体外诱导人骨髓间充质干细胞横向分化为角膜上皮细胞的可行性

背景：目前同种异体角膜移植是角膜病的主要治疗手段，但该法存在免疫排斥反应、供体来源短缺、角膜内皮细胞慢性丧失功能等难以克服的缺点。 目的：探讨人骨髓间充质干细胞在体外向角膜上皮细胞横向分化的可能性。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察，于2004-06/2005-06在江西省人民医院中心实验室江西省干细胞重点实验室完成。 材料：成人角膜缘上皮组织由江西省眼库提供，由志愿者捐献。经肝素抗凝的成人骨髓7份，来自江西省人民医院骨髓穿刺室同期收治的需要行骨髓细胞学检查的患者，均排除血液系统恶性疾病。 方法：无菌条件下将人角膜缘上皮组织剪碎，胰蛋白酶消化，过滤离心，加入含20% FBS的DMEM/F12培养液，制作条件培养基，置于-20 ℃备用。采用淋巴细胞分离液密度梯度法从人骨髓液中分离出单个核细胞层，贴壁法培养扩增，取传至第5代的骨髓间充质干细胞，按2×104个/孔密度接种，待细胞完全贴壁后吸除培养液，设立5组：第1组为空白对照，仅加入含10%FBS的DMEM/F12培养基继续培养；其余4组在空白对照的基础上分别加入5，10，15 μg/L表皮生长因子、10μg/L表皮生长因子+50%条件培养基，每3 d换液1次，培养30 d。 主要观察指标：通过细胞角蛋白抗体AE1、AE5免疫组织化学染色结果检测细胞横向诱导转化率。 结果：AE1免疫组化染色后与空白对照组比较，5，10，15 μg/L表皮生长因子组、10 μg/L表皮生长因子+50%条件培养基组的细胞显色率均明显升高（F=415.39，P < 0.01）；各诱导组间两两比较差异均有显著性意义（F=373.96，q=38.65，18.16，20.49，P < 0.01）；10 μg/L表皮生长因子组与10 μg/L表皮生长因子+50%条件培养基组细胞显色率基本相似（t=0.12，P > 0.05）。AE5免疫组化染色后，各组细胞的胞浆都能被DAB均匀淡染。 结论：5~15 μg/L表皮生长因子能诱导人骨髓间充质干细胞横向分化为角膜上皮细胞，且此浓度范围内的表皮生长因子诱导作用逐渐增强。用成人角膜缘干细胞培养液制成的50%条件培养基对诱导人骨髓间充质干细胞横向分化为角膜上皮细胞无明显促进作用。     

组织工程角膜上皮移植治疗兔角膜碱烧伤：形态学观察

背景：采用健康角膜缘干细胞体外培养形成组织工程化角膜上皮,移植于碱烧伤后角膜创面可促进创面的修复愈合。 目的：观察组织工程角膜上皮移植治疗角膜碱烧伤的疗效和时机。 设计、时间及地点：对比观察动物实验,于2007-07/2008-06在解放军总医院第一附属医院实验动物科完成。 材料：新西兰雌性大白兔21只,体质量2.0~2.5 kg,随机分为对照组和移植组,其中对照组8只16眼,移植组13只再分为：早期移植组,1 d移植组2只4眼、3 d移植组3只6眼、6 d移植组3只6眼、9 d移植组2只4眼;中期移植组,14 d移植组3只6眼。 方法：取21只兔上方健康角膜缘组织体外培养制备组织工程角膜上皮。21只兔双眼采用1 mol/L氢氧化钠制作改良角膜碱烧伤模型,移植组在碱烧伤后早期1,3,6,9 d和中期14 d行自体或同种异体组织工程角膜上皮移植,对照组烧伤后持续观察4周。 主要观察指标：移植组及对照组烧伤后4周内眼表和组织病理学变化。 结果：角膜碱烧伤后1周开始出现角膜上皮的大片脱落,2周角膜上皮大片脱落或溃疡发生率达72%,持续至4周,移植组在4周时发生率仅为25%,大多获得完整的角膜上皮;烧伤后早期移植组角膜基质深层炎性细胞浸润和新生血管生长较对照组明显受到抑制,而中期移植组角膜基质层较对照组并无明显差异;4周内异体组织工程角膜上皮移植的免疫排斥反应并不大于自体移植。 结论：自体或同种异体组织工程角膜上皮移植可尽快恢复眼表完整性,且烧伤后早期移植效果明显优于中期移植。     

兔脂肪干细胞的体外分离培养特性

背景：现有国内外文献报道的脂肪干细胞分离、培养方法并不完全一致，所应用的消化酶、消化方法、培养基等均存在差异。 目的：观察体外分离培养的兔脂肪干细胞生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-04/2008-03在昆明医学院生物医学中心干细胞所完成。 材料：健康成年新西兰大白兔6只，由昆明医学院实验动物中心提供。Ⅰ型胶原酶为美国Gibco公司产品，胰蛋白酶为美国Sigma公司产品。 方法：无菌切取兔腹股沟皮下脂肪垫，采用Ⅰ型胶原酶搅拌消化法分离培养原代脂肪干细胞，待细胞生长至80%融合时传代。 主要观察指标：倒置显微镜和苏木精-伊红染色观察细胞形态及生长情况，免疫荧光细胞化学染色检测细胞表面抗原的表达，MTT比色法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞增殖指数。 结果：自兔皮下脂肪分离培养获得的脂肪干细胞增殖迅速，低密度生长时呈三角形或短梭形，核/浆比例较大，接近融合时呈成纤维细胞样外观，长期传代形态无明显改变。第3代脂肪干细胞表面抗原CD44呈阳性表达，CD34为阴性；细胞生长曲线呈“S”形，在对数生长期其细胞倍增时间为59 h。随传代次数的增加，来自同一供体的兔源性脂肪干细胞增殖指数逐渐升高，至第8代达到最高，以后逐渐降低。 结论：兔皮下脂肪组织中含有丰富的间充质干细胞，兔源性脂肪干细胞体外以成纤维细胞样形态贴壁生长，表达CD44表面标志物，具有较强的体外增殖能力。 关键词：脂肪干细胞；生物学特性；组织工程；兔     

体外分离培养人皮下脂肪干细胞的生物学特性及影响因素★

目的：研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪源性干细胞，并表现出向多谱系细胞分化的特点。对来源于人皮下脂肪组织的脂肪干细胞进行体外培养，观察其形态特点、生物学特性及间充质来源细胞表面相关标志的表达。 方法：实验于2005-11/2007-02在泸州医学院医学分子生物学实验室完成。①对象：行切疤植皮术的正常体质量患者8例，年龄16~45岁，均无传染性疾病，来源于泸州医学院烧伤整形科，实验前征得患者同意。②实验方法：人脂肪干细胞的分离、培养与传代：无菌条件下取患者新鲜的皮下脂肪，I型胶原酶消化+贴壁法获取原代脂肪干细胞，生长至70%融合时传代，观察细胞的形态学变化。当原代细胞的胞质中出现较多透亮液滴后，行油红O染色。将第3代脂肪干细胞冻存，1个月后复苏，观察细胞的生长情况。选择生长状态良好的第3代脂肪干细胞，苏木精-伊红染色观察细胞形态，SABC法检测间充质来源细胞特异性标志波形蛋白的表达，SP法检测间充质干细胞表面相关抗原CD44的表达。取处于对数生长期的细胞，绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间。 结果：①原代和传代过程中人脂肪干细胞的形态学变化：原代和传代培养的细胞均为长梭形贴壁生长。当原代细胞达到50%融合后，部分细胞由梭形逐渐变为多角形或椭圆形，胞质内出现油红O染色阳性的脂滴。传代细胞中此现象逐渐消失，且经冻存后复苏的活细胞率达80%以上，细胞生长、增殖能力未受影响。②间充质来源细胞表面标志的鉴定：第3代人脂肪干细胞的胞质丰富，HE染色弱嗜碱性，呈淡蓝色；波形蛋白阳性率为(97.1±2.3)%，CD44阳性率为（85.4±3.22）%。③人脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间：传代培养的脂肪干细胞生长曲线呈“S”形，群体倍增时间为62.38 h。 结论：从人皮下脂肪组织分离培养出的脂肪干细胞，在体外扩增和冷冻保存后生物学特性稳定，且具有良好的增殖能力，表达间充质来源细胞表面标志波形蛋白和表面抗原CD44。     

兔阴道平滑肌细胞体外分离与培养

背景：阴道平滑肌细胞原代培养主要有两种方法：酶消化法和组织块贴壁法。前者培养所需时间短，产量高，但所需组织量较大，且试验中污染机会大，最佳消化时间不易把握；后者虽方法简便、有效，但培养所需时间较长。 目的：观察组织块+酶消化法原代培养兔阴道平滑肌细胞时间，并与组织块法比较。 设计、时间及地点：体外观察实验，于2005-02/2006-02在南昌大学第一附属医院烧伤研究所及动物实验室完成。 材料：四五个月龄雌性新西兰大白兔，体质量2.0~2.5 kg。 方法：①组织块法原代培养阴道平滑肌细胞：将修剪好的1 mm×1 mm×1 mm组织块均匀地接种于培养皿中，然后放入37 ℃恒温培养箱中静置培养3.0~4.0 h，待组织块贴壁牢固后，再补加含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液，使组织块浸于培养液中，37 ℃恒温静置培养3.0~4.0 d，待细胞游出后换液,大约每3天换液一次。②组织块+酶消化法原代培养阴道平滑肌细胞：将组织块用0.1%胶原酶Ⅳ在37 ℃培养箱中消化0.5~1.0 h，至组织块边缘变毛时中止消化，然后将消化好的组织块接种于培养皿上，其余步骤同组织块法。③传代培养：第1次传代时机应根据细胞生长具体情况而定，在细胞达50%~60%融合时即进行传代培养。第2次以后传代，在细胞生长达80%融合时进行传代培养。 主要观察指标：①原代培养所需时间。②第3代阴道平滑肌细胞表面结构和超微结构。 结果：组织块+酶消化法原代培养细胞萌出时间较组织块法早1.0~2.0 d，细胞融合时间较组织块法早3.0~4.0 d，细胞可稳定传5~6代。倒置显微镜下观察两种方法所培养细胞呈梭形或多角形，融合时部分区域细胞出现平滑肌细胞特征性生长表现“峰-谷”状结构。透射电镜下观察，第3代阴道平滑肌细胞核呈锯齿状，胞浆内含平滑肌细胞特征性结构肌丝和密体，含有大量高尔基体,粗面内质网扩张，游离核糖体丰富,提示获得合成表型阴道平滑肌细胞比例大。 结论：组织块+酶消化法原代培养周期较短，需要注意的是在取材、分离整个操作过程中需保持阴道组织块湿润；胶原酶消化组织块时间不应过长，以组织块周边呈现毛须状为度；此外应在静置状态下培养。     

分离扩增肋软骨细胞在三维支架上的种植与培养

摘要 背景：外科长段气管切除后，需要应用气管替代物，理想的替代材料需具有相当的强度、可弯曲性以及内面覆盖的上皮。合适的种子细胞、性质优良的载体、良好的生长媒介是组织工程化气管构建中最重要的组成部分。 目的：寻找分离培养肋软骨细胞的最佳方法，构建软骨-支架模型。 方法：将取出的兔第5，6肋软骨切成组织片，经胰酶、蛋白酶消化或酶处理后贴壁，分离肋软骨细胞并扩增。传代2次后种植于聚乳酸羟基乙酸或涤纶支架上，继续载体外环境下培养。观察单层培养扩增中软骨细胞的形态、结构，及在支架上培养时的细胞生长状态、外分泌基质。 结果与结论：酶消化法和组织块培养法所获细胞均为原代肋软骨细胞，单次传代时间为5 d，但组织块培养法分离细胞较慢，且存在成纤维细胞污染情况，提示酶消化法适合用于肋软骨细胞的分离。肋软骨细胞种植于支架后贴附良好，第2周时可见基质分泌，获得软骨-支架模型，可用于构建组织工程化气管。 关键词：软骨；培养；支架；酶消化法；生物材料；组织块培养法；组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.34.007     

小鼠胎肝干细胞的分离培养与鉴定

背景：胎肝细胞可能具有比骨髓干细胞等更强的增殖分化能力和更低的免疫原性，但目前涉及胎肝干细胞直接分离、培养的报道甚少。 目的：拟在体外分离培养小鼠胎肝干细胞，并对其生物学特性进行初步鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-03/06在重庆市神经病学重点实验室完成。 材料：SPF级13.5 d龄昆明种胎鼠9只，由重庆医科大学实验动物中心提供。 方法：采用胶原酶+EDTA联合消化法与差速贴壁法体外分离胎鼠肝干细胞，按2×108 L-1接种，待细胞80%~90%汇合后消化传代。采用链霉亲和素-生物素-过氧化酶复合物技术对原代接种后5 d的贴壁细胞进行多种肝干细胞表面标志物的标记。 主要观察指标：原代胎肝干细胞形态变化，胎肝干细胞的传代扩增情况，胎肝干细胞表面标志的表达。 结果：原代培养24 h细胞贴壁，呈致密圆形，边缘清楚；3 d左右部分细胞呈梭形，7 d后细胞铺展呈上皮样；传代后细胞扩增速度无明显变化，至第5代仍保持较均一的上皮细胞状。原代接种后5 d的贴壁细胞，人干细胞因子受体与甲胎蛋白呈阳性表达，白蛋白与细胞角蛋白19呈阴性。 结论：胎肝干细胞原代培养早期表达甲胎蛋白与人干细胞因子受体，不表达白蛋白和细胞角蛋白19，提示所分离的胎肝干细胞可能是一种较原始的干细胞，尚处在未分化的早期阶段。     

小鼠胰腺干细胞饲养层条件下的连续传代培养

背景：胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题。 目的：在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在广西中医学院基础医学院细胞无菌培养室完成。 材料：SPF级新生昆明小鼠20只,孕14 d昆明小鼠多只,均购自广西中医学院实验动物中心。 方法：取SPF级新生昆明小鼠的胰腺组织,Ⅴ型胶原酶消化,未消化完全的组织块自然沉降后,收集上层的含细胞离散液,离心弃上清,加入含角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM培养基,在经多聚赖氨酸溶液处理的24孔板中培养。取孕14 d昆明小鼠,剖腹取胎鼠,去除头部及内脏,将躯干及四肢采用组织块胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞,调整密度为5×108 L-1接种于24孔板中,传至第3代经丝裂霉素适当处理制备饲养层细胞。取原代培养5 d的胰腺干细胞,按30个/cm2密度种入铺有饲养层细胞的孔板中,当胰腺干细胞铺满小孔底部面积的80%时继续传代。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态变化,原代培养48 h对细胞进行碱性磷酸酶染色,通过免疫组织化学染色鉴定胰腺干细胞特异分子标志物巢蛋白的表达。分别于传代后2,3,4,5 d检测碱性磷酸酶、巢蛋白和胰十二指肠同源盒基因1的表达。 结果：原代培养的来源于胰腺组织的细胞中,可见一些大、圆、单个核的细胞,胞浆折光性强,核浆比例大,呈附壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达胰腺干细胞特异性分子标志巢蛋白,且具有活跃的分裂增殖能力。在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件下对胰腺干细胞进行体外传代培养,可连续传至第3代,各代胰腺干细胞仍保持大、圆、单个核、核浆比例大及增殖能力强等特性,传代后各时间点碱性磷酸酶、巢蛋白染色均呈阳性,胰十二指肠同源盒基因1蛋白染色呈阴性反应,可保持未分化状态。 结论：以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经丝裂霉素C处理后可分泌供胰腺干细胞生长所需的因子,并抑制胰腺干细胞的自主分化,体外连续传至第3代仍能够保持较好的生长特性、高度增殖能力及未分化状态。     

小肠黏膜下层无细胞基质作为阴道平滑肌细胞载体的可行性

摘要 背景：目前国内外用于阴道组织工程研究的主要支架材料聚乙醇酸存在降解过快等缺陷。天然脱细胞支架材料尤其是小肠黏膜下层逐渐成为组织工程研究的重点。 目的：探索用猪小肠黏膜下层基质作为组织工程学阴道细胞载体的可行性。 方法：取新西兰雌兔,分离出阴道平滑肌组织块,组织块+酶消化法原代培养阴道平滑肌细胞。体外培养传代后作为种子细胞接种于自制猪小肠黏膜下层基质体外联合培养,倒置显微镜动态观察细胞形态及生长增殖情况,分别于1,2,3,4周时取标本,行组织学检查。 结果与结论：①体外成功培养出阴道平滑肌细胞,倒置显微镜下,见培养的阴道平滑肌细胞呈现长梭状,细胞集结于培养皿上形成典型的“峰和谷”样构型。②黏膜下层无细胞基质外观呈白色,半透明,有一定韧性。苏木精-伊红染色未见细胞成分存在。③阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片苏木精-伊红染色后,光镜下可见细胞成分逐渐增多,由表浅向深层部位生长。④阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片采用抗兔平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色后,均可见抗兔α-Actin的阳性细胞。结果初步证明了猪小肠黏膜下层基质可作为一种平滑肌细胞载体。 关键词：阴道平滑肌细胞;组织工程;猪小肠黏膜下层;细胞载体;支架材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.001     

大鼠脐带源间充质干细胞的分离及生物学性状**☆

背景：关于大鼠骨髓来源的间充质干细胞用于移植免疫耐受及进行组织修复的研究很多,但尚无脐带来源间充质干细胞的相关研究。 目的：建立从大鼠脐带分离间充质干细胞的方法,并观察其生物学性状。 方法：大鼠脐带经酶消化和组织块培养两种方法进行分离培养,于DMEM-LG培养基中培养,倒置显微镜观察细胞形态,细胞计数绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及细胞表型,免疫组织化学染色检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力。 结果与结论：两种方法均能成功地从大鼠脐带中获得大量的间充质干细胞：原代培养显示,胶原酶消化法比组织块培养法的效率更高,大约10 d就可以进行传代,而组织块培养法要14 d才能传代;传代扩增两者之间没有差别。免疫表型分析显示,大鼠脐带源细胞表达黏附分子和基质细胞标记CD90、CD106,不表达造血细胞标记CD34、CD45。体外诱导实验证实,大鼠脐带间充质干细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。     

纤维蛋白支架三维培养人羊膜细胞的生物学特性

背景：未足月胎膜早破是产科常见的妊娠期并发症,三维培养可使组织缺损恢复解剖学上的完整性,使得细胞培养成为更有实用价值的技术。 目的：通过观察人羊膜细胞在纤维蛋白支架上三维培养后的生物学特性变化,探讨细胞/支架复合物模拟体内羊膜组织用于未足月胎膜早破破口修复的可能性,并与普通平面二维培养结果进行比较。 设计、时间及地点：细胞-支架学体外观察,于2007-12/2008-11在重庆医科大学基础研究所完成。 材料：剖宫产孕妇的羊膜组织,由重庆医科大学附属第一医院妇产科提供。纤维蛋白原为Sigma公司产品。 方法：将酶消化法和反复贴壁法相结合,体外分离培养并纯化羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞。纤维蛋白原聚合后,取处于对数生长的上皮细胞,接种于纤维蛋白支架表面,模拟胶上型三维立体培养;在纤维蛋白原聚合前,将处于对数生长的间质细胞和纤维蛋白溶液混合,模拟胶内型三维立体培养。同时将上皮细胞和间质细胞接种于24孔板中,进行普通平面二维培养。 主要观察指标：倒置显微镜及电镜下观察细胞的形态学特征,不同培养条件下间质细胞的增殖情况,间质细胞和支架的相互作用。 结果：在纤维蛋白支架表面,上皮细胞形态较平面培养圆润,细胞间可见伪足伸出,表面微绒毛丰富;在纤维蛋白胶中,间质细胞呈梭形,沿支架伸展,可见细胞在不同平面形成网络状。三维立体培养下,间质细胞增殖活性平稳,但增长幅度较平面培养缓慢。在胶内型三维立体培养中,随时间的延长纤维蛋白胶发生收缩,凝胶厚度逐渐降低,至第5天纤维蛋白胶厚度占原厚度的40%左右,第15天收缩到原厚度的10%左右。 结论：羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞能够在纤维蛋白支架上立体生长,增殖活性平稳;在细胞-纤维蛋白支架复合物中,可观察到纤维蛋白胶随着时间推移而发生收缩的现象,提示羊膜细胞-纤维蛋白支架复合物可模拟体内组织,作为胎膜早破破口修复的生物学材料。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性***☆

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。 目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。 方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。 结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

人羊膜上皮细胞在体内外不同脑损伤环境中向神经元样细胞转化

移植细胞的存活及分化与局部的微环境关系密切。实验发现,RPMI 1640培养基与创伤性脑组织提取液构成的体外模拟创伤性脑损伤微环境下培养的人羊膜上皮细胞部分呈现锥形、三角形或不规则形,伸出类似神经元样的突起, 部分细胞突起相互交织相连,表现出神经元样形态,部分形态改变明显的人羊膜上皮细胞呈微管相关蛋白2阳性表达。人羊膜上皮细胞移植于创伤性脑损伤大鼠脑挫伤灶中心和边缘处后,可存活至少4周,且也呈微管相关蛋白2阳性表达,并使创伤性脑损伤大鼠后肢运动功能明显改善。     

孕足月羊水干细胞的分离培养

背景：孕中期羊水干细胞的分离培养及生物学性状研究已取得了一定进展,但孕足月羊水是否也可作为干细胞来源目前报道不多。 目的：探讨从孕足月羊水中分离培养羊水干细胞的可行性。 设计、时间及地点：观察性实验,于2007-10/2008-08在解放军总医院妇产科及解放军军事医学科学院干细胞及再生医学研究室完成。 材料：孕足月羊水来自在解放军总医院行剖宫产、排除胎儿畸形及母体全身性疾病的孕妇,告知后同意留取羊水标本10例;鼠龄2个月雄性BALB/C裸鼠,体质量15~20 g,用于致瘤实验的观察。 方法：从10例孕晚期(孕38~40周)羊水中分离扩增羊水干细胞进行传代培养,取第5,10代对数生长期的细胞在酶标仪450 nm波长处检测吸光度(A)值,绘制羊水干细胞生长曲线;待细胞70%汇合时换为脂肪诱导培养基用于检测体外分化能力;分别于第4代,第11代行染色体核型分析;取第4~6代羊水干细胞1×107个注射到BALB/C裸鼠皮下,观察8周。 主要观察指标：①羊水干细胞的形态学特点及生长曲线。②流式细胞仪及免疫荧光法检测羊水干细胞表面标志的表达。③体外向脂肪细胞分化的能力。④染色体核型及致瘤实验结果。 结果：10例孕晚期羊水中有4例分离到梭形可持续传代的细胞群,细胞增殖旺盛;羊水干细胞原代生长较慢,传代后生长迅速,第5代,第10代细胞的生长曲线形态相似;流式细胞仪检测证实孕足月羊水干细胞表达CD44,CD29,CD105等间质来源标志,免疫荧光检测显示表达胚胎来源标志SSEA-4及oct-4;换为脂肪诱导培养基后6 d,细胞内出现透明、浑圆的小液滴,表明向脂肪样细胞分化;所有标本的染色体核型均为46XX或46XY,第11代染色体核型保持正常;羊水干细胞注射到裸鼠体内后无肿瘤形成。 结论：孕晚期羊水也可分离培养到干细胞,可以作为干细胞的新来源。     

骨髓间充质干细胞分泌基质细胞衍生因子1对异体T淋巴细胞和白血病细胞HL-60增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞持续分泌的基质细胞衍生因子1与其受体CXCR4的相互作用，不仅在细胞的炎症反应、造血干细胞的迁移与归巢等生物学过程中发挥作用，还在肿瘤的发生、转移、复发、免疫耐受及血管新生过程中扮演重要角色。 目的：探讨骨髓间充质干细胞分泌的基质细胞衍生因子1对T淋巴细胞及白血病细胞HL-60增殖的影响。 设计：细胞学体外对照观察。 材料：骨髓标本来自本院血液科异基因骨髓移植供者及骨髓象正常的非白血病患者，T淋巴细胞来源于健康志愿者，急性髓性白血病细胞株HL-60为本实验室液氮冷冻保存，CXCR4单克隆抗体12G5为eBioscience公司产品。 方法：应用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，传至第3代后收集培养5 d的细胞上清，离心去沉淀后备用。应用尼龙棉柱法分离异体外周血T淋巴细胞，调整细胞密度为2×109 L-1备用。T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞的共培养实验设立3组：T淋巴细胞组、T淋巴细胞+细胞上清组、T淋巴细胞+细胞上清+单抗组。HL-60细胞与骨髓间充质干细胞的共培养实验设立3组：HL-60细胞组、HL-60细胞+细胞上清组、HL-60细胞+细胞上清+单抗组。 主要观察指标：MTT法检测T淋巴细胞及HL-60细胞在应用单克隆抗体12G5前后的增殖情况。 结果：与T淋巴细胞组比较，T淋巴细胞+细胞上清组、T淋巴细胞+细胞上清+单抗组的吸光度值均明显降低（P < 0.05），后两组间比较差异无显著性意义（P > 0.05）。与HL-60细胞组比较，HL-60细胞+细胞上清组吸光度值明显升高（P < 0.05）；与HL-60细胞+细胞上清组比较，HL-60细胞+细胞上清+单抗组的吸光度值明显降低（P < 0.05）。 结论：加入单克隆抗体12G5阻断基质细胞衍生因子1的生物学效应后，不影响骨髓间充质干细胞上清液抑制T淋巴细胞增殖的效果，但可以抑制白血病细胞HL-60的增殖。     

高压氧对缺氧缺血脑源性神经干细胞分化的影响

BACKGROUND： It has been previously shown that hyperbaric oxygen may promote proliferation of neural stem cells and reduce death of endogenous neural stem cells （NSCs）.
OBJECTIVE： To explore the effects of hyperbaric oxygen on the differentiation of hypoxic/ischemic brain-derived NSCs into neuron-like cells and compare with high-concentration oxygen and high pressure.
DESIGN, TIME AND SETTING： An in vitro contrast study, performed at Laboratory of Neurology, Central South University between January and May 2006.
MATERIALS： A hyperbaric oxygen chamber （YLC 0.5/1A） was provided by Wuhan Shipping Design Research Institute; mouse anti-rat microtubule-associated protein 2 monoclonal antibody by Jingmei Company, Beijing; mouse anti-rat glial fibrillary acidic protein monoclonal antibody by Neo Markers, USA; mouse anti-rat galactocerebroside monoclonal antibody by Santa Cruz Biotechnology Inc., USA; and goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate-labeled secondary antibody by Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd., China.
METHODS： Brain-derived NSCs isolated from brain tissues of neonatal Sprague Dawley rats were cloned and passaged, and assigned into five groups： normal control, model, high-concentration oxygen, high pressure, and hyperbaric oxygen groups. Cells in the four groups, excluding the normal control group, were incubated in serum-containing DMEM/F12 culture medium. Hypoxic/ischemic models of NSCs were established in an incubator comprising 93% N2, 5% 002, and 2% 02. Thereafter, cells were continuously cultured as follows： compressed air （0.2 MPa, 1 hour, once a day） in the high pressure group, compressed air ＋ a minimum of 80% 02 in the hyperbaric oxygen group, and a minimum of 80% Q2 in the high-concentration oxygen group. Cells in the normal control and model groups were cultured as normal.
MAIN OUTCOME MEASURES： At day 7 after culture, glial fibrillary acidic protein, microtubule-associated protein 2, and galactocerebroside immunofluorescence staining were examined to observe differentiation and calculate the percentage of NSCs differentiating into neuron-like cells or neuroglia-like cells.
RESULTS： Neuron-like cells or neuroglia-like cells were visualized in all five groups. There were no significant differences in the percentage of differentiating cells between the hyperbaric oxygen group and the normal control group （P 〉 0.05）. The percentage of NSCs differentiating into neuron-like cells in the hyperbaric oxygen group was significantly greater than model, high-concentration oxygen, and high pressure groups; however, the percentage differentiating into neuroglia-like cells was significantly lower （P 〈 0.01 ）.
CONCLUSION： Hyperbaric oxygen promotes the differentiation of brain-derived neural stem cells into neuron-like cells but inhibits differentiation into neuroglia-like cells. Furthermore, the efficacy of hyperbaric oxygen is superior to high-concentration oxygen and high pressure.     

间充质干细胞在眼科领域的研究与应用

目前间充质干细胞治疗主要应用于局部移植、系统移植、结合干细胞的基因治疗以及组织工程领域。基于间充质干细胞易于分离培养、扩增,易于外源基因的导入和表达,在体外长期培养的过程中始终保持多向分化潜能,遗传背景相当稳定,在眼组织工程中具有广泛的应用前景。目前国内外已有大量研究证实间充质干细胞可分化为角膜及视网膜细胞,间充质干细胞在眼前节的应用多借助于某种载体,如羊膜、纤维凝胶膜等,另外温度敏感培养皿实现了无载体的眼表干细胞移植;在眼后节的应用重点集中于寻找治疗视网膜色素变性可行的治疗方法上。间充质干细胞作为种子细胞参与眼部受损组织修复与再生的研究趋于成熟,但其致瘤性及安全性还有待进一步解决。     

人羊膜间充质干细胞支持造血的体外实验

背景：骨髓是目前间充质干细胞的主要来源，但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因，其应用具有一定局限性。近年来，羊膜作为间充质干细胞的新来源受到越来越广泛的关注。 目的：探讨人羊膜来源间充质干细胞在体外对造血干细胞的扩增是否有支持作用，以及怎样提高羊膜间充质干细胞和造血干细胞共移植成功率。 方法：利用组织块培养法，从足月分娩的人羊膜中分离培养羊膜间充质干细胞。密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，采用免疫磁珠分选技术分选其中CD34+细胞。分别用脐血单个核细胞和CD34+细胞与羊膜间充质干细胞共培养，连续4周，每周计悬浮细胞浓度，并以骨髓间充质干细胞组及无滋养层组作为对照。采用集落形成实验，把扩增的脐血单个核细胞和CD34+细胞分别接种至甲基纤维素半固体培养基中，14 d后根据典型形态特征计数造血集落数。 结果与结论：羊膜间充质干细胞可促进人脐血单个核细胞和CD34+细胞扩增，扩增后两者在甲基纤维素半固体培养基中能够形成造血祖细胞集落，其造血支持作用与骨髓间充质干细胞相似，两者对比无明显统计学差异。提示，羊膜间充质干细胞体外具有与骨髓间充质干细胞相似的造血支持作用，有可能为造血干细胞体外扩增及临床间充质干细胞与造血干细胞联合移植、提高造血干细胞移植成功率提供一种更加理想的间充质干细胞新来源。     

人骨髓CD34+干细胞分离培养及血管内皮生长因子165诱导分化的作用

背景：有研究证实，骨髓中CD34+干细胞在一定条件下具有向内皮细胞分化的潜能。 目的：体外分离、纯化、培养和扩增人CD34+造血干细胞，并检测其免疫学表型，观察血管内皮生长因子对其体外诱导分化后细胞免疫表型的变化。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。 材料：骨髓来源于健康供者。 方法：利用Percoll 梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离培养、扩增人骨髓CD34+干细胞。采用脂质体介导转染法，选生长良好的传代细胞，以血管内皮生长因子165 基因转染人骨髓CD34+干细胞。 主要观察指标：采用免疫荧光和流式细胞术检测人骨髓CD34+干细胞免疫学表型。经血管内皮生长因子165 基因转染后，人骨髓CD34+干细胞的表型变化以及血管内皮生长因子的分泌情况。 结果：体外分离培养出高度同源性的人骨髓CD34+干细胞，细胞形态呈成纤维细胞样。CD44、CD29和c-kit阳性，CD31和CD54阴性；经血管内皮生长因子165 诱导后，人骨髓CD34+干细胞表面标志CD44 表达降低，CD31升高，呈现典型的内皮细胞表型，并且获得大量分泌血管内皮生长因子的能力。 结论：采用Percoll分离液梯度离心继以贴壁筛选法及单克隆培养法联合筛选分离，可培养扩增出高度同源的CD34+干细胞，经血管内皮生长因子基因转染后，CD34+干细胞呈典型的内皮细胞表型，验证了其具有向内皮细胞分化的潜能。