牵张应力对小儿体外骨髓间充质干细胞向成骨、成脂肪分化的相关性研究

目的 探讨周期性机械应力对小儿骨髓问充质干细胞(MSCs)分化方向的影响.方法 利用自行建立的机械牵张应力装置,对体外MSCs加载力学信号,并复合成脂肪诱导剂,选用化学染色、RT-PRC、免疫组化、Western Blot的方法检测MSCs干预后成骨指标(OC、BMP-2、I型胶原)和成脂肪分化的指标(PPART-2、脂滴).结果 MSCS受力后,细胞OC mRNA表达较对照组明显增高,而且与干预时间相关;干预7 d后,细胞内BMP-2、I型胶原蛋白表达较对照组明显增强;MSCs在成脂肪诱导过程中,接受应力后细胞脂滴的出现和PPARy-2 mRNA的表达均明显下降.结论 适当的应力促进MSCs向成骨方向分化,抑制其向脂肪方向分化.     

小骨髓间充质干细胞的培养及多向分化潜能的研究

目的研究小儿骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性及多向分化能力,为小儿MSCs的临床应用提供实验依据。方法经Percoll梯度分离接种获得小儿MSCs,观察其形态、排列分布情况,用MTT法检测细胞增殖情况,并绘制生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期,诱导剂干预细胞,观察细胞的成骨、成脂肪、成神经等多向分化能力。结果小儿MSCs贴壁容易,呈细长梭形,增殖能力强,融合后旋涡状分布。MSCs分别经各诱导剂诱导后,细胞形态均发生相应的变化,用化学染色、PCR、免疫细胞染色等方法检测成骨标志物（碱性磷酸酶、骨钙素mRNA、钙结节）、脂肪标志物（脂滴、PPARγ-2mRNA）、以及类神经标志物（尼克氏体、NSE、NF-200）有明显的阳性。结论小儿MSCs能稳定增殖、传代,具有成骨、成脂肪、成神经等多方向的定向分化潜能,可以作为多方面组织工程的种子细胞。     

体外直接共培养兔肾血管内皮细胞和成骨细胞

目的观察兔肾血管内皮细胞（renal vascular endothelia cells，RVECs）和兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，RMSCs）诱导的成骨细胞（osteoblasts，OB）直接共培养是否具有良好的细胞相容性，探索二者共培养的合适比例。方法抽取兔骨髓，离心法获取RMSCs，经条件培养基获得OB并鉴定；取兔双肾行三步梯度筛网法获得RVECs并鉴定。二种细胞按OB与RⅥ1Cs3：1、2：1及1：1比例直接共培养及各自单独培养，倒置显微镜及Masson染色观察生长情况，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色观察细胞增殖分化能力。结果共培养细胞增殖快于单一细胞，OB与RVECs2：1比例培养优于3：1和1：1，增殖最快。从OB的ALP染色阳性率看，和RVECs共培养的OB染色阳性率比单纯OB高，OB与RVECs2：1比例培养的阳性率最高，表明RVECs能显著增强OB的ALP活性。结论RVECs和RMSCs诱导的OB体外直接共培养具有良好的细胞相容性，可促进OB的增殖分化，促进其ALP的分泌，提高OB的成骨能力。二者按OB与RVECs2：1混合培养是较佳比例。     

小儿骨髓间充质干细胞的培养及多向分化潜能的研究

目的研究小儿骨髓间充质干细胞(MSCs)的生物学特性及多向分化能力,为小儿MSCs的临床应用提供实验依据。方法经Percoll梯度分离接种获得小儿MSCs,观察其形态、排列分布情况,用MTT法检测细胞增殖情况,并绘制生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期,诱导剂干预细胞,观察细胞的成骨、成脂肪、成神经等多向分化能力。结果小儿MSCs贴壁容易,呈细长梭形,增殖能力强,融合后旋涡状分布。MSCs分别经各诱导剂诱导后,细胞形态均发生相应的变化,用化学染色、PCR、免疫细胞染色等方法检测成骨标志物(碱性磷酸酶、骨钙素mRNA、钙结节)、脂肪标志物(脂滴、PPARγ-2mRNA)、以及类神经标志物(尼克氏体、NSE、NF-200)有明显的阳性。结论小儿MSCs能稳定增殖、传代,具有成骨、成脂肪、成神经等多方向的定向分化潜能,可以作为多方面组织工程的种子细胞。     

牵张应力对小儿体外骨髓间充质干细胞内钙离子的影响

目的观察牵张应力对小儿体外骨髓间充质干细胞(HMSCs)内钙离子的影响。方法分离并培养小儿骨髓间充质干细胞,利用体外装置对第3～6代细胞加载牵张应力,在细胞受力前加入钙离子拮抗剂(维拉帕米,20μmol/L)预处理30 min,用fluo-4/AM荧光标记,检测不同时间刺激后细胞内游离钙离子的荧光值。结果应力干预MSCs后,受力1 min组细胞内钙离子浓度即升高,荧光强度是对照组的164.63%,干预3 min组、5 min组升高更明显,干预10 min组钙离子升高幅度有下降趋势:应力干预前加入钙离子拮抗剂维拉帕米进行预处理,各组细胞内钙离子升高程度减轻。结论MSCs受牵张应力刺激后,细胞内钙离子浓度发生明显变化,维拉帕米起部分阻断作用。     

体外小儿骨髓间充质干细胞对牵张应力早期应答反应的研究

目的 观察体外小儿骨髓间充质干细胞(MSCs)对周期性牵张应力的早期应答反应.方法 分离并培养小儿MSCs,利用体外细胞牵张应力装置对第三～六代细胞加载短期力学信号,检测各组细胞内Oa2+以及早期反应基因蛋白(c-fos、c-jun和c-myc)的表达情况.结果 应力干预MSCs后,细胞内Ca3+浓度在受力1min后即增高,荧光强度是对照组的164.63%,3、5min升高更明显,干预10 min后Ca2+浓度升高的幅度有下降趋势;c-fos、c-jun和c-myc基因蛋白在未受力组细胞内不表达或微量表达,加载力学信号后,表达发生了明显的变化,随时间的延长,均表现为增强-持续-回复原来水平.结论 周期性牵张应力影响MSCs内Ca2+的浓度及早期反应基因蛋白(c-fos、c-jun和c-myc)的表达,推测c-fos、c-jun和c-myc参与了MSCs响应力学的信号传导途径,可能依赖Ca2+通道的活化来调控.     

再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞免疫调节特性和造血支持作用的研究

目的研究再生障碍性贫血(AA)患儿骨髓间充质干细胞(MSCs)的免疫调节特性和支持造血的功能。方法从AA患儿和成人骨髓中分离、培养、扩增MSCs,用流式细胞仪测定免疫标记;用3H-TdR法检测PHA刺激后,正常淋巴细胞转化以及MSCs对转化的影响;用造血祖细胞集落培养法(CFU-c)检测MSCs对造血的支持作用。结果从AA患儿骨髓中分离得到了MSCs,与正常骨髓MSCs具有相似的细胞形态和表面标志,但其增殖能力低于正常骨髓MSCs。AA-MSCs体外可抑制脐血淋巴细胞的转化,其抑制能力随细胞数量增加而增强,但与正常骨髓MSCs相比,抑制作用较弱。AA-MSCs体外可以支持脐血造血细胞的生长,但其支持能力只有正常骨髓MSCs的一半。结论AA-MSCs与正常MSCs虽体外生长形态相似,但传代能力、免疫抑制力及对造血集落生长的支持作用均较正常骨髓MSCs减低,提示间充质干细胞参与再生障碍性贫血的发病机制。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞具有自我更新，分化增殖和多向分化潜能的特点，在体外通过化学物质5－氮胞苷的诱导作用，可分化为心肌样细胞；在体内通过干细胞因子和粒细胞集落刺激因子等作用，也可动员骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞，能有效改善心功能，具有广阔的临床应用前景。     

骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑损伤的基础研究与应用前景

近年研究发现骨髓间充质干细胞（BM—MSCs）在体外适当的诱导条件下可分化为具有成熟神经元功能的神经细胞，移植到脑损伤模型体内后能明显改善神经功能。本文就BM—MSCs诱导分化为神经细胞的基础研究及其在缺血性脑损伤治疗中的应用作一综述。     

外周血多潜能间充质干细胞的研究进展

外周血中存在着少量的多潜能间充质干细胞.它们具有类似骨髓间充质干细胞的生物学特性,可以自我增殖,能多向分化.在体外诱导和体内町以分化形成中胚层及其他胚层组织.目前人们还不清楚外周血间充质干细胞的起源和去向,但推测它们的存在可能跟骨髓多潜能间充质干细胞的系统迁移及造血形成细胞-间充质细胞共同前体的存在等相关.     

Anti-miR153对HEK293细胞增殖、凋亡和周期影响的实验研究

目的 在既往通过microRNA芯片和生物学信息技术,已筛查出miR153的基础上,进一步探讨其对HEK293细胞(人胚胎肾细胞,Human Embryonic Kidney 293 cells)增殖和凋亡的影响.方法 通过脂质体转染anti-miR153进入HEK293细胞以降低miR153的表达.采用realtime PCR的方法检测转染前后miR153在HEK293细胞中的表达变化;记录转染后细胞数量和形态学的变化.描制转染后HEK293细胞的生长曲线.流式细胞仪检测转染后细胞死亡和细胞周期的改变.结果 ①miR153在HEK293细胞中有表达;②在anti-miR153组中,HEK293细胞的miR153的表达明显低于阴性对照组,基因敲低率达80.5%～84.3%,证实转染的有效性;③anti-miR153组中细胞的生长明显低于阴性对照组,转染后24 h起增殖活性受到抑制,在48 h达到抑制高峰,较阴性对照组降低38.3%;④anti-miR153组中细胞离散,变圆,失去突触,容易脱壁,可见坏死漂浮的细胞;⑤流式细胞仪检测,anti-miR153组的细胞死亡和凋亡均增加(9.39%),明显高于阴性对照组(0.7%).细胞周期的检测,发现在anti-miR153组中G2/M期消失,更多的细胞进入了G0/G1期.结论 针对miR153的anti-miR的转染可以显著影响HEK293细胞的功能,包括细胞坏死、凋亡,停止生长,进入G0/G1期.Anti-miR153代表了一种新的肿瘤治疗方式,但还需要更多的进一步研究.     

脂蛋白(a)对体外培养的人系膜细胞增殖、移行、黏附的影响

目的　观察不同浓度脂蛋白 (a) [Lp(a) ]对体外培养的人系膜细胞 (HMC)增殖、黏附和移行的影响。以研究Lp(a)在肾损伤时HMC异常增殖过程中所起的作用。 方法　用 5 μg、10 μg、2 5μg、5 0 μg /ml浓度的Lp(a)刺激HMC增殖 2 4h ,采用3 H TdR掺入法检测Lp(a)对HMC增殖的影响。用间接免疫荧光法检测Lp(a)对HMC上黏附蛋白表达的影响。以倒置相差显微镜观察Lp(a)对HMC移行性的影响。结果　随着Lp(a)浓度的升高 ,3 H TdR掺入值 (× 10 3 cpm)分别为 :1 6 9±0 4 8、3 5 9± 0 6 8、4 14± 0 78、4 0 5± 0 5 5 ,对照组 1 6 4± 0 31,Lp(a)浓度达 10 μg时与对照组比较差异有显著意义 (P <0 0 1)。以 10 μg/mlLp(a)刺激HMC 2 4h后 ,HMC上黏附蛋白表达阳性 ,对照组为阴性。Lp(a)浓度为 10 μg /ml刺激HMC 72h可显著引起HMC的移行 (实验组 16 2个 /低倍视野 ,对照组 2 4个 /低倍视野 ,P <0 0 1)。结论　Lp(a)可对HMC的增殖、黏附和移行产生显著影响。     

脐血CD3AK细胞培养上清液对白血病细胞株HL-60细胞的影响

目的在体外实验中,研究脐血CD3AK细胞培养上清液（cord blood CD3AK supematant,CS）对HL-60细胞增殖、分化和凋亡的影响。方法以不同浓度的CS（10％CS、15％CS、20％CS）作用于不同时间（3d,6d和9d）的HL-60细胞为实验对象,应用细胞计数法结合锥虫蓝拒染法研究CS诱导的HL-60增殖情况。应用流式细胞仪分析CS作用前后细胞周期及细胞表面分化标志CD11b的变化,光学显微镜下观察细胞形态变化,氯化硝基唑蓝（NBT）还原实验研究细胞的NBT还原阳性百分率,从而研究HL-60细胞的分化。应用电子显微镜观察细胞凋亡,原位末端标记法研究CS作用前后HL-60细胞的凋亡变化。结果随CS作用时间的延长和剂量的增加,细胞增殖速度逐渐减慢。细胞周期分析显示,CS作用后G0期和G1期显著增多,S期显著减少,G2期和M期无明显变化,说明CS使细胞阻滞在G0和G1期。随CS作用时间的延长,细胞体积逐渐增大,3d后被诱导的细胞表面开始表达分化标志物CDm并出现细胞核型变化,NBT阳性细胞增多,随cs浓度的增加和作用时间的延长,这些变化越明显。20％CS诱导72h后,被诱导的细胞出现凋亡,随诱导时间延长,凋亡细胞增多。结论CS能抑制HL-60细胞的增殖,诱导HL-60细胞分化和凋亡。     

ATRA诱导神经母细胞瘤细胞分化及TrkA表达的研究

目的 观察全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)体外对神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)细胞增殖的抑制和可能的分子机制及NGF-TrkA信号传导途径在NB细胞分化中的作用。方法 取本院住院2岁男性NB患儿新鲜手术标本，进行原代细胞培养，并对培养细胞进行分离与纯化，建立细胞系，作为细胞模型。通过台盼蓝拒染法计数活细胞；观察ATRA干预前后细胞形态学变化；RT-PCR分析TrkA表达情况。结果 ATRA作用NB细胞后，细胞形态发生显著变化，并可抑制细胞增殖，2d时TrkA表达增加，4d时出现TrkA表达的明显增加。结论 所建立的NB细胞系为可诱导分化型，即N型；≥5μmol／L，ATRA对NB细胞体外增殖有抑制作用并诱导其分化且表现剂量依赖关系；ATRA可诱导NB细胞分化成熟及TrkA mRNA表达水平增高，可能是ATRA体外诱导NB细胞分化逆转的分子生物学机制之一.     

阿糖胞苷及蟾蜍灵对HL-60细胞增殖抑制和诱导凋亡的研究

目的探讨阿糖胞苷(Ara-C)及蟾蜍灵对人白血病细胞株HL-60的作用及影响机制,验证两种药物治疗血液肿瘤的优越性。方法在体外设定的浓度梯度和作用时间下应用Ara-C及蟾蜍灵,采用原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡率,以流式细胞术分析细胞凋亡,以噻唑蓝抑制实验(MTT比色法)观察上述两种物质对细胞的抑制作用。结果(1)蟾蜍灵明显抑制细胞分裂增殖,其半数抑制浓度约为0.03μmol/L,随蟾蜍灵浓度增加诱导细胞凋亡时间缩短,程度增加;(2)Ara-C抑制细胞分裂增殖,其半数抑制浓度约为2.4μmol/L,随浓度增加诱导细胞凋亡时间缩短,程度增加;(3)蟾蜍灵联合Ara-C则抗增殖作用增强80%以上,凋亡率比单用Ara-C增加近30%。结论Ara-C对细胞的诱导凋亡作用主要作用于sub-G1期,在蟾蜍灵联合作用下其作用增强,可为临床治疗应用提供理论参考。     

人间充质干细胞体外扩增及生物学特性的研究

目的探讨成人骨髓、胎儿骨髓和人脐血3种不同来源的人类间充质干细胞(MSC)体外扩增及其生物学特性.方法观察3种来源的MSC的生长、增殖和表面标志的表达,从而评价MSC的纯化、增殖能力及其免疫学特性.结果 (1)3种不同来源的人MSC的细胞形态、集落数、集落大小均无差异;但成人骨髓MSC在集落形成及集落交错融合时间上均早于胎儿骨髓和脐血MSC; (2) 3种来源的人MSC传代培养增殖速度无差异,但脐血和胎儿MSC融合后无接触抑制,而成人骨髓MSC存在接触抑制; (3) 来源于骨髓单个核细胞(MNC)8×106或脐血MSC 25×106的MSC,经体外扩增3代、5代和10代后,细胞数分别为107、108和1010个; (4)MSC易纯化,P2代细胞均一性为90%,P3代细胞均一性为95%,P5代细胞均一性达到99%;(5) 不同来源的MSC表面重要标志CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166表达均为阳性,其造血细胞表面标志CD11a、CD14、CD33、CD34、CD28、CD45、CD117表达均为阴性,与移植免疫排斥发生密切相关的表面标志HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40和CD40L均为阴性.3种不同来源的人MSC表面标志,差异无显著性.(6) 两种不同培养体系对人MSC的纯化扩增及生物学特性无影响.结论 (1)不同来源的人MSC生物学特性无明显差异;(2) 人MSC在体外易扩增纯化,增殖能力强,符合临床组织工程的需要;(3) 人MSC不表达造血细胞及与移植免疫排斥发生密切相关的表面标志,有可能突破HLA屏障,广泛应用于临床.     

Ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响及相关机制探讨

目的：探讨ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响及作用机制。方法：体外培养3T3-L1前脂肪细胞,MTT法检测不同浓度ghrelin对其增殖活力的影响,半定量RT-PCR检测ghrelin对c-myc和胸苷激酶mRNA表达水平的影响;同时在利用胰岛素或ghrelin诱导分化的不同时段,通过油红O染色测定细胞分化程度,半定量RT-PCR检测过氧化物体增殖剂活化受体γ（PPARγ）、CAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）mRNA的表达。结果：10-7~10-15 mol/L ghrelin作用24 h明显促进前脂肪细胞增殖,ghrelin组c-myc和胸苷激酶mRNA表达水平明显升高,与对照组相比差异均有显著性意义（P<0.05）。Ghrelin干预后,可诱导前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的形态转变,但诱导分化率仍少于胰岛素;同时其PPARγ和C/EBPα mRNA表达水平较对照组明显升高（P<0.05）,ghrelin组和胰岛素组PPARγ和C/EBPα mRNA表达量随着分化时间的延长而增加,分化8 d与2 d相比,差异均有显著性意义（P<0.01）。结论：Ghrelin明显促进3T3-L1前脂肪细胞增殖与分化。Ghrelin可能通过增加c-myc的含量,进而引起胸苷激酶的活化,从而导致细胞周期的激活,促进细胞增殖;同时ghrelin可能通过增加PPAR-γ、C/EBP-α mRNA的表达,促进细胞分化,从而提高脂肪细胞对胰岛素的敏感性。［中国当代儿科杂志,2009,11（1）：69-73］     

熊果酸对神经母细胞瘤细胞增殖凋亡及MYCN表达的影响

目的实验研究熊果酸作用于体外培养的神经母细胞瘤细胞株（SH—SY-5Y）,对肿瘤细胞增殖、凋亡及MYCN基因mRNA表达的影响,探讨熊果酸对儿童神经母细胞瘤的治疗的作用。方法以终浓度为4uM／L、8uM／L、12uM／L的熊果酸作用于神经母细胞瘤细胞SH—SY-5Y,WST-1法检测SH—SY-5Y细胞增殖情况,流式细胞术检测SH—SY-5Y细胞凋亡情况,采用RealtimePCR方法检测MYCNmRNA的表达情况。结果熊果酸对SH—SY-5Y细胞增殖的抑制呈明显的剂量、时间依赖性,随剂量的增加,作用时间的延长,抑制效果逐渐加强;熊果酸对SHSY-5Y细胞凋亡的促进呈明显的剂量依赖性,随剂量的增加,促进凋亡效果逐渐加强;熊果酸对SH—SY-5Y细胞MYCN表达有抑制作用并有明显的剂量依赖性,随剂量的增加,抑制效果逐渐加强。12uM／L作用72h后神经母细胞瘤细胞增殖抑制效率达98．3％,MYCN基因mRNA表达抑制率达52．37％。结论应用熊果酸在体外环境作用SH—SY-5Y细胞,可以有效抑制该细胞的增殖、促进细胞凋亡、抑制原癌基因MYCNmRNA的表达。     

大鼠脂肪组织来源的干细胞向成骨方向诱导分化的初步研究

目的探索大鼠脂肪组织来源的干细胞的分离、培养的方法，以及在特定条件下向成骨细胞分化，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法取4周龄SD大鼠附睾处脂肪，成骨诱导培养基培养，组织化学、免疫细胞化学染色以及组织学定量检测其分化情况。结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪组织来源的干细胞，能稳定增殖传代，CD44、波形蛋白免疫组化染色阳性，证明其中胚层来源。在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下，脂肪组织来源干细胞的碱性磷酸酶活性增高，出现钙结节，四环素荧光染色阳性证实有新骨形成。碱性磷酸酶定量和钙定量随诱导时间延长表达增加。结论从脂肪组织中可获得具有多向分化潜能的干细胞，并能在体外稳定增殖传代，经诱导后可分化为成骨细胞，有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。     

色素上皮衍生因子在神经母细胞肿瘤中的表达及促分化作用的研究

目的观察色素上皮衍生因子（PEDF）在神经母细胞肿瘤中的表达情况及在分化中的作用。方法采用免疫组织化学方法对23例神经母细胞瘤（NB）、17例节细胞神经母细胞瘤（GNB）、18例节细胞神经瘤（GN）的标本进行PEDF免疫染色分析，每张切片采用显微数字分析系统进行定量，统计指标为免疫染色评分（immunostaining score，ISS），ISS=阳性染色面积×阳性染色面积的平均光密度／整个视野面积。进一步采用Western印迹对4例NB、3例GNB进行PEDF定量分析。以β-actin为内参照，统计指标为PEDF／Actin比值。NB、GNB和GN中PEDF表达差异性的比较采用Kruskal—Wallis法和Nemenyi法检验；采用Spearman等级相关进行PEDF表达强度与神经母细胞肿瘤成熟程度相关性分析。NB和GNB中的PEDF／β-actin比值比较采用t检验。结果免疫组织化学显示随着NB向GNB发育过程中，PEDF的表达量逐渐增加（P=0．000），PEDF的表达强度与神经母细胞肿瘤的成熟程度呈正相关（rs=0．889，P=0．000）。GNB中PEDF／Actin的比值较NB中高（P=0．045）。结论PEDF可能为神经母细胞肿瘤内源性促分化因子，诱导原始神经母细胞向成熟的节细胞分化，可应用于消灭微小残留灶的维持治疗中，前景令人鼓舞。