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目的 克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺毒素(Shiga toxin,Stx)Ⅱ型A、B亚单位,并鉴定其免疫学功能.方法 从EHECO157:H7基因组中克隆编码Stx Ⅱ型A、B亚单位的基因,经测序、酶切后,导入表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌Topl0F',经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)-A和GST-B融合蛋白.分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得高免血清,观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用.结果 Stx Ⅱ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化;A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击.结论 Stx Ⅱ型A、B亚单位蛋白可以作为EHEC O157:H7疫苗的候选分子,同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用. 相似文献
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目的:构建人源日本血吸虫Fab抗体库,筛选出日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:以3名晚期血吸虫患者切除的脾脏为源,构建人源日本血吸虫Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,库容为4.3×106,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过5轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取60个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(A3、B6、C4、C17),其中B6经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体B6,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。 相似文献
3.
徐凛峰 朱进 焦永军 张建平 XU Lin-feng ZHU Jing JIAO Yong-jun ZHANG Jian-ping 《南京医科大学学报(自然科学版)》2006,26(7):534-537
目的:克隆MAGE-1基因并对其进行原核表达及鉴定。方法:通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从原发性肝癌的细胞中扩增MAGE-1基因片段,将该片段克隆在原核表达载体PET-32a中,重组克隆转化大肠杆菌BL21(DE3),表达的蛋白以His亲和柱层析纯化,并用Dot-blot和Western-blot对其进行鉴定。结果:经RT-PCR扩增出930bp基因片段,经测序分析后的DNA序列与Genbank中的报道序列同源程度达98%,构建含重组表达载体PET32-M1的工程菌,经IPTG诱导表达、纯化,MAGE-1蛋白浓度为0.48mg/ml,经Dot-blot和Western-blot检测,纯化蛋白可以与商业化的驴抗MAGE-1的多抗结合。结论:成功扩增了肝细胞肝癌中的MAGE-1基因全长cDNA并对其进行了原核表达与鉴定,为进一步研究MAGE-1基因的功能和研制有临床价值的全人抗MAGE-1抗体奠定了基础。 相似文献
4.
目的基于上转化发光(UPT)免疫层析技术,建立发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)总抗体的现场快速检测方法。方法将SFTSV重组NP蛋白与上转化发光颗粒(UCP)偶联,制备UCP-NP免疫层析试纸条,评价该试纸条检测SFTSV总抗体的灵敏性、特异性和稳定性,并检测SFTSV血清254份,与酶联免疫法(ELISA)比较。结果该方法可在15min内完成SFTSV总抗体检测,可检测1∶500稀释度的SFTSV阳性血清,与其他出血热病毒无交叉反应,加样14d内稳定性较高。UPT免疫层析法与ELISA法检测临床血清样品一致性极高(Kappa=0.967),约登指数为0.973。结论建立了基于UPT免疫层析技术的SFTSV总抗体快速检测方法,该方法灵敏、特异,且操作简便、快速,结果稳定,适合在基层门诊和体检现场推广。 相似文献
5.
目的克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)非结构蛋白NSs,对其功能初步鉴定。方法采用PCR法扩增经密码子优化后的SFTSV NSs基因,并克隆至PGEX-4T-2载体中,构建原核表达载体PGEX-4T-2-NSs,经酶切、测序鉴定后转化表达菌BL21(DE3),再经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NSs融合蛋白,用Western Blot验证融合蛋白GST-NSs的抗原性。结果成功构建了GST-NSs融合蛋白原核表达载体,并在BL21细菌中获得高效表达;纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了SFTSV重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。 相似文献
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目的构建人源性严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)单链抗体(scFv)文库,并用SFTSV颗粒对文库进行初步筛选。方法提取8例SFTS恢复期患者外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录为cDNA;并以此为模板PCR扩增人源抗体轻链库(Vκ和Vλ)和重链库(VH),再经过重叠PCR随机拼接成scFv基因文库,最后克隆入噬菌粒载体pComb3XSS中,将重组噬菌粒电转化感受态XL1-Blue细胞,得到SFTSV抗体文库,检测文库库容及多样性,并用SFTSV颗粒作抗原对抗体文库进行初步筛选。结果构建的人源SFTSV抗体文库的库容为2.8×10~7,测序结果表明文库多样性好,经过初步筛选获得21个克隆的人源化scFv,具有与SFTSV颗粒结合的活性。结论成功构建了人源抗SFTSV的scFv文库。 相似文献
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目的通过对疾控中心实验室绩效考核指标的科学量化,建立评价体系,对实验室进行绩效考核,以提高其综合检测服务能力。方法建立适应疾控心实验室绩效管理的评价指标及其计算方法,并应用德尔菲法(Delphi technique),通过专家咨询方式,给出了各项指标的权重,建立了对疾控中心实验室绩效管理的评价体系,并用此体系方法对连云港市4家县级疾控中心实验室的工作实绩进行评估。结果通过科学的绩效考核评定,最终4家县级实验室评价一级绩效考核综合得分为75.4、71.8、59.1、52.9;原子吸收分光光度计的综合得分达75分以上的全市只有2家,良好率为40%,气相色谱仪的综合得分达60分以上只有1家,合格率为20%;实验室安全管理情况总评价良好。结论县级疾控中心实验室综合效能不高,应定期开展实验室绩效管理评价,促进疾控中心实验室管理更加科学化、规范化。 相似文献
9.
目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。 相似文献
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目的:高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是新近发现的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要血清学标志物?通过克隆?表达人GP73,制备抗GP73单克隆抗体并鉴定其特性?方法:克隆GP73基因,构建GP73原核表达载体pComb3XSS-GP73,诱导表达,以HisFF Trap亲和层析柱纯化GP73-6×His重组融合蛋白?以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗GP73单克隆抗体?以间接法ELISA检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测肝癌患者血清中GP73表达水平?结果:成功表达并纯化了GP73-6×His重组蛋白;获得5株稳定分泌抗人GP73单克隆抗体杂交瘤细胞株;免疫共沉淀证实抗GP73 单克隆抗体能与肝癌患者血清中GP73蛋白特异性结合,GP73水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高?结论:成功制备了抗人GP73单克隆抗体,为后期建立检测人GP73的双抗体夹心ELISA方法打下基础? 相似文献