的基因。结果：所检测的5000个基因中，共有49个基因存在着差异表达。在患者中13个基因表达水平升高，36个基因表达水平降低。上述基因与多种生理过程，如氧化应激、胆固醇平衡、钙信号转导、炎症反应等密切相关。结论：AD的发生、发展涉及多种基因表达水平和多个生理过程的改变。     

成纤维细胞生长因子受体3基因荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

慢性骨髓白血病、恶性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤等疾病均发现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)的过量表达。因此，FGFR3有可能作为病理检验和疗效评价的标志分子。目前国内尚无定量测定FGFR3表达水平的方法。本试验运用SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测方法，建立了FGFR3基因的定量检测系统。为进一步FGFR3临床和基础研究作好了准备。报道如下。     

增龄对大鼠膈肌Glut-1和Glut-4mRNA表达的影响

目的研究大鼠膈肌Glut-1和Glut-4 mRNA的增龄变化情况,进一步探讨增龄对呼吸肌代谢及功能变化的机制。方法雄性健康清洁级SD大鼠24月龄7只、3月龄12只,应用RT-PCR方法检测大鼠膈肌Glut-1、Glut-4 mRNA表达。结果老年组大鼠Glut-1、Glut-4 mRNA表达较年轻组表达明显升高。结论大鼠膈肌不同于单纯骨骼肌和心肌,Glut-1、Glut-4 mRNA的表达具有特殊的增龄趋势。     

C57 BL/6J小鼠肝脏中mPer1基因CpG岛甲基化分析

目的 建立分析C57 BL/6J小鼠肝脏组织mPer1基因启动子区甲基化状态的亚硫氢酸修饰法,检测mPer1表达峰、谷对应的甲基化状态.方法 利用实时定量PCR方法检测mPer1基因表达时相特点,并利用亚硫氢酸修饰法对小鼠肝脏组织mPer1基因启动子区域CpG岛和E-box甲基化情况进行了研究.结果 C57 BL/6J小鼠肝脏组织mPer1基因表达有显著波动性,表达高峰位于ZT13.低谷位于ZT01.序列分析显示mPer1基因启动子区含有CpG岛,并且该CpG岛覆盖与mPer1波动性表达密切相关的顺式元件E-box1和E-box2.亚硫氢酸修饰测序结果 显示,mPer1基因启动子区CpG岛和E-box均呈低甲基化或非甲基化状态.不同时间点mPer1基因CpG岛甲基化频率无显著变化(P=0.458).结论 肝脏中mperl基因启动子区CpG岛和E-box均为开放状态,可以与时钟相关转录因子结合.甲基化不参与调节mPer1基因的节律性表达.     

视交叉上核脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养模型的建立

目的建立视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养的分子时钟诱导模型。方法选用7日龄SD大鼠,分离SCN脑片或皮层脑片,分别与NIH/3T3细胞共培养,分为SCN共培养组和对照组皮质共培养组,6d后连续24h每间隔6h收集NIH/3T3细胞,抽提细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测时钟基因Per1mRNA水平。结果SCN共培养组Per1的表达均表现明显的节律性(P=0.001),对照组大脑皮质共培养组Per1基因表达均无明显节律性变化。结论成功建立SCN脑片与NIH3T3细胞共培养模型并诱导细胞内分子时钟的节律性表达,为研究SCN调控外周组织细胞生物节律提供有力工具。     

小鼠纹状体多巴胺水平的节律性变化

目的：研究小鼠纹状体多巴胺等神经递质是否具有节律性变化，为进一步研究黑质多巴胺能神经元的功能提供实验依据。方法：实验于2004—04／08在北京老年病医疗研究中心神经生物学实验室进行。取60只C57BL／6J小鼠，在12h光照：12h黑暗条件下饲养两周，两周后随机分为6组，于24h内分6个时间点(9：00，13：00，15：00，21：00，1：00，5：00)分离小鼠的纹状体，用高氯酸提取纹状体中的多巴胺、3，4-双羟苯乙酸、5-羟色胺，其含量用反相高压液相色谱分离-电化学检测技术检测；纹状体中的蛋白含量用Lowry法检测，用作内部对照。多巴胺、3，4-双羟苯乙酸、5-羟色胺的含量用实测含量／蛋白含量(μg／g)表示。实验数据用均值&;#177;标准误来表示。结果：60只小鼠全部进入结果分析。①纹状体多巴胺水平：在24h内有波动，其中低谷处于1：00[（125．59&;#177;5．29)μg／g]，与9：00，21：00相比有显著差异[(151．34&;#177;3．35)，(147．68&;#177;2．5)μg／g，P&;lt;0．05]，波峰处于9：00。②3，4-双羟苯乙酸水平：在24h内也有波动，其低谷同样位于1：00[(6.59&;#177;0.32)μg／g]，与9：00相比有显著差异[(9.71&;#177;0．62)μg／g，P&;lt;0．05]。⑧5-羟色胺水平在各时间点之间无显著性差异(P&;gt;0．05)。结论：小鼠纹状体的多巴胺和3，4-双羟苯乙酸水平有节律性变化．5-羟色胺无节律性变化。表明黑质多巴胺能神经元具有节律性兴奋的特点．提示多巴胺的代谢可能受生物节律调节中枢控制。     

焦磷酸测序在帕金森病患者载脂蛋白E基因型检测中的应用

目的 基于焦磷酸测序平台建立符合临床检验要求的载脂蛋白E(ApoE)分型检测方法,使用该方法分析中国汉族人群中帕金森病(PD)与ApoE基因型的相关性.方法 扩增同时包含rs429358和rs7412位点的区段,设计两条测序引物,在同一反应体系中完成两个位点的测序反应.与Sanger测序结果进行比较,分析焦磷酸测序法的准确性.共纳入晚发散发PD患者208例和健康对照235名为受试者,分析两组受试者ApoE基因型和基因频率.结果 焦磷酸测序法可准确检测ApoE基因分型,能准确分析所有6种ApoE基因型.ApoE基因ε3/ε3型在两组受试者中最为常见,其次为ε2/ε3型和ε3/ε4型,两组受试者6种基因型比较和3种等位基因比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 焦磷酸测序法是符合临床检验要求的ApoE基因分型检测方法,且ApoE基因型不是PD发病风险因素.     

帕金森病患者的睡眠异常

目的研究帕金森病患者睡眠障碍发生及其特点和影响因素。方法收集患者病史资料并应用多导睡眠仪对10例帕金森病患者及5名健康对照进行多导睡眠监测。受试者分为3组:对照组、帕金森病Hoehn-Yahr(H&Y)Ⅰ级组及帕金森病H&YⅡ~Ⅳ级组。每组均包括男性3例,女性2例。结果3组年龄分别为(54·4±5·7)岁、(57·6±14·5)岁、(58·2±10·7)岁,年龄之间的差异无统计学意义(F=0·232,P=0·794)。对照组浅慢波睡眠时间为(70·6±7·8)min,而H&YⅠ级组患者浅慢波睡眠时间为(81·4±6·1)min,显著高于对照组(P=0·008);对照组睡眠效率为75·6%±12·8%,快动眼睡眠(REM)潜伏期为(116±48)min,浅慢波睡眠所占比例为70·6%±7·8%,REM所占比例为14·8%±5·5%,总睡眠时间为(372·8±53·4)min,而H&YⅡ~Ⅳ级组患者睡眠效率43·6%±16·0%(P=0·003)、REM所占比例7·3%±6·1%(P=0·003)及总睡眠时间(244·3±103·2)min(P=0·006)均显著低于对照组,REM睡眠潜伏期(281±86)min(P=0·000)及浅慢波睡眠时间(85·3±7·9)min(P=0·000)显著高于对照组。经相关分析,睡眠潜伏期、浅慢波睡眠时间与疾病病程存在显著正相关(r分别为0·889、0·492;P值分别为0·000、0·006),而睡眠效率、深慢波睡眠时间及总睡眠时间与疾病病程有显著负相关(r分别为-0·626、-0·723、-0·728;P值均为0·000)。结论研究结果显示,帕金森病患者在患病早期已经存在夜间睡眠时间减少、睡眠效率下降、睡眠潜伏期延长及睡眠结构的改变等异常,而且有随疾病进展而加重的趋势。     

帕金森病小鼠模型中分子时钟的变化

帕金森病人和帕金森病动物模型中都存在极为显着的节律丧失现象，包括体温变化节律性的丧失，心跳节律性的丧失，排尿节律性的丧失等。虽然在这些节律性丧失已经在生理水平和行为学水平得到反复的证实，但其分子机制仍然没有得到认识。近年来，一系列的节律基因逐步得到发现，包括Per1，Per2，Per3，Bmal1，Clock，Cry1，Cry2等。这些基因在转录和翻译水平相互调节构成网络，从而在分子，细胞，组织和整体水平产生节律。本研究使用MPTP处理C57小鼠，而制备出帕金森病小鼠模型。制模成功5天后，连续24小时，每隔4小时，处死小鼠。取小鼠大脑，纹状体，心脏，肝脏。