腺病毒介导荧光素酶报告基因感染间充质干细胞的研究

目的 构建携带萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的腺病毒载体(Ad-Luc),研究其感染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)后的体内外生物发光成像.方法 从psiCHECK-2质粒中用PCR扩增Luc基因,克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV后行Nhe Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切和测序鉴定.重组腺病毒穿梭载体与骨架载体pAdeno同源重组并包装纯化后,测定其病毒滴度.用重组Ad-Luc感染BMSC,行体外生物发光成像确定最佳感染复数(MOI),并采用曲线拟合回归分析生物发光强度与MOI的关系.以锥虫蓝染色法评价细胞活力变化,计算细胞存活率.将转染后BMSC(1×106个)植入SD大鼠前肢肌肉内,行体内生物发光成像.细胞存活率组间比较采用两因素重复测量资料方差分析.结果 经酶切和测序鉴定证明,Ad-Luc构建成功,病毒滴度为1×1010空斑形成单位(PFU)/ml.体外生物发光检测结果显示最佳MOI值为50,Ad-Luc可高效感染BMSC,使其表达Luc,且拟合曲线示细胞生物发光强度随MOI增加而增强(R2 =0.98).转染组和未转染组细胞培养1、3、5、7d时,细胞存活率分别为(92.5±2.3)％与(94.1±1.8)％、(91.4±0.9)％与(92.7±2.0)％、(92.1±1.6)％与(93.3±2.4)％、(91.9±1.5)％与(93.0±3.1)％,2组间细胞活力的差异无统计学意义(F=4.38,P＞0.05).体内生物发光成像结果示BMSC移植1、3、7d后仍有存活,但随时间延长,生物发光信号逐渐减弱.结论 Luc报告基因通过腺病毒载体成功转入BMSC,实现了光学报告基因成像对移植干细胞的示踪.     

荧光素酶活体发光技术在肺癌分子影像学研究中的初步应用

目的 建立稳定表达荧光素酶报告基因的人肺癌细胞系,并将该肺癌细胞接种于严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的皮下,构建异种移植动物模型,为下一步进行肺癌进展、转移以及药物敏感性等相关的分子影像学研究奠定基础. 材料与方法 利用表达重组荧光素酶基因的慢病毒载体(Lenti-Luc)感染人肺癌细胞系NCI-H460,获得稳定表达荧光素酶基因的肺癌细胞,将该细胞接种于SCID小鼠的皮下.肿瘤细胞接种2周后,利用生物发光成像系统及MRI对肿瘤进行检测,确定肿瘤的大小和位置,并进行组织病理学检查验证. 结果 接种肺癌细胞的4只SCID小鼠中,均生长出肿瘤.生物发光检测和MRI的结果 相符,病理证实小鼠皮下肿块为癌组织. 结论 成功建立了稳定表达荧光素酶报告基因的肺癌细胞系及异种移植动物模型.荧光素酶活体发光是一种进行肿瘤分子影像学研究的重要手段.     

活体荧光成像技术评价X射线对小鼠乳腺癌移植瘤的治疗效果

目的 建立荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞爪垫淋巴结转移模型,监测肿瘤早期淋巴结转移,并用荧光成像评价X射线局部治疗效果。方法 将表达荧光素酶的小鼠乳腺癌细胞系4T1-Luc接种至裸鼠爪垫皮下,建立爪垫皮下淋巴结转移模型。通过裸鼠活体荧光成像系统连续观察肿瘤细胞在淋巴结中的转移情况,并将有早期淋巴转移的荷瘤裸鼠按随机数字表法分为对照组和治疗组,活体荧光成像系统观察治疗效果,HE染色观察评价病理形态学变化。结果 成功建立了小鼠乳腺癌淋巴结转移模型,爪垫原发灶肿瘤体积与荧光光子数呈正相关性（r=0.958,P<0.001）,在肿瘤接种的第24天,治疗组爪垫肿瘤和腘窝处肿瘤部位的荧光光子数较对照组呈显著性降低（t=32.58,P<0.05）;用荧光光子数计算抑瘤率高达85%以上。HE染色观察到治疗组较对照组移植瘤坏死明显。结论 运用活体生物发光成像技术能够动态、客观、灵敏、可视化地评估X射线对小鼠乳腺癌肿瘤的抑瘤效应。     

光动力学疗法治疗恶性黑素瘤的动物实验研究

目的:在黑素瘤动物模型上观察二氢卟吩e6(Ce6)和5-氨基酮戊酸(5-ALA)的光动力学治疗作用。方法:将培养的人恶性黑素瘤细胞株接种至裸鼠腹部皮下,接种细胞数为2×106个/只,接种后1周开始PDT实验。荷瘤裸鼠随机分为4组,每组6只。对照组:不给予光敏剂处理,只进行激光照射;5-ALA-PD     

CB6F1小鼠急性粒单核细胞白血病M4(AML-M4)模型的建立及鉴定

目的 建立CB6F1小鼠急性粒单核细胞白血病M4(AML-M4)模型并进行鉴定.方法 取CB6F1小鼠,经静脉注射小鼠粒单核细胞白血病WEHI-3细胞,观察不同数量(1×106、2×106、5×106、1×107个)细胞接种与小鼠生存时间的相关性.取接种1×106个细胞的小鼠为研究对象,动态观察其发病情况并在接种后每周...     

F10基因过表达对A549细胞致瘤性的影响

目的 探讨F10基因过表达对肺癌A549细胞裸鼠成瘤的影响及其机制.方法 取SPF级裸鼠(4～5周龄)18只,随机均分为A549-WT组、MockA549组和F10+A549组(n=6),依次接种野生A549细胞(A549.WT)、转染了空载体的对照细胞株(Mock-A549)和已构建的过表达F10基因的A549细胞(F10+A549)5 × 106个于颈背部皮下.接种后每3～4d称体重并观察,记录肿瘤发生时间,绘制在体肿瘤生长曲线,计算各组裸鼠的成瘤率.各组裸鼠于接种5周后处死,进行大体观察后取瘤组织块制备石蜡切片,HE染色后行病理组织学观察,并采用免疫组化法检测Caspase-3、Bax和Bcl-2在瘤组织中的表达.结果 A549-WT组、Mock-A549组和F10+A549组裸鼠的成瘤时间分别为12.0±1.4、11.7±1.0、8.5±1.4d,组间比较差异有统计学意义(F=13.523,P=0.000),A549-WT组和MocbA549组裸鼠成瘤时间长于F10+A549组(P＜0.05),而前两组比较差异无统计学意义(P=0.660).大体观察可见,F10+AS49组成瘤体积较胚49-WT和Mock-A549组明显增大.F10+A549组肿瘤的在体生长速度较A549-WT和Mock-A549组增快,差异有统计学意义(P＜0.05),而后两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).肿瘤组织HE切片显示,A549-WT和Mock-A549组成瘤组织中存在较多坏死细胞,HE染色表现为均质红染、无定形物质结构,而F 10+A549组成瘤组织边缘细胞坏死较少,细胞增生明显,且肿瘤组织局部可见微血管生成.免疫组化检测显示,Bcl-2蛋白在A549-WT和Mock-A549两组瘤组织中几乎无表达,而在F10+A549组瘤组织中表达较多,阳性细胞呈弥漫性分布.Bax和Caspase-3蛋白在A549-WT和Mock-A549两组瘤组织中的表达均较强,尤以A549-WT组为显著,但在P10+A549组瘤组织中表达均很弱.结论 F10基因可通过下调Caspase-3和Bax表达、上调Bcl-2表达而增强肺癌A549细胞株在裸鼠体内的致瘤性.     

裸鼠肺癌原位模型的建立及螺旋CT、近红外荧光成像评价

目的利用A549细胞系建立原位肺癌的动物模型,并采用螺旋CT扫描和近红外荧光成像评价胸内肿物生长情况。方法将A549细胞悬液(5×106 ml-1)接种于20只裸鼠胸腔内,分别于接种后第7天、14天、21天,连续3周对荷瘤裸鼠行螺旋CT检查,动态观察胸内肿瘤生长情况,主要观察裸鼠的生存时间、体重变化及胸腔内肿瘤浸润和转移情况,并对裸鼠进行解剖后行近红外荧光成像和病理切片检查。结果本次A549细胞的造模成功率为90%,中位生存期为30.7(20~41)天。荷瘤裸鼠胸内肿瘤转移发生率100%。经螺旋CT扫描肿瘤显示率100%,CT上测得平均肿瘤直径随时间逐步递增,而近红外荧光成像对胸腔内肿瘤显示率为零。结论 A549细胞接种于裸鼠肺部所建立的肺癌原位模型简单,成功率高;采用螺旋CT扫描能动态直观评价裸鼠胸内肿物生长情况,近红外荧光成像对胸腔内肿瘤显示能力有限。     

动态增强MRI、扩散加权成像及光学成像联合监测抗血管生成治疗后肿瘤反应的动物实验研究

目的 利用多模态成像技术即小动物活体光学成像、动态增强MRI(DCE-MRI)及DWI,评价裸鼠肺癌皮下移植瘤经抗血管治疗后肿瘤解剖形态、血管功能及细胞分子水平的改变.方法 将绿色荧光蛋白(GFP)标记的人NCI-H460肺癌细胞接种于裸鼠皮下,接种第10天选取肿瘤直径生长至0.5～1.0 cm的裸鼠12只,按数字法随机等分为2组,并分别给予重组人血管内皮抑制素注射液(治疗组)和生理盐水(对照组)处理.治疗7d后利用小动物光学活体成像系统、DCE-MRI、DWI评价两组裸鼠肿瘤体积、荧光信号强度值、血管功能参数[对比剂容积转移常量(Ktrana)、速度常量(Kep)、血管外细胞外间隙容积比(Ve)、对比剂浓度下峰面积(iAUC)]以及ADC值;并与肿瘤组织透射电镜、HE染色的病理结果,及免疫组织化学染色检查的微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达结果进行对照.对结果采用Kolmogorov-Smirnov方法进行正态性检验.Kep为非正态分布,数据以M(范围)表示,两组间比较采用秩和检验;VEGF为等级资料,两组间表达水平的比较采用x2检验;其他两组间符合正态分布的定量资料的比较均采用t检验;符合正态分布的定量资料间的相关性分析采用Pearson相关分析,定性资料用Spearman相关分析.结果 肿瘤细胞接种第7天两组裸鼠皮下均出现荧光团,随着时间的延长荧光团范围逐渐增大,强度也逐渐增加.治疗7d后,治疗组肿瘤平均光信号强度值为(2.51±2.43)×1010(光子数/s),对照组为(5.77±3.25)×1010(光子数/s),差异无统计学意义(t =1.964,P＞0.05);治疗组肿瘤体积为(365±56)mm3,小于对照组的(987±265)mm3,差异有统计学意义(t =0.001,P＜0.01),抑瘤率为63.0％.两组肿瘤荧光信号强度值与体积之间存在正相关(r=0.673,P＜0.05).治疗组的血管功能定量参数Ktrans、Kep、Ve及iAUC分别为(0.055±0.012)min-1、0.335(0.184～0.894)min-1、0.297 ±0.041和7.334±3.930,均低于对照组[对照组分别为(0.117±0.027)min-、0.417(0.324～1.736)min-1、0.326±0.062和13.280±4.245],但两组Ktrans和iAUC间差异有统计学意义(t值分别为5.155、2.518,P值均＜0.05),Kep、Ve间差异无统计学意义.iAUC与MVD呈正相关(r=0.715,P＜0.01),与VEGF无相关性(r =0.484,P＞0.05).治疗组裸鼠肿瘤的ADC值为(791±38)×10-6 mm2/s,高于对照组的(737 ±43)×10-6 mm2/s,差异有统计学意义(t=-2.299,P＜0.05).免疫组织化学检查结果示:治疗组MVD[(11.9±4.8)条/高倍视野]低于对照组[(19.2±4.3)条/高倍视野](t=2.774,P＜0.05),VEGF表达较对照组弱,差异无统计学意义(x2=4.000,P＞0.05).透射电镜检查结果显示:治疗组部分肿瘤细胞发生变性,并出现凋亡现象.结论 利用多模态成像技术能够提供肿瘤抗血管生成治疗后解剖形态、血管功能及细胞分子水平的动态信息,有利于及时评估治疗效果.     

肝细胞肝癌组织及细胞株中PTPeta的表达及意义研究

目的 检测人肝细胞肝癌组织及细胞株SMMC7721中蛋白酪氨酸磷酸酶eta(PTPeta)的表达,观察肿瘤细胞生长密度对其表达的影响.方法 采用免疫组化方法检测肝细胞肝癌组织及SMMC7721细胞中PTPeta蛋白的表达;采用RT-PCR法检测不同生长密度(1×103、5×103、l×104、5×104/cm2)SMMC7721细胞中PTPeta的表达变化情况.结果 免疫组化检测结果表明肝细胞肝癌组织中PTPeta表达呈阳性,SMMC7721细胞中存在PTPeta表达,且定位于细胞膜;RT-PCR检测结果显示,当细胞密度为l×103、5×103、l×104、5×104/cm2时,PTPeta mRNA的表达量分别为0.425±0.031、0.659±0.041、0.771±0.043、0.885±0.045,PTPeta表达随着肿瘤细胞生长密度的增高而增加,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 PTPeta在肝细胞肝癌组织及细胞中表达,且随肿瘤细胞生长密度增高而表达增加.PTPeta 可能通过增加肝癌细胞黏附、维持恶性肿瘤细胞内环境稳定等,在恶性肿瘤细胞增殖及播散转移的过程中起重要作用.     

IBP对口腔鳞癌增殖作用的体内研究

目的 观察体内IRF-4结合蛋白（IBP）对口腔鳞癌（OSCC）细胞Tca8113生长的影响.方法 利用先前构建的高表达IBP的OSCC细胞株（Tca8113/IBP）及其空质粒对照组细胞株（Tca8113/C1）进行裸鼠成瘤试验,采用活体成像技术检测两组裸鼠接种瘤体的绿色萤光蛋白（GFP）信号.在处死裸鼠后,将接种的肿瘤组织取出并测量体积.结果 Tca8113/IBP组裸鼠显示的GFP信号区域较Tca8113/C1组显著增大,肿瘤体积也较Tca8113/C1组显著增大（P＜0.05）.结论 上调IBP表达在裸鼠体内能促进OSCC细胞的增殖.     

乳腺癌缺失基因1对肝癌生物学行为的影响

目的探讨乳腺癌缺失基因1（deleted in breast cancer 1,DBC1）对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-DBC1的正义表达载体,转染肝癌细胞SMMC-7721,MTT法检测DBC1对肝癌细胞SMMC-7721生长增殖的影响,采用流式细胞术（FCM）检测DBC1对肝癌细胞SMMC-7721的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果与转染空载体的SMMC-7721细胞相比,pcDNA3.1-DBC1正义表达载体转染上调DBC1的表达,可显著抑制肝癌细胞（SMMC-7721）增殖,升高G1期细胞比例（51.0%vs 64.9%,P=0.002）,降低S期细胞比例（29.7%vs 14.0%,P〈0.001）,诱导细胞凋亡（8.8%vs 24.6%,P〈0.001）。结论 DBC1通过抑制肿瘤细胞增殖,阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡,抑制肝癌的发生和发展。     

不同LET射线对SMMC-7721细胞辐射敏感性与周期的影响

目的研究不同LET射线对SMMC-7721肝癌细胞辐射敏感性、周期进程和凋亡的影响，为重离子治疗癌症的临床应用积累基础数据。方法以0、0．5、1、2、4和8Gy的^12C^6＋离子及X射线分别照射处于指数生长期的SMMC-7721细胞，用克隆形成率测定细胞辐射敏感性，通过流式细胞术测定细胞DNA含量以确定各时相细胞的比例及细胞凋亡情况。结果^12C^6＋离子所致的SMMC-7721细胞存活率明显低于x射线。随着吸收剂量的增加和修复时间的延长，^12C^6＋离子能导致更显著的细胞S期阻滞、G2/M期阻滞延迟和细胞凋亡。结论与X射线相比，^12C^6＋离子辐照能更有效地杀伤HepG2肝癌细胞，并诱导其凋亡。     

小鼠肝癌H22细胞中不同干性亚群的分选与鉴定

 目的 利用干细胞中乙醛脱氢酶（ALDH）高表达的特性分选并鉴定肿瘤细胞中存在的ALDH high 、ALDH low 及ALDH neg 细胞亚群。 方法 以流式细胞术检测小鼠肝癌H22、人胃癌BGC-823、结肠癌LS-174T、肝癌SMMC-7721细胞及胰腺癌SW-1990和Panc-1细胞系中ALDH+细胞的表达;在确定ALDH阳性表达的细胞中,以ALDH表达的高低差异,将细胞分选并定义为ALDH high 、ALDH low 、ALDH neg 细胞亚群;对分选出的3种细胞亚群进行CD133/CD44表型及细胞周期分析。 结果 （1）在小鼠肝癌H22细胞、人结肠癌LS-174T细胞、胰腺癌SW-1990细胞和Panc-1细胞中存在着ALDH阳性表达,而在人胃癌BGC-823细胞和肝癌SMMC-7721细胞中未见ALDH表达;（2）在小鼠肝癌H22细胞中能明确分选出存在荧光差异的3群细胞即ALDH high 、ALDH low 和ALDH neg 细胞亚群;（3）H22的ALDH high 、ALDH low 、ALDH neg  3个亚群中CD133/CD44表达存在差异,其表达比例依次减少;（4）H22细胞中ALDH high 亚群主要处于G 0/G 1期,ALDH low 亚群处于S期,而ALDH neg 亚群处于G 2/M期。 结论 在肿瘤细胞中存在着介乎于肿瘤干细胞与终末肿瘤细胞之间的特异性亚群,该亚群为肿瘤治疗提供了新的方向。     

红景天甙对人肝癌细胞c-myc表达的逆转作用

目的:研究红景天甙对人肝癌细胞系SMMC-7721的c-myc表达的逆转作用。方法:通过不同剂量红景天甙处理体外培养的SMMC-7721细胞株,采用免疫组织化学检测细胞c-myc表达。结果:不同终浓度(0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml)的红景天甙均能抑制SMMC-7721细胞C-myc表达,抑制率分别为8.8%、21.6%和39.8%(P<0.01)。其抑制作用呈剂量效应正相关。结论:红景天甙可抑制SMMC-7721细胞内c-myc的表达,提示其在体外诱导肝癌细胞分化的可能。     

腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达对逆转卵巢癌顺铂耐药的效果

 目的 探讨腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达逆转卵巢癌顺铂耐药的效果。方法 采用直接感染法、台盼蓝活细胞计数、MTT、Hoechst染色法及流式细胞仪检测等方法,绘制顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3/DDP细胞生长曲线及倍增时间,检测SKOV3/DDP细胞感染重组病毒前后其顺铂的IC₅₀值、细胞凋亡形态及细胞各周期的分布。结果 (1)顺铂浓度与SKOV3/DDP细胞抑制率呈线性正相关,相关系数r=0.9862(P<0.05),顺铂IC₅₀为(13.93±0.37)μg/ml,耐药指数为1.79。(2)重组腺病毒感染后干扰ERCC1基因表达,SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性分别增加了11.1%、16.7%、26.4%、33.5%,呈剂量依懒性(r=0.9716,P<0.05),耐药指数降至1.19。(3)重组腺病毒联合顺铂作用后,SKOV3/DDP细胞株G₁期细胞比例增大,S期细胞比例增大,细胞凋亡率增高(P<0.05)。结论 干扰ERCC1基因表达可以通过诱导耐药肿瘤细胞SKOV3/DDP凋亡、调节细胞周期分布等途径逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药。     

12C对人肝癌SMMC-7721细胞中survivin表达的影响

目的 通过采用RNA干扰技术下调survivin基因在人肝癌SMMC-7721细胞中的表达,观察survivin表达下调对细胞G₂/M期阻滞、细胞凋亡和重离子辐射敏感性的影响。方法 针对survivin mRNA体外化学合成小干扰RNA(siRNA),转染细胞,以实时 PCR方法检测转染后24和48 h细胞survivin mRNA的表达。Annexin-FITC检测细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测周期阻滞情况;克隆存活法确定细胞的辐射敏感性。结果 转染24和48 h后,细胞中survivin的表达量分别为未转染组的59%和39%;转染survivin siRNA后24 h,引起细胞G₂/M期阻滞,48 h阻滞明显。转染survivin siRNA 48 h后的细胞凋亡率为21.41%,明显高于未转染组细胞(t=9.13,P<0.01)。siRNA 转染组细胞受辐照后的存活率明显降低。结论 以siRNA下调survivin的表达可有效诱导细胞凋亡,引起G₂/M期阻滞,提高细胞对重离子的辐射敏感性。     

PARP-1抑制剂AG014699对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖及凋亡的影响

目的探讨PARP-1抑制剂AG014699对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖及凋亡的影响。方法①采用MTT法测定AG014699在不同浓度、不同时间对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖作用的影响;②用流式细胞仪测定AG014699在50μmol/L浓度下对人卵巢癌细胞株SKOV3作用24h后对细胞周期及凋亡的影响。结果①MTT测定：在24、48、72h时AG014699在10μmol/L分别测得的OD值与对照组相比,P〈0.05,有统计学差异;②流式细胞仪测定：AG014699在50μmol/L浓度下对SKOV3作用24h能明显改变细胞的周期分布,诱导细胞凋亡。结论 AG014699能明显抑制人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖并诱导其凋亡。     

细胞电穿孔联合低浓度顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞体外生长实验研究

目的 探讨细胞电穿孔联合低浓度顺铂对卵巢癌SKOV3细胞株体外生长作用的影响.方法 选用电场600 V/cm,脉冲个数5个,电容11μF作用于SKOV3细胞株.根据作用不同分为电穿孔＋药物（E＋M）组;电穿孔（E）组,药物（M）组和空白（C）组.每3 d一次观察处理后的生长细胞共24 d.描绘细胞生长曲线,观察各组细胞生长变化.结果 不同方式处理后细胞生长情况表明电穿孔＋药物组对SKOV3细胞的体外生长有良好抑制作用,差异显著（P〈0.01）;单纯电穿孔组对肿瘤细胞的抑制大于单纯药物组,低于电穿孔＋药物组;单纯药物组的低浓度顺铂对卵巢癌SKOV3细胞仅有微弱生长抑制.结论 以电场600 V/cm,脉冲个数5个,电容11μF作为细胞电穿孔参数并同时联合低浓度顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞株时,有明显加强非细胞抑制剂量顺铂对体外SKOV3细胞生长的抑制作用.