9L/F344与C6/Wistar大鼠脑胶质瘤模型局部细胞免疫反应的比较研究

目的对9L/F344和C6/Wistar两种大鼠脑胶质瘤模型肿瘤局部细胞免疫反应情况进行比较研究.方法采用立体定向技术建立两种大鼠脑胶质瘤模型.定期处死大鼠取脑,常规石蜡切片,苏木精-伊红染色行肿瘤组织病理学观察;冰冻切片,行免疫组织化学染色,观察大鼠脑内肿瘤淋巴细胞浸润情况.结果两种模型脑内肿瘤组织病理学均具有恶性脑胶质瘤的特点.C6/Wistar模型肿瘤周边和瘤内可见大量单个核细胞浸润,肿瘤周边血管呈现"淋巴细胞血管套"现象.肿瘤局部CD68、CD4、CD8阳性的淋巴细胞在C6/Wistar模型中多见;9L/F344模型中可见CD68阳性细胞,但数量较C6模型中为少,P＜0.01,且未见CD4、CD8阳性细胞.结论9L/F344模型肿瘤局部T淋巴细胞浸润少.C6/Wistar模型肿瘤周边及瘤内淋巴细胞浸润明显,存在强烈的细胞免疫反应,不适用于胶质瘤免疫治疗的实验研究.     

同源基因型9L/Fischer344大鼠脑胶质细胞瘤模型的建立

目的建立稳定的同源基因型9L/Fischer344大鼠脑胶质细胞瘤模型.方法采用立体定向技术,于Fischer344大鼠右侧尾状核区,接种定量的9L细胞;连续观察大鼠的生存状态、生存时间;大鼠死亡后,脑标本制片,行肿瘤组织病理学观察,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白免疫组织化学检测.结果①在接种后45 d观察期内,大鼠全部死亡.脑内分别接种5.0×102、1.0×105 和1.0×106 9 L细胞的三组大鼠的中位生存时间分别为38、24、15 d.②接种1.0×105 9 L细胞的大鼠,于接种后10、14、20 d MRI增强扫描,脑内接种部位均见肿瘤,并呈持续生长.③组织病理学观察,肿瘤界线较明显,但无包膜,肿瘤细胞向周边脑组织内浸润,新生血管丰富,多见出血、坏死等特点.肿瘤细胞免疫组织化学GFAP和S-100蛋白染色阴性.结论同源基因型9L/Fischer344大鼠脑胶质细胞瘤模型成功建立,该模型稳定可靠,大鼠脑内肿瘤持续生长,符合恶性胶质肉瘤生物学特性.     

氩氦冷冻治疗9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型的病理学研究

目的 探讨氩氦冷冻治疗9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型的病理改变. 方法 种植9L胶质瘤细胞于30只Fischer344大鼠鼠背建立9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型,并按随机数字表法分为空白对照组(自然生长,不进行任何处理)和氩氦冷冻组(给予氩氦冷冻治疗).接种后30d取出肿瘤组织进行病理学观察,应用HE染色、电镜下观察冷冻消融的肿瘤组织形态,应用免疫组织化学染色检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白表达. 结果 (1)光镜下空白对照组肿瘤细胞巢状排列紧密,肿瘤无包膜,瘤周小血管扩张,可见肿瘤细胞沿小血管浸润生长;瘤内新生血管丰富,瘤内常见出血、凝固性坏死灶.高倍镜下肿瘤细胞形态多样,核大深染、多核,异型性高.肿瘤细胞GFAP、S-100染色阴性,肿瘤细胞间胶质网可见阳性染色.(2)氩氦冷冻组HE染色显示冷冻中央区呈均匀性凝固性坏死,边缘区的炎性反应带主要为一些细胞碎片及大量的红、白细胞浸润:微血管内也发现大量的红细胞、血小板集合和血栓形成,并可见灶性出血.电镜显示冷冻区中央、边缘区组织细胞全部坏死或凋亡. 结论 氩氦刀可能是治疗胶质瘤有效的方法.     

骨髓基质干细胞向大鼠脑胶质瘤的趋向迁移作用

目的 研究骨髓基质干细胞(BMSCs)向大鼠脑胶质瘤的趋向性.方法 在体外分离培养Fisher344大鼠BMSCs.流式细胞仪检测细胞免疫表型;Transwell法分别将BMSCs、NIH3T3细胞与9L细胞进行共培养.24 h后计算细胞迁移率:立体定向法建立Fisher344大鼠/9L细胞脑胶质瘤模型,2周后经神经行为学、MRI、HE染色证实模型成功后.将5-溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)标记的BMSCs、N1H3T3细胞由颈内动脉进行移植,2周后,Fisher344大鼠灌注固定取脑,免疫组织化学检测BMSCs的趋向迁移规律.结果 体外分离培养的3～6代BMSCs表面标志CD34、CD45阴性而CD29、CD44阳性;BMSCs在体外能够向9L细胞迁移;立体定向法建立Fisher344大鼠/9L细胞脑胶质瘤模型符合胶质瘤的特征:颈内动脉移植的BMSCs也能够向9L细胞胶质瘤趋向迁移,主要分布在肿瘤组织与正常组织的边界.结论 BMSCs在体内、外均能够向脑胶质瘤迁移,颈内动脉移植是一种简单、有效的方法.     

氩氦冷冻治疗9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤疗效观察

目的 研究氩氦冷冻治疗9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤的疗效及预后.方法 Fischer344大鼠胶质瘤模型建立成功后,随机分为空白对照组、手术组、氩氦冷冻组,每组10只.游标卡尺测量并计算肿瘤体积,观察各组大鼠行为及生存期.结果 空白对照组、手术组和氩氦冷冻组大鼠生存时间分别为(78.5±1.1)d、(171.0±10.8)d和(252.8±5.0)d,差异具有统计学意义(P=0.002).氩氦冷冻组肿瘤体积呈逐渐缩小趋势.结论 氩氦冷冻是治疗胶质瘤有效方法,推测可能与瘤细胞破裂,抗原暴露,而刺激机体产生抗肿瘤的抗体有关.     

9L/F344大鼠脑胶质瘤模型的建立

目的建立稳定的9L/F344大鼠脑胶质瘤模型.方法15只近交系雄性F344大鼠,采用立体定向技术,在大鼠右侧额叶尾状核接种1×105个9L细胞,观察大鼠生存状态;接种后第10、20天行MRI检查,观测颅内肿瘤生长情况.大鼠死亡后,取脑制作病理切片,行HE染色后观察肿瘤组织形态,采用免疫组织化学方法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白.结果大鼠接种肿瘤细胞后30 d内全部死亡,平均生存时间(24.4±3.3)d.接种后10 d,MRI增强扫描即可见肿瘤生成;接种后20 d,MRI检查可见接种侧脑组织大片水肿,增强扫描肿瘤显像清晰.脑内均见肿瘤形成,未见肿瘤颅外生长;肿瘤周边界线较明显,但未见包膜;瘤内新生血管丰富,可见出出血、坏死;肿瘤免疫组织化学GFAP和S-100蛋白染色阴性.结论该方法建立的大鼠脑胶质瘤模型稳定可靠,符合恶性胶质肉瘤生物学特性.该模型是理想的脑胶质瘤实验研究材料.     

9L/F344大鼠脑肿瘤干细胞颅内肿瘤模型的建立

目的建立稳定的9L/F344大鼠脑肿瘤干细胞颅内肿瘤模型。方法采用无血清悬浮培养法培养大鼠9L胶质瘤细胞,立体定向法于近交系F344大鼠右侧尾状核分别接种9L胶质瘤细胞和9L肿瘤球细胞,观察大鼠存活状态,免疫组织化学染色检测肿瘤细胞CD133和巢蛋白表达变化。结果 9L胶质瘤细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,形成的悬浮肿瘤细胞球表达CD133和巢蛋白。9L胶质瘤细胞组和9L肿瘤细胞球组大鼠肿瘤均呈浸润性生长、无明显包膜;后者肿瘤内新生血管更丰富,出血性坏死更明显。两组肿瘤细胞均表达CD133和巢蛋白,且组间差异无统计学意义(均P0.05),但9L肿瘤细胞球组细胞更具侵袭性。接种9L肿瘤球细胞的大鼠中位存活期为15 d(95%CI:15.219~15.781),明显短于接种9L胶质瘤细胞大鼠的21 d(95%CI:20.395~21.605;χ2=12.800,P=0.000)。结论 9L/F344大鼠脑肿瘤干细胞颅内肿瘤模型的成功建立,为进一步研究脑肿瘤干细胞提供了实验基础。     

C6细胞热休克蛋白抗原肽复合物提纯及抑瘤作用研究

目的提纯大鼠脑胶质瘤C6细胞热休克蛋白抗原肽复合物(HAC),免疫SD大鼠,观察HAC的抑瘤作用。方法采用免疫亲和层析方法提纯大鼠脑胶质瘤C6细胞HAC,免疫20只大鼠为实验组,以另20只大鼠作为对照组,于免疫后1 w,采用立体定向脑内接种方法,以C6细胞攻击两组大鼠,于肿瘤细胞攻击后第二周,取两组动物外周静脉血,测定外周静脉血淋巴细胞计数,并应用流式细胞仪技术测定外周血中CD3 /CD4 和CD3 /CD8 T淋巴细胞的比例。观察饲养过程中实验动物出现的症状、体征和第四周实验动物存活率。于第四周处死存活动物,取脑组织进行HE染色病理组织学检查,并用免疫组化方法分析脑胶质瘤浸润区T淋巴细胞分布情况。结果实验组大鼠外周血淋巴细胞计数显著高于对照组(P<0.01),CD3 /CD4 和CD3 /CD8 T淋巴细胞的比例实验组均显著高于对照组(P<0.01)。实验组动物症状出现时间显著晚于对照组动物(P<0.01),实验组动物四周末存活率显著高于对照组(P<0.05)。实验组胶质瘤局部浸润的CD3 和CD4 细胞数均显著高于对照组(P<0.01),实验组胶质瘤局部浸润的CD8 细胞数与对照组比较无显著差异(P>0.05),实验组胶质瘤局部浸润T淋巴细胞CD4 /CD8 显著高于对照组(P<0.01)。结论C6细胞中HAC可以诱导大鼠产生对C6细胞的细胞免疫,提高大鼠存活率。     

C6细胞热休克蛋白抗原肽复合物的提纯及抑瘤作用的研究

目的 提纯大鼠脑胶质瘤C6细胞热休克蛋白抗原肽复合物(HAC),免疫SD大鼠,观察HAC的抑瘤作用。方法 采用免疫亲和层析方法提纯大鼠脑胶质瘤C6细胞HAC,免疫20只大鼠为实验组,以另20只大鼠作为对照组,于免疫后1周,采用立体定向脑内接种方法,以C6细胞攻击两组大鼠,于肿瘤细胞攻击后第二周,取两组动物外周静脉血,测定外周静脉血淋巴细胞计数,并应用流式细胞仪技术测定外周血中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞的比例。观察饲养过程中实验动物出现的症状、体征和第四周实验动物存活率。于第四周处死存活动物,取脑组织进行HE染色病理组织学检查,并用免疫组化方法分析脑胶质瘤浸润区T淋巴细胞分布情况。结果 实验组大鼠外周血淋巴细胞计数显著高于对照组(P<0.01),CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞的比例实验组均显著高于对照组(P<0.01)。实验组动物症状出现时间显著晚于对照组动物(P<0.01),实验组动物第四周末存活率显著高于对照组(P<0.05)。实验组胶质瘤局部浸润的CD3+和CD4+细胞数均显著高于对照组(P<0.01),实验组胶质瘤局部浸润的CD8+细胞数与对照组比较无显著差异(P>0.05),实验组胶质瘤局部浸润T淋巴细胞CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.01)。结论 C6细胞中HAC可以诱导大鼠产生对C6细胞的细胞免疫,提高大鼠存活率。     

脑胶质瘤热休克蛋白抗原肽复合物抑瘤作用的研究

目的提纯大鼠脑胶质瘤C6细胞热休克蛋白抗原肽复合物(HAC),免疫大鼠,观察HAC的抑瘤作用。方法采用免疫亲和层析方法提纯鼠脑胶质瘤C6细胞HAC,免疫20只大鼠为实验组,以另20只大鼠作为对照组,于免疫后一周,采用立体定向脑内接种方法,以C6细胞攻击两组大鼠,于肿瘤细胞攻击后第二周,进行外周静脉血淋巴细胞计数,和血清INF、IL-2、TNF的浓度测定,并于正常对照。观察四周后动物的存活率。进行HE染色,并用免疫组化方法分析脑胶质瘤浸润区T淋巴细胞分布情况。结果实验组大鼠外周血淋巴细胞计数和IFN、IL-2、TNF浓度均显著高于对照组(P<0.01)。实验组胶质瘤局部浸润的CD3+和CD4+细胞数均显著高于对照组(P<0.01),CD8+细胞数与对照组比较无显著差异(P>0.05),T淋巴细胞CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.01)。结论C6细胞中HAC可以诱导大鼠产生对C6细胞的细胞免疫,抑制肿瘤生长,提高接种大鼠存活率。     

The 9LLUC/Wistar rat glioma model is not suitable for immunotherapy

The availability of a well-characterized animal brain tumor model will play an important role in identifying treatments for human brain tumors. Wistar rats bearing 9L glioma cells can develop solid, well-circumcised tumors, and may be a useful animal model for the evaluation of various therapeutic approaches for gliosarcomas. In this study, the 9L/Wistar rat glioma model was produced by intracerebral implantation of 9LLUC glioma cells syngenic to Fischer 344 (F344) rats. Bioluminescence imaging showed that tumors progressively grew from day 7 to day 21 in 9LLUC/F344 rats, and tumor regression was found in some 9LLUC/Wistar rats. Hematoxylin-eosin staining verified that intracranial tumors were gliomas. Immunohistochemistry results demonstrated that no CD4- and CD8-positive cells were found in the syngeneic 9LLUC/F344 model. However, many infiltrating CD4- and CD8-positive cells were observed within the tumors of the 9LLUC/Wistar model. Our data suggests that compared with 9L/F344 rats, 9L glioma Wistar rats may not be suitable for evaluating brain glioma immunotherapies, even though the model induced an immune response and exhibited tumor regression.     

9L/Wistar大鼠脑胶质肉瘤模型的建立

目的建立稳定的9L／Wistar大鼠脑胶质肉瘤模型。方法构建稳定表达萤火虫荧光素酶PGL的9L细胞株9L^lvc，采用立体定向手术，在Wistar大鼠右侧尾状核接种DAPI荧光标记的9L^lvc细胞，分别于接种后第7，14，21天通过Xenogen活体动物体内成像系统检测肿瘤的生长情况，并断头取材，观察肿瘤的形态学变化，采用免疫组化的方法检测肿瘤细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白（Vemintin）的表达。结果大鼠接种9L^lvc细胞后成瘤率100％。活体成像显示细胞接种后第7天到第21天肿瘤呈逐渐增大趋势。组织切片结果显示肿瘤与周围脑组织边界较清楚，未见包膜；瘤内新生血管丰富，可见出血。肿瘤组织免疫组织化学GFAP及Vemintin蛋白染色阴性。结论该方法建立的大鼠脑胶质肉瘤模型稳定可靠，符合恶性胶质肉瘤的生物学特征．是理想的脑胶质肉瘤实验研究材料。     

Schmidt Ruppin-D-ASV-induced primary rat brain tumor model for therapeutic screening

It is important to evaluate the therapeutic and side effects of new therapy for malignant brain tumors in an adequate animal model prior to its initial clinical investigation. For decades, neurooncologists have argued for the use of primary, autochthonous tumors rather than transplanted tumors such as C 6 glioma cells and 9 L gliosarcoma cells. But unfortunately, no spontaneous animal astrocytomas are currently available as usable models. So we tried to establish the model of primary, autochthonous avian sarcoma virus-induced rat gliomas for experimental chemotherapy and immunotherapy. The present study was undertaken to determine the incidence and histologic pattern of tumors and the mean survival time of the animal model used. It was found that the intracerebral inoculation of 2 X 10(6) FFU/5 microliter of infectious cell free homogeneous subgroup D Schmidt-Ruppin avian sarcoma virus (SR-D-ASV) into 3-day-old inbred Fischer 344 rats induced small sized tumors in all rats 20 days later. The mean survival time of inoculated rats were 58.7 +/- 12 days. As to the classification of SR-D-ASV induced brain tumors in Fischer rats, astrocytoma was 70.6% (protoplasmic astrocytoma 23.5%, fibrillary astrocytoma 47.1%), sarcoma 17.6%, and mixed astrocytoma and sarcoma 11.8%. In conclusion, this SR-D-ASV induced tumor in the rat fulfilled the following criteria for the desirable animal model: (1) Spontaneously arising. (2) Glial origin. (3) Intraparenchymal growth. (4) Uniformly fatal within reasonable time period. Statistic evaluation of the effects of chemotherapy and immunotherapy was considered to be possible.     

Adenovirus-mediated gene therapy of experimental gliomas

The efficacy of adenovirus (ADV)-mediated gene therapy to treat brain tumors was tested in a syngeneic glioma model. Tumor cells were transduced in situ with a replication-defective ADV carrying the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) gene controlled by the Rous sarcoma virus promoter. Expression of the HSV-tk gene enables the transduced cell to convert the drug ganciclovir to a form that is cytotoxic to dividing cells. Tumors were generated in Fischer 344 rats by stereotaxic implantation of 9L gliosarcoma cells into the caudate nucleus. Eight days later, the tumors were injected either with the ADV carrying the HSV-tk (ADV-tk) gene or a control ADV vector containing the β-galactosidase (ADV-βgal) gene and the rats were treated with either ganciclovir or saline. Tumor size was measured 20 days after implantation of 9L cells or at death. Rats treated with ADV-βgal and ganciclovir or with ADV-tk and saline had large tumors. No tumors were detected in animals treated with ADV-tk and with ganciclovir at doses ≥80mg/kg. An infiltrate of macrophages and lymphocytes at the injection site in animals treated with ADV-tk and ganciclovir indicated an active local immune reaction. In survival studies, all animals treated with ADV-tk and ganciclovir have remained alive longer than 80 and up to 120 days after tumor induction whereas all untreated animals died by 22 days. These results demonstrate that ADV-mediated transfer of HSV-tk to glioma cells in vivo confers sensitivity to ganciclovir, and represents a potential method of treatment of brain tumors. © 1994 Wiley-Liss, Inc.     

凋亡肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞瘤苗治疗大鼠颅内胶质瘤的实验研究

目的观察凋亡肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞(dendriticcell,DC)瘤苗对颅内胶质瘤免疫治疗的效果。方法通过立体定向接种建立Wistar大鼠C6胶质瘤动物模型;从大鼠骨髓分离DC前体细胞,经重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF) 白细胞介素4(rrIL-4)诱导培养、扩增获得功能性DCs;DCs经采用热诱导凋亡的C6胶质瘤细胞体外致敏后皮下回输荷瘤大鼠体内,1次/周,共5次。观察荷瘤大鼠的存活期,MRI观察颅内肿瘤生长情况,循环血中CD8 T淋巴细胞水平及体外细胞毒反应、增殖反应均以流式细胞仪检测。结果经过治疗的荷瘤大鼠生存期明显延长,MRI显示实验组大鼠肿瘤被明显抑制,外周血中CD8 T淋巴细胞比例增加,体外细胞毒试验提示经凋亡肿瘤细胞抗原致敏的DC瘤苗可以诱导针对C6胶质瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞,并且未观察到自身免疫反应的发生。结论经凋亡肿瘤细胞抗原致敏的DC瘤苗对于颅内胶质瘤是一种安全有效的治疗方法。     

立体定向技术建立大鼠脑胶质瘤激光间质热疗模型

目的 利用立体定向技术接种SD大鼠C6脑胶质瘤,并建立脑胶质瘤激光间质热疗(LITT)模型.方法 采用立体定向技术,将体外培养并调制的C6胶质瘤细胞悬液20μl(浓度1×10~(11)/L)接种于SD大鼠右侧尾状核区.分时段MRI检查;做组织病理学和Ⅷ因子相关抗原(FⅧR),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白免疫组化检查.根据MRI扫描监测,校正肿瘤定位,按2～10 W不同功率和热疗时间分组,插入半导体激光光纤进行间质热疗,同时使用ThermaCAM S65型红外热像仪测量肿瘤的中心靶点皮层温度和(或)热电偶仪间质测量靶区周边的深部温度.结果 优化的立体定向接种技术使本组大鼠脑胶质瘤动物模型具有颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移病灶,实验周期短,可重复性好,可插入热疗光纤热疗,组织学上接近人类特征.LITT各组靶区温度高于假手术组(P<0.05);在同一治疗组内中心靶点皮层温度和靶区周边的深部温度之间有近似性,差异无统计学意义(P>0.05).结论 利用立体定向技术可成功建立SD大鼠脑尾状核C6胶质瘤模型,其肿瘤MRI影像及病理特征与人脑胶质瘤相似.红外热像测温技术在大鼠实验性LITT研究中的应用具有可行性,可联合热电偶深部测温技术应用于脑肿瘤LITT治疗.     

大鼠骨髓基质细胞移植治疗胶质瘤的实验研究

目的将Wistar大鼠骨髓基质细胞体外移植入C6胶质瘤大鼠模型,观察其生物学特性及大鼠存活状态。方法建立C6载瘤模型和骨髓基质细胞移植治疗模型;待术后生长至3w和4w时行MRI检测;不同时间段内大鼠脑标本行免疫组化染色。结果骨髓基质细胞移植组模型平均生存时间为4.03w;对照组平均生存时间为3.88w;且其平均肿瘤体积与对照组无明显差异。大鼠体内移植体外培养5月余的骨髓基质细胞未发现肿物生成。骨髓基质细胞包绕在胶质瘤周围,对胶质瘤细胞有定向靶向作用。结论骨髓基质细胞对胶质瘤有定向靶向作用,可以安全的作为生物载体转染目的基因治疗胶质瘤。