人血小板生成素在大肠杆菌中的高效表达

目的：人血小板生成素（ＴＰＯ）在大肠杆菌中的高效表达。方法：利用ＰＣＲ技术,扩增出了（１－１７４个氨基酸的）人血小板生成素ｃＤＮＡ,并将其克隆到ｐＧＥＸ－１λＴ载体中,构建了融合蛋白表达质粒。重组子用限制性内切酶酶切鉴定。表达产物ＳＤＳ－聚丙烯胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。结果：限制性内切酶酶切鉴定表明重组子含有正确的（１－１７４氨基酸）ＴＰＯｃＤＮＡ片段;表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ相对分子质量     

PCR技术在鉴定阳性重组子中的应用

介绍了采用ＰＣＲ技术在人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）、人促红细胞生成素及中国人γ－干扰素（ｈＩＦＮ－γ）ｃＤＮＡ重组质粒的构建过程中快速鉴定阳性重组子的方法。经ＰＣＲ扩增鉴定为阳性的重组子，提取质粒ＤＮＡ经重组位点相应的ＤＮＡ内切酶双酶切鉴定表明，全部含有插入片段。     

登革病毒NS1基因的平端PCR产物的快速克隆

用ＰＣＲ产物进行克隆已广泛用于分子生物学的各个领域。ＰＣＲ产物的克隆主要通过两个途径：其一，在引物的３’末端加上限制性内切酶的识别序列，使扩增片段产生粘性末端，再连接到有相应末端的载体中去。但是，由于许多限制酶对处在ＤＮＡ片段末端的识别序列的作用效率远较处于内部的序列为低。因此，该方法在实际应用中常常不能获得满意的结果。其二，用ＰＣＲ产物进行平端连接，这种方法无需酶切，可适用于任何扩增产物，故应用较广。但由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有不依赖模板的末端转移酶活性而导致扩增片段３’端带有腺苷酸残基，而使…     

输血传播病毒-DNA聚合酶链方法的建立及应用

目的：建立输血传播病毒（ＴＴＶ）－ＤＮＡ聚合酶链反应方法并应用于新疆地区不同人群ＴＴＶ感染的检测。方法：根据已报道的ＴＴＶ基因痛列（ＤＤＢＪ序列号：ＡＢ００８３９４）,通过引物设计软件ＳＱＮＣＥ和ＯＬＩＧＯ在其ＯＲＦ１区设计一对ＰＣＲ引物,扩增产生一个３１５ｂｐ的扩增片段,产物经ＢｇⅠⅡ酶切分别产生一个２１９ｂｐ和９６ｂｐ的酶切片段。结果：用建立的ＰＣＲ方法在１５例维存尔族转氨酶升高的非甲－非庚型     

用聚合酶链反应和限制性内切酶技术快速鉴定医学真菌

介绍了一种基于聚合酶聚链反应（ＰＣＲ）结合限制性内切酶分析技术区分临床重菌的方法，首先利用９种真菌的通用引物扩增其１８ＳｒＲＮＡ基因，然后用ＨａｅⅢＢｇｌＩ和ＮｈｅＩ三种限制性内切酶将扩增产物消化成不同数量和不同大小的ＤＮＡ片段，可以对白色念珠菌，新型隐球菌和烟曲霉菌等９种临床上常见的医学真菌作出快速鉴定，该技术具有快速，敏感，不需杂交，可在２４ｈ以内完成鉴定等优点，有良好的临床应用前景。     

中国大陆庚型肝炎病毒结构区与非结构区部分cDNA基因的序列分析

作者在建立检测庚型肝炎病毒酶免疫和ＰＣＲ技术的基础上，将抗－ＨＣＶ上阳性病人血清经逆转录－巢式ＰＣＲ分离部分ＨＧＶｃＤＮＡ片段，用与ＨＧＶ基因互补的特异寡核苷酸引物进行双脱氧核苷酸链末端终止法－ＰＣＲ直接测序。结果表明，中国大陆ＨＧ－３０２Ⅰ株部分ｃＤＮＡ序列与Ｌｉｎｎｅｎ等报道的ＨＧＢ美国株ｃＤＮＡ序列有极高的同源性。     

氨基糖苷类抗生素致聋家系线粒体DNA 12S和16S rRNA基因突变分析

目的:研究线粒体rRNA基因突变与氨基糖苷类抗生素致聋遗传易感性的关系,为建立相应的基因诊断方法提供依据。方法:收集5个有明确氨基糖苷类抗生素应用史的耳聋家系27名成员的外周静脉血标本,从白细胞中提取DNA,PCR扩增线粒体DNA片段,Alw26I限制性内切酶分析和DNA序列分析检测A1555G点突变,并对其中一个家系进行了线粒体DNA12S和16S rRNA基因全序列分析。结果:家系A、C、D和E的21份样品均为A1555G点突变阳性,家系B的6份样品为A1555G点突变阴性。家系B线粒体DNA12S和16S rRNA基因全序列分析显示,该家系存在16S rRNA基因第2227位“AA”插入突变。结论:本研究发现了一个A1555G点突变阴性的氨基糖苷类抗生素致聋家系,说明线粒体DNA A1555G点突变不是氨基糖苷类抗生素遗传易感性惟一的分子基础,对氨基糖苷类抗生素致聋遗传易感性的预测仅检测A1555G点突变是不够的,应与mtDNA其他相关突变位点的检测结合起来。     

人表皮细胞生长因子基因真核表达质粒pcDNA3—hEGF的构建

目的：构建人表皮细胞生长因子（ｈＥＧＦ）基因真核表达质粒，为深入研究ｈＥＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈＥＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增；提纯及纯化ｐＵＣ１８－ｈＥＧＦ质粒；经ＤＮＡ序列分析其所含ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ；限制性酶切ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ片段，连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内，克隆出真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈ     

瘢痕疙瘩Fas基因突变的银染PCR—SSCP检测

以前的研究提示：瘢痕疙瘩成纤维细胞的Ｆａｓ受体可能处于无功能状态。进一步探讨导致无功能Ｆａｓ分子的可能机制。取瘢痕疙瘩,增生性瘢痕患者的组织及外周血标本,ＰＣＲ特异性扩增Ｆａｓ分子外显子９的编码区,扩增产物经银染ＳＳＣＰ筛选,最后可疑阳性的ＰＣＲ标本进行ＤＮＡ测序,经ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测,２０例（２／１０）的瘢痕疙瘩组织中发现异常电泳带,经ＤＮＡ测序证实,这２例突变均为位于Ｆａｓ ｃＤＮＡ的７５５     

人肝癌细胞中端粒酶RNA的克隆及序列分析

目的：比较不同组织细胞中端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）的序列，建立以ｈＴＲ为基础的肿瘤诊断与治疗新技术。方法：采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术从人肝癌细胞株（ＨｅｐＧ２）中扩增出了ｈＴＲ部分ｃＤＮＡ序列，并通过电泳的方法鉴定了其特异性。通过分子克隆技术将上述产物插入Ｔ－质粒后转化入大肠杆菌ＪＭ１０９中，经聚合酶链反应（ＰＣＲ）鉴定了插入片段的特异性及方向，最后采用自动ＤＮＡ序列分析仪分析了上述插     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白的产生

目的：获得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析。方法：用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，定向克隆到经同样酶切处理的ｐＧＥＸ－ＫＧ表达载体，转化大肠杆菌，经优化ＩＰＴＧ的诱导条件，获得了ＦＡＳ胞外区与谷胱甘肽－Ｓ－转移酶的融合蛋白高效表达；用亲合层析法从细菌粗提物中纯化了ＧＳＴ－ＦＡＳ融合蛋白，免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体。结果：用重组ＦＡＳ为免疫原制备的抗体能诱导Ｕ９３７细胞产生细胞凋亡。结论：重组ＦＡＳ抗原和制备的抗体能用于对ＦＡＳ系统的功能研究     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白 产生

获得得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析，方法用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，     

未知cDNA扩增与亚克隆的方法学研究

新型蛋白质的分子克隆基本依靠ｃＤＮＡ文库的筛选，而文库构建的载体多为λｇｔｌｌ。由于λｇｔｌｌＤＮＡ分子量较大（４９ｋｂ），提取过程中多用ＰＥＧ，因此λｇｔｌｌｃＤＮＡ克隆及其直接序列测定极为困难。为克服此困难，作者自行设计了不含克隆位点的一对公用λｇｔｌｌＰＣＲ引物。试用表明，此引物通过改变ＰＣＲ反应条件，可特异性地扩增多种彼此独立的ｃＤＮＡ。经亚克隆后的序列测定表明，用此方法扩增克隆的多种ｃＤＮＡ保留了原有阅读框架和ｐｏｌｙＡ特有序列，因而基本解决了新型蛋白质分子克隆中ｃＤＮＡ亚克隆与序列测定的困难．     

半套式PCR扩增人抗体基因以增加抗体库的多样性

用重链５’－末端８条引物和３’末端１条引物以及轻链５’末端９条引物和３’末端２条引物ｃＤＮＡ为模板对免疫球蛋白基因进行了ＰＣＲ扩增。结果表明，重链的扩增率为５０％，轻链的扩增率为４４％。而先用信号肽序列为经物和以上３’末端引物以ｃＤＮＡ为模板先进行第一次ＰＣＲ，然后以该产物为模板再用以上方法进行第二次ＰＣＲ时，不仅所有的引物都佑欣?     

RAPD用于结核暴发流行点传染源鉴别及其意义

作者就随机扩增ＤＮＡ多态性分析 (ＲＡＰＤ)技术用于结核暴发流行点传染源鉴别的价值进行了探讨 ,现报道如下。1　材料与方法1 1　痰菌分离培养　由全军结核病防疫队取自北京市某结核病暴发流行点共 13份痰标本 ,于次日用匡氏琼脂培养基做抗酸杆菌分离培养[1] 。1 2　菌型鉴定　采用多引物ＰＣＲ和传统生化、培养分型 2种技术对抗酸杆菌阳性分离物分型鉴定[2 ] 。1 3　药敏试验　采用匡氏琼脂培养基鉴定结核杆菌分离株对 8种抗痨药物的抗性[3 ] 。1 4　ＤＮＡ提取　用酚 氯仿法从受试结核菌提取ＤＮＡ。为确保操作安全 ,用作ＤＮＡ提取的菌…     

60Co辐射事故5名受照者外周血T细胞抗原受体基因的印迹杂交分析

在低熔点琼脂糖胶内制备人淋巴细胞基因组ＤＮＡ，两种限制性核苷酸内切酶对低熔点胶块内的样本ＤＮＡ进行完全消化，以人Ｔ淋巴细胞抗原受体（ＴＣＲ）的α和β链ｃＤＮＡ为探针，对５名４．５年前全身受６０Ｃｏ大剂量受照者外周血淋巴细胞基因组ＤＮＡ进行印迹杂交分析。结果发现经ＨｉｎｄⅢ内切酶消化的样本ＤＮＡ，正常对照与受照者比较，两种ｃＤＮＡ探针的杂交结果无明显区别，经ＥｃｏＲⅠ内切酶消化的ＤＮＡ样本，４名受者的αｃＤＮＡ探针杂交带型不同于正常对照。作者对这一结果进行了初步分析。     

中国人CCR5Δ32基因突变的检测及其对HIV遗传易感性的初步评估

为了解ＣＣＲ５Δ３２基因突变在中国本土人群基因组中的分布,初步评估我国人群对ＨＩＶ－１感染的遗传易感性,用ＰＣＲ扩增,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＤＮＡ测序等分子生物学方法对９１５名中国人来源的基因组ＤＮＡ中ＣＣＲ５Δ３２基因突变进行了检测。结果发现,所有被检测的个体绝大多数均表现为ＣＣＲ５ｗｔ／ｗｔ纯合子等位基因型,仅检测到两例个体为突变的杂合子ＣＣＲ５ｗｔ／Δ３２基因型,而未见到有突变的ＣＣＲ５Δ３     

PCR直接扩增与套式扩增用于HLA－DR基因分型的研究

人类ＨＬＡ抗原分型在人类学、法医学、疾病易感性及器官组织移植等研究中有重要的意义。在骨髓移植中，进行供者、受者ＨＬＡ配型，选择相合的供体，减少ＧＶＨＤ发生，是移植成功的关键。目前国内主要采用血清学方法进行ＨＬＡ配型。由于方法上的缺点，常有约２０％左右的误差率，因此，基因分型技术的研究与应用势在必行。该研究通过设计合成ＨＬＡ基因序列特异性引物，建立了ＨＬＡ－ＤＲ基因分型的套式扩增和直接扩增ＰＣＲ－ＳＳＰ技术，并在骨髓移植配型中进行了应用。对两种分型技术进行了对比，两种方法各有特点，套式扩增在高度同源的ＤＮＡ序列扩增中有高度的特异性，并具有高度的灵敏性，很少量的ＤＮＡ即可满足ＰＣＲ扩增，但需两次扩增，非同源因素影响增大；直接扩增操作简便，一次扩增完成分型，但结构同源因素对特异性影响大。两种方法经周密设计均有高度的准确性，可常规用于临床骨髓移植配型     

孕妇血清和胚胎组织中微小病毒B19 DNA的检出

作者建立了检测人微小病毒Ｂ１９（ＨＰＶ－Ｂ１９）的ＰＣＲ方法。两对引物（Ｐ１Ｐ２和Ｐ３Ｐ４）的设计均位于编码ＨＰＶ－Ｂ１９衣壳蛋白ＶＰ１基因区内，扩增产物分别为７００ ｂｐ和１０４ ｂｐ。比较Ｐ１Ｐ２－ＰＣＲ和Ｐ３Ｐ４－ＰＣＲ，二者均具有高度特异性和第三性，ＨＰＶ－Ｂ１９ ＤＮＡ最小检同量分别为５ ｆｇ。应用Ｐ１Ｐ２－ＰＣＲ对３２份孕妇血清和２１份胚胎组织标本进行了ＨＰＶ－Ｂ１９ ＤＮＡ的检测，结