细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景：细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题。 目的：实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响。 方法：将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠。在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞。 结果与结论：移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组 (P < 0.05)。扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达。结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响**

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。 目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。 方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。②S组：基质细胞+单个核细胞。③SF组：基质细胞+干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞数以及集落形成单位数。 结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133+细胞/有核细胞、CD34+细胞/有核细胞、CD133+CD34+细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

白细胞介素3与白细胞介素6对人脐血单个核细胞体外扩增及黏附分子和趋化因子受体4表达的影响**★

背景：体外扩增脐血造血细胞对增加脐血造血细胞数量及植入能力至关重要，合适的细胞因子组合介导的体外扩增不仅能使造血细胞数量增加，而且能够上调和归巢有关的黏附分子和趋化因子受体4的表达。 目的：实验拟观察白细胞介素3和白细胞介素6在人脐血单个核细胞体外扩增中的作用及对扩增后黏附分子和趋化因子受体4表达的影响。 设计、时间及地点：随机区组开放性实验，于2007-03/12在广西壮族自治区人民医院及广州医学院附属广州市第一人民医院血液实验室完成。 材料：10份足月顺产健康新生儿脐血标本。 方法：将自新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d，根据不同细胞因子组合实验分组为: 对照组（无细胞因子组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子组(A组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组(B组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素3 (C组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组+白细胞介素3 (D组) 。 主要观察指标：在0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+，CD34+CD62L+，CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位数。 结果：与对照组相比, A，B，C，D组均可有效的扩增脐血造血细胞(P < 0.05), C，D两组扩增效果均优于A，B组,差异显著（P < 0.05），但A，B两组之间无明显区别（P > 0.05）, D组能有效的扩增脐血细胞，并优于C组（P < 0.05）。A，B，C，D组细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞上CD49d, CD62L和趋化因子受体4的表达， A，B两组之间差异不显著（P > 0.05）,但均优于C组（P < 0.05），D组CD34+CXCR4+，CD34+CD62L+和CD34+CD49d+的细胞数扩增倍数优于A，B，C组（P < 0.05）。 结论：白细胞介素6组+白细胞介素3可协同扩增脐血细胞，并能促进和归巢有关的CD49d，CD62L及趋化因子受体4表达。     

不同细胞饲养层支持脐血CD34+细胞体外扩增的效果比较

背景：成纤维细胞饲养层与基质细胞饲养层一样能分泌多种细胞因子，其中包括起正性作用和负性作用的细胞因子，它们对共培养体系内的干/祖细胞起双向调节作用，但何时表现为抑制性或促进性作用目前尚无定论。 目的：分析比较骨髓基质细胞及皮肤成纤维细胞饲养层对脐血CD34+细胞体外扩增的影响，以了解共培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成。 材料：原代成纤维细胞、骨髓标本由广东医学院附属医院提供，脐血标本由广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科提供。 方法：体外分离培养人脐血单个核细胞，应用免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞。设立3组：液体培养对照组为脐血CD34+细胞(3×108 L-1)+ RPMI 1640培养液(含体积分数为10%牛血清白蛋白、10 μg/L粒-巨噬细胞集落刺激因子、10 μg/L干细胞因子、10 μg/L白细胞介素3)，接种于24孔培养板；骨髓基质细胞饲养层组、成纤维细胞饲养层组分别将体外分离培养的第4代人骨髓基质细胞/皮肤成纤维细胞接种于24孔培养板，70%融合时加入等量脐血CD34+细胞及相同成分的RPMI 1640培养液。 主要观察指标：脐血CD34+细胞增殖情况与集落形成能力。 结果：与骨髓基质细胞饲养层组比较，液体培养对照组、成纤维细胞饲养层组脐血CD34+细胞增殖率及集落形成能力均显著降低(P均< 0.01)；后2组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：骨髓基质细胞饲养层培养体系能促进脐血CD34+细胞体外扩增，并可以较好地保持脐血CD34+细胞的干细胞特性，效果显著优于成纤维细胞饲养层及液体培养体系。     

脐血贴壁层细胞和骨髓基质细胞对脐血单个核细胞增殖能力的影响★

目的：比较脐血贴壁层细胞和骨髓的基质细胞对脐血单个核细胞增殖能力的影响。 方法：实验于2005-02/07在吉林省肿瘤防治研究所完成。①对象：正常足月顺产儿脐带由长春市妇产医院提供；肋骨取自吉林省肿瘤医院外科手术患者，排除血液疾患。产妇及外科手术患者对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：采用红细胞裂解法制备有核细胞，以Ficoll-paque淋巴细胞分层液按密度梯度离心法分离出脐血单个核细胞，体外培养24 h后去除悬浮细胞，收集脐血贴壁层细胞，加入到24孔板中，2×106 L-1/孔，再加入含12.5%马血清、12.5%胎牛血清、1×10-7 mol/L氢化考地松的IMDM培养体系1 mL。将肋骨剪成3 cm小块，冲洗髓腔收集细胞悬液，用淋巴细胞分层液分离出骨髓单个核细胞，同法进行骨髓基质细胞的培养。分别将两种细胞于37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养3周后，各自加入到24孔板，2×106 L-1/孔，同时每孔再加入1×106 L-1脐血单个核细胞，培养7 d。以未添加脐血贴壁层细胞及骨髓基质细胞的脐血单个核细胞作为空白对照。③实验评估：倒置显微镜下观察脐血贴壁层细胞与骨髓基质细胞的生长状态。采用流式细胞仪测定脐血单个核细胞周期分布。甲基纤维素半固体培养法测定脐血单个核细胞混合集落形成单位情况。 结果：①脐血贴壁层细胞与骨髓基质细胞的形态：培养2周时，多数脐血贴壁层细胞呈大小不等的圆形、椭圆形，少部分呈不规则形；骨髓基质细胞主要为梭形，细胞排列成漩涡状、辐射状或相互缠绕成束状。②细胞周期：与空白对照相比，经脐血贴壁层细胞、骨髓基质细胞干预的脐血单个核细胞S+G2+M期所占比例均显著升高（P < 0.05）。③混合集落形成单位：经脐血贴壁层细胞、骨髓基质细胞干预后的脐血单个核细胞，其混合集落形成单位的数量显著高于空白对照（P < 0.05）。 结论：①脐血贴壁层细胞与骨髓基质细胞在形态上具有一定差异，但均能提高脐血单个核细胞体外增殖能力。②脐血贴壁层细胞可替代骨髓基质细胞作为脐血造血细胞体外扩增的辅助条件。     

脐带间充质干细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

背景：体外扩增是目前解决脐带血干细胞移植所面临的单份脐血造血干祖细胞数不足问题的主要手段。已有许多关于不同来源的间充质干细胞联合不同细胞因子支持脐血造血干祖细胞体外扩增的报道,而单独应用间充质干细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增的报道仍很少。 目的：观察应用脐带源间充质干细胞作基质层的体外培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-03/2007-05在中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、实验血液学国家重点实验室完成。 材料：经产妇知情同意,采集健康足月分娩胎儿脐带9份。 方法：应用贴壁培养的方法从正常足月出生儿脐带中分离培养间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型、分化实验进行鉴定。利用免疫磁珠分离法从正常足月出生儿脐带血中分离CD34+细胞。应用3种不同培养体系进行脐血CD34+细胞的体外扩增：单独应用脐带源间充质干细胞作基质层、细胞因子培养体系和间充质干细胞联合细胞因子培养体系。 主要观察指标：应用细胞计数法、集落培养计数法和流式细胞学检测法对扩增后细胞数量、集落形成能力和免疫表型进行分析比较。RT-PCR检测间充质干细胞中细胞因子的表达情况。 结果：培养第14天后,间充质干细胞组的CD34+细胞比例明显高于细胞因子联合间充质干细胞组;CD34+细胞总数为培养前的(4.19±1.37)倍,明显高于细胞因子组。培养第7天和第14天,间充质干细胞组的CD34+CD38-细胞亚群比例均高于另两组。RT-PCR结果显示,脐带源间充质干细胞体外可表达干细胞因子和血小板生成素早期干细胞效应因子。 结论：单独应用脐带源间充质干细胞可有效地对脐血CD34+细胞进行体外扩增,更有利于保持较早期干、祖细胞的扩增。 关键词：间充质干细胞;脐带;脐血;CD34+细胞;体外扩增     

人羊膜间充质干细胞支持造血的体外实验

背景：骨髓是目前间充质干细胞的主要来源，但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因，其应用具有一定局限性。近年来，羊膜作为间充质干细胞的新来源受到越来越广泛的关注。 目的：探讨人羊膜来源间充质干细胞在体外对造血干细胞的扩增是否有支持作用，以及怎样提高羊膜间充质干细胞和造血干细胞共移植成功率。 方法：利用组织块培养法，从足月分娩的人羊膜中分离培养羊膜间充质干细胞。密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，采用免疫磁珠分选技术分选其中CD34+细胞。分别用脐血单个核细胞和CD34+细胞与羊膜间充质干细胞共培养，连续4周，每周计悬浮细胞浓度，并以骨髓间充质干细胞组及无滋养层组作为对照。采用集落形成实验，把扩增的脐血单个核细胞和CD34+细胞分别接种至甲基纤维素半固体培养基中，14 d后根据典型形态特征计数造血集落数。 结果与结论：羊膜间充质干细胞可促进人脐血单个核细胞和CD34+细胞扩增，扩增后两者在甲基纤维素半固体培养基中能够形成造血祖细胞集落，其造血支持作用与骨髓间充质干细胞相似，两者对比无明显统计学差异。提示，羊膜间充质干细胞体外具有与骨髓间充质干细胞相似的造血支持作用，有可能为造血干细胞体外扩增及临床间充质干细胞与造血干细胞联合移植、提高造血干细胞移植成功率提供一种更加理想的间充质干细胞新来源。     

脐血间充质干细胞的体外培养及其表面标志变化*☆

背景：目前有关脐血间充质干细胞的体外培养和大规模扩增方法不一,存在一定困难。 目的：观察脐血间充质样干细胞体外分离和培养的方法,并检测其表面分子的变化。 方法：取新鲜采集脐带血,用1.077 g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将脐血单个核细胞接种于37 ℃、含体积分数为5%CO2培养箱内培养。于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况。 结果与结论：从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,CFU-GM与BFU-E集落形成最多,集落分别增加了(37.1±2.3)和(10.4±1.7)倍,瑞氏染色显示这些细胞大多数为粒系的集落(80.1±85.2)%,其次为红系的细胞集落(14.2±1.8)%,7 d后出现贴壁的扁平状上皮样细胞和长梭形成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂。扩增后第14天经流式细胞仪分析CD38+细胞为1.64%,CD34+/CD38+细胞为1.71%,CD34+/CD38-细胞为0.55%,PI+细胞为0.05%,Annexin-V+细胞为0.18%。随着培养时间的延长,细胞数目不断增加,培养21 d时,单个核细胞扩增了近7.8倍.,第28天增加了1.71倍。经流式细胞仪分析CD38+细胞为74.32%,CD34+/CD38+细胞为1.61%,CD34+/CD38-细胞为0.24%。提示脐血间充质干细胞可以体外培养。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？ 目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。 方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6 h内分别采用甲基纤维素沉降法(A组)、密度梯度离心分离法(B组)、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法(C组)、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法(D组)分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109 L-1~2×109 L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。 结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份(27%)培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5~7 d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或(和)圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60~90 d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

草分支杆菌对人脐血树突状细胞体外扩增的影响

背景：树突状细胞因其强大的抗原提呈能力而在机体抗肿瘤作用的中心地位逐渐受到重视，但如何能有效获得足够数量有功能的树突状细胞成为目前研究的重点，尤其是有关低毒免疫调节剂的报道较少。 目的：观察草分支杆菌F.U.36(乌体林斯，Utilins)对人脐血来源树突状细胞体外扩增的影响。 方法：应用Ficoll-Hypaque法分离人脐血单个核细胞，分别用乌体林斯，细胞因子(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+重组人肿瘤坏死因子α+重组人白细胞介素4)，细胞因子联合乌体林斯进行干预，并以RPMI-1640培养液诱导培养人脐血单个核细胞作为对照组，诱导培养树突状细胞，并于倒置显微镜下观察其生长情况及形态。培养第9天，采用流式细胞仪检测各组人树突状细胞特异性表型CD1a及MHC-Ⅱ分子HLA-DR的变化，并将细胞涂片行瑞氏-姬姆萨染液染色，油镜下观察摄片。 结果与结论：除对照组外，实验各组均得到高表达CD1a及HLA-DR的典型树突状细胞。乌体林斯组CD1a及HLA-DR阳性细胞比例亦明显高于对照组而低于细胞因子组 (P < 0.05)，联合组HLA-DR阳性细胞比例高于细胞因子组(P < 0.05)。结果提示，草分支杆菌F.U.36(乌体林斯)不仅能促进脐血树突状细胞体外扩增，还能协同细胞因子促进树突状细胞成熟。     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及对脐血CD34+细胞的扩增作用*

背景：Fms 样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)是一种重要的生长因子,通过激活特定的酪氨酸激酶受体,调控造血细胞的生长、生存和/或分化,具有促进造血干细胞体外扩增的应用潜力。 目的：构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,表达、纯化hFLext蛋白,观察其对脐血CD34+细胞的扩增作用。 方法：克隆hFLext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体。转化大肠杆菌 BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白。磁珠分选脐血CD34+细胞,单独加入hFLext或联合干细胞因子、血小板生成素孵育1周,观察体外扩增作用。 结果与结论：成功克隆hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体。在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hFLext融合蛋白,经8 mol/L尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白。Trx-hFLext融合蛋白不仅具有维持及轻度刺激CD34+细胞体外扩增的作用,并且与干细胞因子及血小板生成素具有协同作用,为造血干/祖细胞体外扩增研究奠定了基础。     

微囊微环境体外扩增人脐血造血干/祖细胞

背景：由于单份脐血所含的造血细胞数量有限,目前只能用于儿童或低体质量成人血液病和急性辐射损伤等疾病患者,有效扩增脐血造血干/祖细胞已成为研究热点。 目的：观察微囊微环境对脐血造血干/祖细胞扩增的影响,以及此过程中可否使造血干/祖细胞在扩增的同时仍维持其未分化状态。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2006-06/2007-09在中国科学院大连化学物理研究所完成。 材料：正常足月产新生儿脐带血由大连市妇产医院提供,提供者知情同意。 方法：Ficoll法梯度分离人脐血单个核细胞,采用静电液滴法在生理条件下进行微囊化包封和体外培养。以同条件平面培养的脐血单个核细胞作为对照。 主要观察指标：观察微囊化脐血细胞的生长特点及脐血细胞总数的变化;流式细胞仪检测培养过程中CD34+细胞扩增情况;应用甲基纤维素半固体培养法观察扩增细胞的集落形成能力。 结果：脐血细胞在微胶囊内持续增殖,并以聚集成团的三维方式生长,两种培养方式对脐血细胞总数均无明显影响(P > 0.05)。对比CD34+细胞扩增和细胞集落的生成发现,微囊化培养脐血细胞的CD34+细胞数量和集落密度均在培养第6天达到高峰,明显高于平面培养3 d时所达到的峰值;之后逐渐下降,至12 d后平面培养细胞的CD34+细胞和集落形成能力几乎检测不到,而此时微囊化培养的CD34+细胞数量和集落密度仍与平面培养的扩增高峰相近。 结论：微囊化培养能有效扩增人脐血造血干/祖细胞,并显著减缓造血干/祖细胞的分化进程,维持其多分化潜能,提示微囊为造血干/祖细胞维持未分化状态的扩增提供了特殊的微环境。     

基质金属蛋白酶9在慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞中表达及其对造血干细胞黏附的影响

背景：骨髓微环境中持续存在的肿瘤干细胞改变了骨髓基质细胞及细胞外基质的特征,从而参与了造血干细胞恶性转化的过程。 目的：探讨慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞基质金属蛋白酶9的表达,及其对造血干细胞黏附的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-09/2008-02在北京协和医学院基础学院完成。 材料：骨髓标本来源于4例慢性粒细胞白血病患者和4例健康志愿者,由解放军第三○九医院血液科提供。脐血由北京脐带血造血干细胞库提供,293T细胞由南开大学孔德领教授馈赠。 方法：分别采集健康志愿者和慢性粒细胞白血病患者的骨髓,Ficoll法体外分离培养获得骨髓间充质干细胞。将脐血分装,离心弃上清,吸取中间层,同法分离培养获得脐血单个核细胞。取处于对数生长期的骨髓间充质干细胞,按1×107 L-1接种于96孔板,培养至近100%融合时再将脐血单个核细胞按1×105/孔接种于同一培养板中,孵育1 h后对收集未黏附细胞,计算黏附率。取第2代骨髓间充质干细胞,ELISA法检测细胞培养上清中可溶性形式细胞间黏附分子1的质量浓度。构建MPP-9-siRNA干扰载体,以脂质体法转染包装293T细胞,扩增病毒后进行骨髓间充质干细胞转染。 主要观察指标：健康供者与慢性粒细胞白血病患者之间的5项指标比较,病毒转染前后慢性粒细胞白血病患者自身的3项指标比较。 结果：与健康供者比较,慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞基质金属蛋白酶9 mRNA及蛋白表达水平明显升高,细胞间黏附分子1的蛋白表达无明显差异,培养上清中可溶性形式细胞间黏附分子1的质量浓度明显升高（P < 0.05）,对脐血单个核细胞的黏附率明显降低（P < 0.05）。与未转染的骨髓间充质干细胞比较,病毒转染后骨髓间充质干细胞基质金属蛋白酶9 mRNA表达明显降低,细胞间黏附分子1的蛋白表达未受影响,对脐血单个核细胞的黏附率明显增加（P < 0.05）。 结论：慢性粒细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞可能存在基质金属蛋白酶9裂解细胞间黏附分子1的作用机制,推测游离的可溶性形式细胞间黏附分子1可能阻断了LFA-1的结合位点,从而影响骨髓间充质干细胞对造血干细胞的黏附。     

脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞的定向诱导*

背景：骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限、可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血。 目的：探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能。 设计、时间及地点：应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。 材料：新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意。 方法：无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养;取扩增第3或4代的人脐血间充质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸。 主要观察指标：用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达。 结果：人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD 29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45。培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白。 结论：人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞。     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景：为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点。 目的：比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。 设计、时间及地点：开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。 材料：16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供。 方法：采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验。流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化,通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。 主要观察指标：①细胞形态。②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期。③表面标志物的鉴定。④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况。 结果：①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P < 0.05)。两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P < 0.05)。②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P < 0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P < 0.05)。③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P < 0.05)。 结论：脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用。     

造血干细胞移植在肝脏疾病治疗中的应用与进展

造血干细胞基本来源于骨髓、脐带血及外周血,而终末期肝脏疾病患者身体状况很差,几乎不能耐受较大的创伤,因此用外周血干细胞移植的方法来获得转分化后的肝细胞,是一种很有发展潜力的方法。外周血干细胞移植时如果要获取足够数量的干细胞,必须对外周血进行动员,目前干细胞动员剂分为3种类型：化疗药物、硫酸葡聚糖等聚阴离子制剂、各种重组的人造血细胞刺激因子。对于有着严重肝脏疾病的患者来说,选用各种重组的人造血细胞刺激因子是相对安全的。在造血干细胞的分离方法中,目前应用最广泛的是密度梯度离心法,它可以获得富含单个核细胞的白细胞层,从而初步富集CD34+细胞。随着针对CD34+不同抗原决定簇的单克隆抗体的不断发现,准确、大量、快速阳性分选CD34+细胞的免疫学技术也在迅速开展,如固相分选技术、流式细胞仪分选等。利用造血干细胞的高度增殖能力及多向分化潜能,对其进行体外扩增和定向诱导分化,从而在短时间内产生大量的早期造血祖细胞,以及定向扩增的多种细胞如肝细胞等而应用于移植,目前应用骨髓造血干细胞转分化为肝细胞己获得成功。为判断在移植器官中真正转分化的细胞是否来源于输注的干细胞,常在移植前对输入细胞进行标记,标记的方法包括荧光标记、特殊染色、基因标记、染色体鉴定等,然后应用免疫学和分子生物学、荧光化学技术加以检测。现阶段应用造血干细胞移植治疗肝脏疾病多为基础实验,临床上尚未得到广泛运用。