节律基因mPeriod2过表达对体外Lewis肺癌细胞γ射线敏感性的影响

目的评价mPeriod2(mPer2)基因转染后过表达对小鼠Lew is肺癌细胞(LLCs)60Coγ-射线放射敏感性的影响。方法采用脂质体介导方法将mPer2基因转染至LLC细胞,以空白组及空载体质粒pcD-NA3.1为对照,采用RT-PCR及流式细胞术检测mPer2基因在LLC细胞中的表达,给予60Coγ-射线4Gy单次照射后,流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡,采用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化、细胞集落形成实验检测细胞增殖及存活情况。结果60Coγ-射线照射后,与转染空载体质粒组及空白组比较,转染mPer2基因细胞表现为G2/M期阻滞,凋亡率下降(contro l:8.10±0.03;pcDNA3.1-vector:11.20±0.07;pcDNA3.1-mPer2:4.40±0.02;P<0.05),细胞克隆形成增加(contro l:14%;pcDNA3.1-vec-tor:11%;pcDNA3.1-mPer2:32%;P<0.01)及PCNA阳性表达增加(contro l: ,pcDNA3.1-vector: ,pcDNA3.1-mPer2: ,P<0.05)。结论节律基因mPer2过表达使60Coγ-射线照射的小鼠Lew is肺癌细胞凋亡下降,细胞增殖明显,降低了该细胞对放射损伤的敏感性。     

近日节律基因Per2对人肺癌细胞生长的抑制作用

目的 研究近日节律基因Per2对肺癌细胞(A549)生长的抑制作用及其机制.方法 将pcDNA3.1(+)-Per2转导入A549细胞内,过表达Per2,以空质粒pcDNA3.1(+)为对照.采用MTT和细胞平板集落形成实验检测肺癌细胞的生长情况;通过流式细胞技术观察细胞的凋亡.结果 近日节律基因Per2能够抑制A549细胞的生长和增殖,诱导细胞凋亡.结论 近日节律基因Per2能够抑制肺癌细胞的生长,其机制可能涉及诱导肿瘤细胞的凋亡.     

小鼠钟基因Period2(Per2)抑制乳腺癌细胞生长的研究

目的 研究小鼠节律基因Period2（Per2）对小鼠乳腺癌细胞（EMT6）的生长抑制及诱导凋亡的作用。方法 将pcDNA3．1（＋）-Per2转导入EMT6细胞内，同时设立转染空质粒pcDNA3．1（＋）入细胞的对照组。以RT-PCR、Western blot、流式细胞技术来检测Per2基因和蛋白的表达；采用MTT、细胞生长曲线、细胞平板集落形成实验检测Per2过表达后对小鼠乳腺癌细胞的生长抑制作用；通过流式细胞技术、DNA梯形带、hochst33258荧光染色和电镜技术检测nr2过表达后对小鼠乳腺癌细胞凋亡的影响。结果 小鼠节律基因nr2过表达抑制EMT6细胞的生长和增殖，诱导细胞凋亡率增加。结论 本研究发现小鼠节律基因Per2可能通过使EMT6细胞阻滞于G1期，并诱导细胞凋亡来实现对该肿瘤细胞的生长抑制作用。     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45生长特性的影响。方法 将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段，按正向、反向克隆人真核表达载体pcDNA3．1（＋）。测序正确的重组子pcDNA3．1-a（含GCRG213正向克隆）、pcDNA3．1-b（含GCRG213反向克隆）和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞，采用半定量RT-PCR及Western blot方法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞，采用细胞计数法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪分析细胞的增殖状态，Annexin VFITC／PI双标记法检测凋亡细胞。结果经测序证实，GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。与对应的空载体比较，转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中mRNA的表达上调35．4%，蛋白的表达上调49．4％，而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中mRNA的表达下调32．1％，蛋白的表达下调50．3％。转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞生长增殖速度加快，凋亡率下降，而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞生长增殖速度减慢，凋亡率增加。结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长，抑制肿瘤细胞凋亡，可能是恶性肿瘤癌变的促进因素之一。     

节律基因Period2对肿瘤细胞生长及放射敏感性的影响

目的探讨Period2（Per2）基因对细胞生长及放射敏感性的影响。方法体外培养C6神经胶质瘤细胞（C6 glioma cells），使用脂质体包裹法将nr2表达质粒（pcDNA3．1-Per2）转导入C6细胞内；以免疫组化及流式细胞术检测Per2表达；通过流式细胞术和克隆形成试验检测稳定转染Per2阳性表达的C6细胞在正常情况下和γ射线照射后的凋亡、生长。结果未经γ射线照射的Per2阳性表达的C6细胞较对照组细胞增殖减慢、凋亡率增加，但γ射线照射后的较对照组细胞增殖速度快、凋亡率减少。结论节律基因Per2过表达会增加肿瘤细胞的凋亡，但在射线照射情况下会降低肿瘤细胞对射线的敏感性。     

近日节律基因Period2对紫外线损伤NIH3T3细胞的影响

目的 探讨Period2(Per2)基因对紫外线损伤NIH3T3细胞的影响.方法 将Per2基因插入pcDNA 3.1,构建Per2基因的真核表达质粒,采用脂质体包裹法转导入NIH3T3细胞内.以紫外灯照射Per2基因过表达(pcDNA 3.1-Per2)的NIH3T3细胞、pcDNA 3.1空白组(pcDNA 3.1-vector)细胞和空白对照组细胞;通过流式细胞术和克隆形成试验检测稳定转染Per2阳性表达的NIH3T3细胞的凋亡、生长情况;采用单细胞凝胶电泳技术检测Per2过表达对DNA损伤后修复的影响.结果 紫外线照射后Per2阳性表达的NIH3T3细胞较其对照组细胞增殖速度快、凋亡率减少,单细胞凝胶电泳实验表明紫外线照射后,各组细胞均表现出明显的DNA损伤,但是pcDNA 3.1-Per2转染组均较pcDNA 3.1-vector及空白对照组细胞的彗星细胞出现率和拖尾细胞DNA迁移长度低.结论 节律基因Per2能抑制紫外线对细胞的损伤,其机制可能与Per2促进DNA修复作用有关.     

tTSF基因的酵母表达及其基因治疗研究

目的 选择PF4，TSP1的高活性片段及肿瘤细胞靶向肽，设计合成融合基因—tTSF，进行酵母表达及小鼠基因治疗研究。方法 根据PF4和TSP1的抑制血管生成高活性片段设计合成TSF基因，并在N-端接上肿瘤细胞靶向肽，设计合成了tTSF。将tTSF基因构建到pPIC9质粒，重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株进行表达，并检测表达产物对血管内皮细胞生长的抑制作用。将tTSF基因克隆到pcDNA3．1（＋）载体，重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF通过皮下注射治疗C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌。结果 重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株后，获得了tTSF的高效表达，表达产物对血管内皮细胞生长产生明显的抑制作用；皮下注射重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF后，C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌的生长受到明显抑制。结论 tTSF基因设计成功，其酵母表达产物对血管内皮细胞生长产生具有明显的抑制作用，tTSF基因的体内基因治疗也具有显著的抗肿瘤效应。     

外源性WAF1-S基因表达对喉癌细胞生长的作用

目的 探索WA1F-S基因在喉癌细胞内表达的作用，为喉癌的基因治疗提供理论依据。方法 采用亚克隆技术，构建WAF1-S真核表达载体pcDNA3-WAF1-S。利用lipofectamine介导，将外源野生型WAF1-S基因导入喉癌细胞系Hep-2，筛选阳性克隆，采用打点杂交技术观察WAF1-S基因mRNA在喉癌细胞中的表达，用Western blot及激光共聚焦方法定量分析WAF1-S基因的蛋白表达产物，MTT及流式细胞仪检测Hep-2细胞的生长状态。同时以空载体质粒pcDNA3为对照，分析WAF1基因对喉癌细胞生长的影响。结果 打点杂交证实转染WAF1-S基因的Hep-2细胞有外源WAF1-S基因的表达，外源基因WAF1-S在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。转染后喉癌细胞中WAF1-S的蛋白表达明显高于对照组。流式细胞仪计数证实WAF1-S能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 导入外源野生型WAF1-S基因可抑制喉癌细胞生长。     

肿瘤细胞节律基因对其药物敏感性的影响

目的 通过体外实验诱导节律基因表达,探讨肿瘤细胞节律基因对其药物敏感性的影响.方法 采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(PMA)诱导体外培养的EMT6乳腺癌细胞节律基因的表达;在不同时间点,以RT-PCR检测节律基因的代表mPer1基因的表达水平.在mPer1基因表达的高峰与低谷分别给予阿霉素(ADM)处理.采用二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝(MTT)法和流式细胞术检测ADM对EMT6细胞增殖的影响.结果 PMA诱导后,EMT6细胞的mPer1基因呈近日节律.在mPer1基因表达高峰时,ADM对肿瘤细胞的抑制率高于其在低谷的抑制率.结论 肿瘤细胞节律基因能够影响其对药物的敏感性.     

泛素代谢系统相关基因FBG2在胃癌细胞系中功能意义的研究

目的初步探讨泛素代谢系统相关基因FBG2对于胃癌细胞生长、增殖、凋亡等生物学特性及成瘤、浸润转移能力等恶性表型的影响。方法将FBG2基因插入载体pcDNA3．1构建pc-FBG2真核表达载体。以脂质体介导转染MKN45胃癌细胞并以G418压力筛选法筛出稳定表达的克隆，对稳定表达株进行鉴定，然后使用流式细胞仪、生长曲线法、平板克隆形成实验法、细胞迁徙实验法等分析稳定表达株相关生物学特性与恶性表型的变化，每种检测实验均设立pc-FBG2稳定转染细胞组、pcDNA3．1稳定转染细胞组和空白MKN45细胞组。结果与转染pcDNA3．1空载体及空白MKN45胃癌细胞相比，转染pc-FBG2载体的稳定表达细胞株生长有所加快，开始计数后第4、5、6、7天平均细胞计数显著增高（P〈0．05），细胞周期检测显示pc-FBG2转染组G2／M期比例显著高于其他两组（P〈0．05），而S期比例显著低于其他两组（P〈0．05）。细胞凋亡检测显示pc-FBG2转染组凋亡比例与其他两组相比无显著差异（P〉0．05），平板克隆形成实验结果显示pc-FBG2转染组平均克隆形成率显著高于其他两组（P〈0．05），细胞迁徙实验结果显示pc-FBG2转染组穿膜率与其他两组相比无显著差异（P〉0．05）。结论FBG2基因在一定程度上可促进细胞生长及有丝分裂，对维持细胞恶性表型具有一定意义，但对细胞凋亡及浸润转移能力可能影响较小。     

乳腺癌缺失基因1对肝癌生物学行为的影响

目的探讨乳腺癌缺失基因1（deleted in breast cancer 1,DBC1）对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-DBC1的正义表达载体,转染肝癌细胞SMMC-7721,MTT法检测DBC1对肝癌细胞SMMC-7721生长增殖的影响,采用流式细胞术（FCM）检测DBC1对肝癌细胞SMMC-7721的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果与转染空载体的SMMC-7721细胞相比,pcDNA3.1-DBC1正义表达载体转染上调DBC1的表达,可显著抑制肝癌细胞（SMMC-7721）增殖,升高G1期细胞比例（51.0%vs 64.9%,P=0.002）,降低S期细胞比例（29.7%vs 14.0%,P〈0.001）,诱导细胞凋亡（8.8%vs 24.6%,P〈0.001）。结论 DBC1通过抑制肿瘤细胞增殖,阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡,抑制肝癌的发生和发展。     

转染内皮抑素质粒对人脑胶质肉瘤C6细胞株放射治疗影响的研究

目的探讨ES对人胶质肉瘤细胞株C6放射治疗的影响。方法通过质粒转染的方法,运用MTT法和流式细胞仪检测了ES以及ES和放射治疗联合作用对C6细胞株增殖和凋亡的影响。结果MTT法检测表明放射治疗对转染pcDNA3.1 ES的C6细胞的生长抑制作用明显增强,细胞增殖明显减慢,差异具有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测表明,转染pcDNA3.1 ES后,G0/G1期细胞明显增加(P<0.05),S期细胞明显减少(P<0.01),凋亡率明显上升(P<0.01))。结论ES联合放射治疗可明显抑制人脑胶质肉瘤C6细胞株的生长,二者联用可以产生协同抗瘤作用。     

人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR1的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR1功能奠定了良好的实验基础.     

应用微阵列技术筛选HBV前-S1蛋白的反式调节基因谱

目的 阐明前-S1蛋白的表达对乙型肝炎病毒(HBV)感染肝细胞基因表达谱的影响。方法 以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号：AF384371)作为模板，应用PCR扩增前-S1蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS1，以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总mRNA，逆转录为cDNA，与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在1152个基因表达谱的筛选中，发现有30个基因表达水平显著上调，38个基因表达水平显著下调。结论 前-S1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。     

天然溶瘤新城疫病毒Italien株HN基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建天然溶瘤型新城疫病毒(NDV)Italien株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的真核表达载体并进行产物表达.方法 采用RT-PCR法从病毒RNA中克隆HN cDNA,并构建HN的真核表达载体pcDNA3.1-HN,脂质体法转染CHO-K1,G418筛选稳定表达克隆.用Western blot、免疫荧光法检测HN蛋白的表达.结果 经限制性酶切鉴定及DNA测序分析,证实真核表达载体pcDNA3.1-HN构建正确.Western blot和免疫荧光分析表明HN基因在CHO-K1中成功表达.结论 天然溶瘤型NDV Italien株的HN cDNA被成功克隆,所构建的真核表达载体pcDNA3.1-HN可以在CHO-K1细胞中稳定表达.     

Smac基因联合12C6+离子照射对膀胱癌EJ细胞的生物效应观察

目的观察smac基因能否提高膀胱癌EJ细胞12C6 离子照射的生物效应。方法实验分为3组:空白对照组、转染空载体组、转染smac基因组。利用免疫组化及流式细胞仪方法检测3组细胞内smac基因表达。转染24h后对3组分别进行0、2和4Gy12C6 离子照射,用克隆形成实验对3个组分别检测细胞的存活分数并利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果免疫组化结果表明转染pcDNA3.1/smac的细胞其smac基因表达量明显高于转染空载体pcDNA3.1的细胞和空白组细胞。流式细胞仪数据显示,smac基因转染细胞smac基因的荧光强度(3080)显著高于转染空载体组(2256)(P<0.05),而后者与空白对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。克隆形成实验结果表明,转染smac基因组细胞12C6 离子照射后的存活分数较转染空载体组细胞显著降低(P<0.05)。流式细胞仪测定结果表明,12C6 离子照射的转染smac基因组的细胞凋亡率明显高于转染空载体组(P<0.05)。结论外源smac基因转染膀胱癌细胞株能显示高表达,并能提高膀胱癌细胞的凋亡率,与12C6 离子照射结合后能显著降低细胞存活分数和进一步增高凋亡率。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体，为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段，将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接，经酶切鉴定及测序确证，将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞，用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因，经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致，并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。