应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ结合蛋白

目的 通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅱ(SPⅡ)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体展示技术,以HBV的表面抗原基因启动子Ⅱ的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析。结果 噬菌体经富集后,从随机筛选的20个克隆中得到4个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性分析,确定了和HBV SPⅡ结合的肝细胞蛋白——尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4(NADHDH4)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HBV SPⅡ的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因,为进一步研究HBV的复制、转录、调节机制开辟了新的徐径。     

应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白

目的 通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(core promoter)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体表面展示技术,以HBV核心启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果 噬菌体经富集后,从随机筛选的20个克隆中得到6个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV核心启动子结合的肝细胞蛋白——羧肽酶N(CPN)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBV核心启动子的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因,为进一步研究HBV的复制机制创造了新的途径。     

应用噬菌体展示技术筛选细胞周期素B2启动子DNA的结合蛋白

目的筛选细胞周期素B2（cyclin B2）启动子DNA结合蛋白,探索cyclin B2的表达调节机制.方法应用噬菌体展示技术,以cyclin B2启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索.结果噬菌体经富集后,筛选出20个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和cyclin B2启动子特异结合的肝细胞蛋白,共编码6种已知蛋白.结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到cyclin B2启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究cyclin B2基因的转录调节机制奠定了基础.     

噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒X抗原基因启动子DNA结合蛋白

目的筛选乙型肝炎病毒（HBV）X抗原基因启动子（Xp）DNA结合蛋白，为HBV复制机制研究探索新的途径。方法应用噬菌体展示技术，以HBV-Xp的PCR产物DNA作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选，经噬斑的PCR扩增后，构建克隆载体，最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果噬菌体经富集后，从随机筛选的30个克隆中得到17个阳性克隆，成功构建了克隆载体。经测序分析及序列比对，最后得到5种已知基因编码蛋白（人血白蛋白、还原型烟酰胺二核甘酸脱氢酶亚型4、激肽酶原、泛素特异性蛋白酶10、睾丸增强因子转录子）和9种未知功能基因序列。结论从噬菌体人肝cDNA文库筛选得到多种具有不同生物学功能的蛋白，与HBVX抗原基因启动子具有结合作用。     

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白－蛋白的结合是丙型肝炎病毒（HCV）与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白5A（NS5A）被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子，参与HCV的复制、转录和信号传导等过程，但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系，作者采用酵母双杂交系统3，在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选，得到35个与NS5A特异性结合的阳性克隆，包括载脂蛋白、线粒体单体型基因，磷脂酸酸性磷酸酶等11种已知功能蛋白质基因和3个未知功能基因。本研究结果为阐明NS5A在HCV致病中的作用提供了重要研究线索。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37基因的克隆化研究

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合，涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因，命名为NS5ABP37，根据GenBank数据库推定蛋白编码序列的信息，应用反转录聚合酶链反应(PCR)扩增出该基因序列。连接人酵母和真核细胞表达载体表达成功，并经回交实验证实NS5A与NS5ABP37的结合作用，为进一步研究奠定基础。     

丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为探索新型治疗方法，制备抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗HCV NS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板，应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，随机挑选82个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定，获得与HCV NS4A单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV NS4A特异性抗－Id scFv的编码基因进行序列测定分析。结果：经过筛选82个克隆中有40株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应，确定其中有7株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆。提取质粒，进行DNA序列测定，DNA为789bp。本实验结果提示，用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCV NS4A的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件。     

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原,利用抗原抗体亲和性结合的原理,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体;用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原,与正常肝细胞无交叉反应。结论此法制备单链抗体方法简便,周期短,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。     

酵母双杂交技术筛选克隆丙型肝炎病毒NS3结合蛋白基因

为克隆与丙型肝炎病毒（HCV）NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因，采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选。构建HCV NS3蛋白诱饵酵母质粒，转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。选择既能在4重营养缺陷培养基（SD／－Trp-Leu-Ade-His)上生长，又能在涂有X－α－半乳糖（X－α－gal）的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落，提取此酵母克隆的质粒，转化大肠杆菌后进行测序，并进行生物信息学分析。分析的结果显示，筛选出19个阳性克隆，包括已知功能基因17个，还有1个克隆的测序结果与GenBank中的1个未知功能序列有44％的同源性，初步证明了此基因与HCV NS3有结合活性。说明成功克隆了HCV NS3蛋白结合蛋白基因，为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

重组丙型肝炎病毒表位抗原的研究

目的：研究丙型肝炎病毒（HCV）表位抗原,以满足丙肝抗体确认试剂研究的需要,方法;构建原核融合表达载体pBVIL1,精选HCV不同区抗原,C区,NS3,NS4和NS5的主要抗原表位,用PCR方法从不同HCV抗原表达质粒中扩增出相应抗原表位,构建pBVIL1表达质粒,并在HB101受体菌中表达,纯的单片段抗原经包被测定板和用间接ELISA法对阴性及阳性血清测定其活性,结果与结论：所克隆的单片段抗原均在表达载体pBVIL1中获得高效表达,单片段抗原纯品用卫生部的Ｐanel测定,所得结果和进口Ｏrtho公司ＲＩＢＡ３．０结果进行比较,其中Ｃ和ＮＳ４抗原活性略高于ＲＩＢＡ３．０中的相应抗原,ＮＳ３抗原活性则略低于ＲＩＢＡ３．０中的c33cr抗原,但对４０份阳性血清的总评价和ＲＩＢＡ３．０完全一致,表明目前抗原已可满足要求。     

Higher detection rate of hepatitis G and C virus RNA in liver tissue than in serum of deceased injection drug users

To examine the prevalence of hepatitis G virus (HGV) and hepatitis C virus (HCV) infections in deceased injection drug users and for comparison of the detection rates of HGV and HCV RNA in liver tissue with detection rates in postmortem serum samples, RT-PCR was performed in 50 drug abuse-related fatalities. HGV RNA was detectable in liver tissue samples from 17/50 suddenly deceased drug abusers (34%). In 16 of these 17 positive cases, serum samples were also available but HGV RNA was detected in only 10. From 29/50 anti-HCV positive individuals, HCV RNA was detected in 23/50 liver tissue samples (46%), but HCV RNA was detectable in only 6/22 of the corresponding serum samples. In 12 anti-HCV positive cases (10 being also positive for HCV RNA in the liver), the examinations revealed a coinfection with HGV by detection of HGV RNA in the liver tissue samples. A significant association between the detection of HCV RNA in the liver and the occurrence of antibodies against the HCV NS4 protein, but not against HCV core antigen or NS3 protein was observed. The probability of anti-HCV and HCV RNA positivity increased with the age of the individuals. No HGV or HCV infection was detected in a control group of 50 persons who died suddenly by violent impact. The prevalence of active HCV and HGV infections in injection drug users detected by RT-PCR in liver tissue is in good accordance with data obtained from sera from living injection drug users. In contrast, the detection rate in postmortem serum samples was clearly lower. Possible reasons for this observation are discussed and the use of liver tissue for postmortem detection of hepatitis virus RNA is recommended. Received: 4 February 1998 / Received in revised form: 22 April 1998     

登革病毒的感染及复制研究进展

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属,是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒。其包膜蛋白E与细胞受体的结合介导病毒进入细胞,随后在感染细胞浆内复制。随着对非结构蛋白的深入研究,发现NS1、NS2A、NS3、NS4A及NS5蛋白均参与了病毒复制合体的形成,在成熟病毒颗粒的最终形成过程中,需要NS2B／NS3蛋白酶对C蛋白前体的切割及缩主细胞的糖基转移酶对prM、E蛋白糖侧链的正确加工。本文综述了登革病毒受体、病毒的复制及装配过程等方面的最新研究进展。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒 X蛋白协同反式激活作用的研究

构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）的重组表达质粒pcDNA3.1(－）-NS3和表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(－）-X，分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，用免疫印记（Western blotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT 3-promoter共转染HepG2细胞，检测报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达水平，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子功能的影响。结果显示，两个重组表达载体pcDNA3.1(－）-NS3及pcDNA3.1（－）-X在HepG2细胞均以瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白；单独共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3.1(－）-X组的CAT的表达分别是对照的3．6倍和4．4倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照的8．5倍；表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明，HepG2细胞中表达的HCV NS3蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。