重组腺病毒Ad-huVEGF121的制备

目的：构建能够用于骨缺血研究的能表达huVEGF121的重组腺病毒载体。方法：将huVEGF121克隆至穿梭质粒，线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，通过观察绿色荧光监测病毒产生，免疫组化检测VEGF121表达。结果：成功的将hu—VEGF121克隆至穿梭质粒pTrack—CMV，正确构建了重组腺病毒质粒，感染293细胞得到大量病毒。结论：成功构建了huVEGF121重组腺病毒，为缺血性骨病的进一步研究奠定了基础。     

人β防御素2腺病毒表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建和鉴定人β防御素2（HBD2）的重组腺病毒表达载体，并观察其转染大鼠真皮多能干细胞（dMSCs）后的表达。方法反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增HBD2全长cDNA，亚克隆至穿梭质粒（pAdTrack-CMV）中，然后转化含骨架质粒（pAdEasy-1）的大肠杆菌BJ5183，通过同源重组产生腺病毒载体质粒。PacⅠ酶切阳性的重组质粒后转染293细胞，包装出重组病毒载体。用所得重组腺病毒感染dMSCs细胞，并采用RT-PCR和荧光免疫组织化学检测其在dMSCs中的表达情况。结果 经测序、酶切及聚合酶链反应（PCR）鉴定，表明已成功地扩增到HBD2全长cDNA，并将其顺序克隆到穿梭质粒和骨架质粒中，进而组装出腺病毒表达载体。经RT-PCR和免疫组织化学证实构建的病毒载体可感染dMSCs，并有效表达HBD2。结论 本实验成功地构建了含HBD2基因的腺病毒表达载体，并证实其可在dMSCs中表达。     

人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆人pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的 片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中.将构建止确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用Pme Ⅰ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒.观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒.结果 RT-PCR扩增得到的目的 基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒.结论 成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础.     

人CD40L胞外区和人CTLA4Ig双基因共表达腺病毒载体的克隆和鉴定

目的：构建人CD40L胞外区和CTLA4Ig双基因共表达重组腺病毒载体并鉴定。方法：RT-PCR扩增人CD40L胞外区片段，与致瘤素信号肽连接后构建穿梭质粒，经酶切、插入、同源重组，获质粒pAdshCD40L-IRES2-CTLA4Ig，经293细胞包装，获共表达双基因的腺病毒pAdvshCD40L-IRES2-CTLAg，并行凝胶电泳、PCR、共聚焦显微镜检测。结果：电泳、PCR扩增出了600bp和400bp的特异性片段、共聚焦显微镜观察到CD40L绿色荧光和CTLA4Ig红色荧光的共表达。结论：成功构建了人CD40L．胞外区和CTLA4Ig共表达双基因重组腺病毒载体。     

人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源干细胞并表达蛋白。方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段。将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV。插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株。用PCR及多种酶切方法鉴定重组体。最终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装。BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化。Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源干细胞后BMP12的蛋白表达。结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段。酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功。GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒。该重组病毒可成功感染脂肪来源组织干细胞并表达BMP12蛋白。结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究。     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

含人血红素氧化酶-1重组11P型腺病毒的构建及体外表达

目的构建含人血红素氧化酶-1重组11P型腺病毒,并使之转染人BJ细胞,测定其转染效率及目的蛋白表达情况。方法PCR目的基因序列,克隆成穿梭载体后转化大肠杆菌,扩增提取质粒,鉴定正确后与骨架载体重组,鉴定重组质粒正确并无野毒后在293细胞中扩增,CsCl密度梯度离心法纯化腺病毒。按不同梯度MOI值感染成纤维细胞,根据绿色荧光强度检测其转染效率。1周后用免疫组化方法检测目的蛋白HO-1表达情况。结果对重组腺病毒进行酶切和PCR鉴定,证实含人血红素氧化酶-1(HO-1)的11P型重组腺病毒构建成功,纯化后病毒滴度达到1.0×1010pfu/ml。通过免疫组化检测可在成纤维细胞中观察到胞浆内有棕褐色目的蛋白阳性颗粒表达。结论可以成功构建含人血红素氧化酶-1(HO-1)的11P型重组腺病毒并表达目的蛋白。     

人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建表达人凝血因子Ⅶ（FⅦ）的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ（rhFⅦ）。方法利用BamHⅠ和EcoR Ⅴ双酶切pcDNA 3．1－FⅦ载体得到FⅦ基因片段,补平后,插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白（ GFP）表达盒的pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体,构建pAdTrack－CMV－FⅦ,继而进行酶切和测序鉴定;经PmeⅠ单酶切线性化后,pAdTrack－CMV－FⅦ在BJ5183感受态菌内与pAdEasy－1腺病毒骨架发生同源重组,构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒pAd－FⅦ;经PacⅠ酶切后的pAd－FⅦ,使用PEI试剂转染293 A细胞,包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad－FⅦ;利用Western 印迹检测重组腺病毒Ad－FⅦ介导293 A细胞表达FⅦ的蛋白水平;通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果经酶切和测序鉴定,FⅦ克隆到pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体中,获得重组质粒pAdTrack－CMV－FⅦ;将其与pAdEasy－1在细菌内发生同源重组,成功获得FⅦ重组腺病毒质粒pAd－FⅦ;在293A细胞内包装重组腺病毒,Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论成功构建重组腺病毒Ad－FⅦ,并实现了rhFⅦ在哺乳动物细胞中的表达,为利用哺乳动物细胞表达rhFⅦ的研究奠定了基础。     

人Survivin基因重组腺病毒载体的构建及其表达

目的　构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础。方法　自行设计一对分别含有KpnⅠ和XholⅠ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV,获得重组质粒pAdTrack CMV Survivin。通过KpnⅠ和XholⅠ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy 1 的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达。结果　成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1 65×108pfu/L。Western blot检测可见16 5kD的Survivin蛋白表达。结论　该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础。     

重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

重组人sIL-2Rα在HEK293细胞中的分泌性表达与鉴定

目的在HEK293细胞瞬时表达带有组氨酸标签的重组人sIL-2Rα的胞外功能区片段,并进行纯化与鉴定。方法对GenBank中IL-2Rα膜外区基因序列进行优化,并在3′端融合组氨酸标签序列的基因,人工合成该基因并将其克隆到表达载体pL-293;转染HEK293细胞瞬时表达sIL-2Rα;表达产物His标签纯化;SDS-PAGE和Western印迹对表达产物进行鉴定。结果表达产物中在相对分子质量为48 000处可见与目的蛋白相对分子质量相符的条带,该条带可被sIL-2Rα单克隆抗体识别。结论构建的重组sIL-2Rα质粒能够在HEK293细胞瞬时表达,表达量为1~1.5 mg/L。     

骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建及其对NIH3T3细胞成骨分化作用的研究

目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)重组腺病毒,探讨其对NIH3T3成纤维细胞向成骨方向分化的影响。方法:将BMP4基因克隆连接到载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP4重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP4重组腺病毒转染NIH3T3细胞,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和western-blot检测BMP4在细胞中的mRNA和蛋白表达。Gomori改良钙钴法检测BMP4重组腺病毒转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达;von kossa染色检测BMP4重组腺病毒转染后NIH3T3细胞的成骨分化情况。结果:获得了BMP4转移质粒pAdTrack-BMP4和BMP4重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。BMP4在转染后的NIH3T3细胞中得到表达,表达的BMP4蛋白具有生物学活性。转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达增加。BMP4促进了NIH3T3细胞向成骨方向分化,形成钙结节。结论:本实验成功构建了BMP4重组腺病毒;BMP4重组腺病毒可促进NIH3T3细胞向成骨方向分化。     

重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子（的hVEGF165）为靶基因,增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记（的hVEGF165）重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。     

人hTERT基因的pCIneo真核表达载体的构建Q78

构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）片段的基因的pCIneo真核表达载体。方法：根据hTERTmRNA序列设计引物,人胚肾转化细胞系293总RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增后克隆到载体pCIneo上,并进行酶切鉴定及测序。结果-酶切结果表明hTERT基因已经插入pCIneo真核表达载体,测序结果显示,核苷酸序列的同源性为99．89％,氨基酸序列的同源性为100％。结论：成功构建hTERT基因的pCIneo真核表达载体,为其下一步的研究奠定了基础。     

腺病毒介导CTLA4Ig及CTLA4双基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的制备CTLA4Ig及CTLA4双基因共表达腺病毒载体,检测重组腺病毒在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)中的表达。方法构建大鼠CTLA4Ig融合基因,将CTLA4Ig及CTLA4基因经IRES2连接,通过同源重组获得重组腺病毒表达载体,并在293细胞中进行病毒包装和扩增。检测CTLA4Ig和CTLA4在BMMSCs中的共表达情况及其免疫抑制功能。结果通过同源重组获得携带CTLA4Ig-IRES2-CTLA4的重组腺病毒表达载体,PacⅠ酶切鉴定正确,与脂质体共转染293细胞获得重组腺病毒。用重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达CTLA4Ig及CTLA4,且此类细胞具有明显抑制淋巴细胞反应的功能。结论重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达分泌型CTLA4Ig和膜结合型CTLA4,通过阻断协同刺激通路方式进一步增强BMMSCs的免疫抑制功能。     

miR-195重组腺病毒表达载体构建及在细胞中的表达

目的:利用AdEasy系统构建miR-195的腺病毒表达载体,为研究miR-195的功能提供条件.方法:将miRNA-195前体序列从已构建的pcDNA-miR-195载体中克隆进穿梭载体pAdTrack-CMV,通过与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中高效同源重组,获得完整的重组腺病毒质粒.利用HEK293细胞包装并扩增重组腺病毒Ad-195.Ad-195感染肺癌细胞A549后,利用miRNA的定量RT-PCR技术检测Ad-195在细胞中表达miR-195情况.随后荧光素酶报告基因实验证明,Ad-195表达的miR-195能够作用于BCL2基因上预测的miR-195靶位点.结果:实时定量PCR检测显示,Ad-195感染肺癌细胞A549后,miR-195表达水平有显著的上调.结论:miR-195的腺病毒表达载体构建成功,能够用于在细胞内过表达具有生物学功能的miR-195.     

腺病毒表达Ribozyme在细胞内对HBV的免疫作用

了解利用腺病毒腺体表达针对乙型肝炎病毒（HBV）的核酶在细胞内对HBV表达的抑制作用。将针对HBV的多位点核酶克隆入腺病毒载体中，利用包装细胞包装出含核酶及突变核酶的重组腺病毒，将腺病毒感染2．2．15细胞（含HBV），检测感染细胞中核酶及突变核酶的表达，利用ELISA，打点杂交及激光共聚光共聚焦等方法，检测核酶对细胞内乙型肝炎病毒表达的抑制作用。结果显示核酶及突变核酶的确被克隆入腺病毒载体，并经过包装后可形成包装腺病毒，感染2．2．15细胞后可表达出目的核酶，并发挥核酶的剪切作用，其对HBV表达的抑制率最高可达87．1％。证实包装腺病毒表达的多位点核酶对HBV的复制有明确的抑制作用，支持核酶的抗病毒效果，有希望成为HBV治疗的潜在方法之一。     

hTERT启动子特异驱动IL-24重组腺病毒的包装及鉴定

目的 包装并鉴定人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子特异驱动白介素-24（IL-24）的重组复制缺陷型腺病毒.方法 全基因合成优化后的hTERT启动子,插入质粒pGL3-basic的多克隆位点（pGL3-phTERT）;从人外周血单核细胞扩增IL-24,插入pGL3-phTERT质粒的hTERT启动子下游获得pGL3-phTERT-IL24;随后将phTERT-IL24插入pShuttle中间质粒,使用AdEasy^TM Adenoviral Vector System包装Ad-phTERT-IL24重组腺病毒;同时包装CMV启动子驱动IL-24的腺病毒载体为阴性对照（Ad-CMV-IL24）,以空载腺病毒Ad作为空白对照.用20 MOI重组腺病毒感染SGC-7901、MKN-45、HF细胞,采用PCR及Western blot检测IL-24在RNA及蛋白水平的表达.结果 成功包装Ad-hTERT-IL24重组腺病毒.感染Ad-hTERT-IL24后,hTERT阳性肿瘤细胞内IL-24表达显著上调,但hTERT阴性的HF细胞则无IL-24表达;感染阴性对照Ad-CMV-IL24后,hTERT阳性或阴性细胞内均有IL-24表达,感染空白对照Ad后,hTERT阳性或阴性细胞内均无IL-24表达.结论 Ad-hTERT-IL24腺病毒载体可有效介导IL-24特异表达于hTERT阳性肿瘤细胞内.     

一株新型甲型H1N1流感病毒H275Y的奥司他韦耐药变异分析

目的 探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化规律,分析NA蛋白酶活性位点以及糖基化位点变化情况.方法 从NCBI检索获得110株不同年代、不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用MEGA 4.0软件进行基因进化分析,并用NJ法构建进化树;对NA基因核苷酸序列同源性及编码蛋白氨基酸序列进行分析.结果 2009年新型甲型H1N1流感病毒世界各地不同毒株间的NA基因同源性极高,达到99.5%～100%,但与以往甲型H1N1人流感病毒的NA基因差异较大.2009年新型甲型H1N1流感病毒与欧洲A/swine/H1N1的NA基因同源性高,达到89.6%～92.9%,且糖基化位点分布一致,分别在50、58、63、68、88、146、235和386位存在糖基化现象.另外2009年新型甲型H1N1流感病毒与A/chicken/H5N1的NA基因同源性也较高,达到83.6%～85.3%.绝大部分2009年新型甲型H1N1流感病毒的NA蛋白酶活性中心及周围相关位点氨基酸组成保守,仍然表现为R118、D151、R152、R225、E277、R293、R368、Y402、E119、R156、W179、S180,D199、1223、E228、H275、E278、N295和FA25,但丹麦、日本、我国香港及湖南分离到的4株病毒出现H275Y突变.2009年新型甲型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧洲A/swine/H1N1流感病毒,并与A/chicken/H5N1病毒有较近的亲缘关系.结论 2009年新型甲型H1N1流感病毒并非由以往人H1N1流感病毒逐渐进化而来,而是一种新型重排病毒,我国湖南地区发现的一株新型甲型H1N1流感病毒具有H275Y奥司他韦耐药变异.