PTEN反义寡核苷酸对辛伐他汀调控心肌细胞肥大的影响

目的:观察抑癌基因—PTEN的反义寡核苷酸对辛伐他汀调控心肌细胞肥大的影响。方法:应用图像分析系统及[3H]-亮氨酸掺入法分别测定心肌细胞表面积及蛋白合成速率,RT-PCR检测心钠素(ANP)mRNA表达,RT-PCR和West-ern blot法检测PTEN的mRNA和蛋白表达水平。结果:辛伐他汀 PTEN反义链组心肌细胞表面积、[3H]-亮氨酸掺入率、ANP mRNA水平均明显高于辛伐他汀组(P<0.01),PTEN mRNA及蛋白表达水平明显低于辛伐他汀组(P<0.01)。结论:PTEN反义寡核苷酸能够抑制PTEN表达、部分逆转辛伐他汀对心肌细胞肥大的抑制作用。     

PPARγ激活物对体外肥大心肌细胞的影响

目的：探讨PPARγ激活物吡格列酮和15脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)对体外肥大心肌细胞的影响。方法：新生大鼠的原代培养心肌细胞，以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激建立体外肥大心肌细胞模型，并用不同浓度的吡格列酮和15d-PGJ2作用于上述细胞。采用RT-PCR法检测肥大心肌细胞特征性基因心钠肽(ANP)和脑钠肽(BNP)的mRNA表达。以^3H-亮氨酸掺入实验检测心肌细胞蛋白合成速率，并分析心肌细胞表面积。结果：所建立的肥大心肌细胞模型呈现心肌细胞表面积、ANP和BNP的mRNA表达以及蛋白合成速率均为增加；而吡格列酮和15d-PGJ2可以逆转这些变化，并呈一定的剂量依赖性。结论：PPAR7激活物吡格列酮和15d-PGJ2对体外心肌细胞肥大有抑制作用，提示PPAγ途径介入了心肌肥大的发生发展过程。     

阿托伐他汀通过激活PPARa信号通路抑制老年大鼠心肌IL-1β表达

目的：观察阻断老年大鼠心肌细胞过氧化物酶体增殖物激活型受体a（PPARα）信号通路对白细胞介素-1β（IL-1β）表达水平的影响。方法：将培养的老年大鼠心肌细胞分为空白对照组、溶剂对照组、阿托伐他汀组、PPAR拮抗剂GW6471＋阿托伐他汀组。分别加入细胞培养液、二甲基亚砜（DMSO）、阿托伐他汀、阿托伐他汀＋PPARa拮抗剂GW6471。用RT-PCR和western blot方法检测各组细胞IL-1βmRNA和IL-1β蛋白含量。结果：①与空白对照组相比,溶剂对照组大鼠心肌细胞IL-1βmRNA表达水平和蛋白含量均无显著差异（P〉0．05）;②与空白对照组相比,阿托伐他汀组IL-1βmRNA表达水平和蛋白含量均显著降低（P〈0．01）;③GW647l＋阿托伐他汀组IL-18mRNA表达水平及蛋白含量均显著高于阿托伐他汀组（P〈0．05）,但仍低于空白对照组（P〈0．05）。结论：阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌细胞IL-1p表达的作用可能与其激活PPARα信号通路有关。     

PPARβ激动剂对肥大心肌细胞蛋白合成及IL-1β表达的影响

目的：探讨过氧化物酶体增殖物活化型受体β亚型（ PPARβ）激动剂对体外肥大心肌细胞蛋白合成及相关炎性因子IL-1β表达的影响。方法体外培养新生大鼠的心室肌细胞,以血管紧张素Ⅱ（ AngⅡ）诱导建立心肌细胞肥大模型,将适宜浓度PPARβ激动剂GW0742作用于心肌细胞,用3 H-亮氨酸掺入法检测心肌细胞蛋白合成速率,RT-PCR及Western印迹方法分别检测IL-1βmRNA和蛋白水平的表达变化。结果与结论 GW0742在抑制肥大心肌细胞蛋白合成速率的同时,下调其IL-1βmRNA和蛋白的表达,而作为溶剂的DMSO则无此影响,说明GW0742抑制AngⅡ介导的体外心肌细胞肥大,其机制可能与调控炎性因子IL-1β密切相关。     

Anti-miR-155反义寡核苷酸对人肺鳞癌H157细胞增殖的影响

目的：观察anti-miR-155反义寡核苷酸（AMOs）对肺鳞癌H157细胞增殖的影响。方法：将H157细胞分为对照组和AMOs处理组，AMOs处理组采用AMOs抑制H157细胞内miR-155的活性，液闪计数仪测定[^3H]-TdR掺入量，MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞仪测定细胞周期。结果：与对照组相比，AMOs显著减少H157细胞[^3H]-TdR掺入量（P〈0．01），随着浓度从10nmol／L逐渐增加至于100nmol／L，H157细胞[^3H]-TdR掺入量亦随之减少（P〈0．01）；AMOs显著抑制H157细胞的增殖（P〈0.01），使G0／G1细胞比例显著增加，G2／M期细胞比例显著减少（P〈0．01）。结论：AMOs通过抑制H157细胞内高水平表达miR-155的活性，显著抑制H157细胞的增殖。     

阿托伐他汀对心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用

目的探讨阿托伐他汀保护心肌细胞缺氧／复氧损伤的机制,为临床防治缺血再灌注损伤寻找新思路。方法分离SD乳鼠（出生1～3d）心肌细胞进行原代培养,建立H/R模型,取培养第3d的心肌细胞随机分成3组：正常对照组（CON组）、H,R组、H／R＋ATV组。应用MTS法检测心肌细胞的存活率;化学发光免疫分析法检测心肌细胞特异性损伤指标肌钙蛋白I（cTnI）的含量;采用SYBRGREEN荧光定量PCR检测各组HIF—1a、VEGFmRNA表达水平。结果与CON组比较,H／R组心肌细胞存活率明显降低（P〈0．05）,血清肌钙蛋白I明显升高（P〈O．05）,HIF—1a和VEGFmRNA表达水平显著升高（P〈0．05）;用阿托伐他汀预处理后心肌细胞存活率明显升高（P〈0．05）,血清肌钙蛋白I明显降低（P〈0．05）,HIF-1d和VEGFmRNA表达水平进一步升高（P〈0．05）。结论阿托伐他汀可能通过上调HIF-1a及VEGF的表达水平进而保护缺氧／复氧损伤的心肌细胞。     

阿托伐他汀通过PPARα信号通路抑制老年大鼠心肌TNF—α的表达

目的观察阻断过氧化物酶体增殖物激活物受体仪（PPARα）信号通路对阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达作用的影响。方法分离培养24个月龄大鼠的心肌细胞,将培养的细胞分为空白对照组、溶剂对照组、阿托伐他汀组、PPAR拮抗剂GW6471＋阿托伐他汀组。各组细胞分别加入细胞培养液、二甲基亚砜、阿托伐他汀、阿托伐他汀＋GW6471处理。分别用RT—PCR和Western blot方法检测各组大鼠心肌细胞的TNF-α mRNA表达水平和蛋白含量。结果（1）与空白对照组相比,溶剂对照组细胞的TNF-α mRNA表达水平和蛋白含量均无显著差异（P〉0．05）;（2）与空白对照组相比,阿托伐他汀组的TNF—α mRNA表达水平和蛋白含量均显著降低（P〈0．01）;（3）GW6471＋阿托伐他汀组的TNF-α mRNA表达水平及蛋白含量均显著高于阿托伐他汀组（P〈0．05）,但仍低于空白对照组（P〈0．05）。结论阿托伐他汀可通过激活PPARα信号通路来抑制老年大鼠心肌细胞炎性因子TNF-α表达。     

抑制整合素连接激酶（ILK）表达对大鼠肾小球系膜细胞细胞间隙连接蛋白43表达的影响

目的研究抑制整合素连接激酶（ILK）表达对大鼠肾小球系膜细胞（RMC）细胞间隙连接蛋白43（Cx43）表达的影响。方法将大鼠肾小球系膜细胞分为RMC组（n-6）、ILK-consiRNA转染组（n=6）和ILK-siRNA转染组（n=6）。合成抑制ILK基因的siRNA，待细胞长至60％融合后，ILK-siRNA转染组和ILK-con siRNA转染组分别用脂质体转染ILK-siRNA或ILK-con siRNA，RMC组仅加入脂质体，24h后收集细胞，提取总蛋白和总RNA，用RT-PCR和Western blotting观察ILK和Cx43 mRNA和蛋白的表达。转染后继续培养24、48、72h，MTT法检测细胞活力。结果与RMC组和ILK-con siRNA转染组比较，ILK-siRNA组ILK mRNA和蛋白的表达均下降30％-50％（P〈0.05，P〈0.01），Cx43 mRNA水平增加30％-40％（P〈0.05），Cx43蛋白水平增加60％-70％（P〈0.01）。应用ILK-siRNA转染系膜细胞后24、48、72h，细胞活力均显著高于RMC组和ILK-con siRNA转染组（P〈0.05，P〈0.01）。结论抑制ILK途径可上调肾小球系膜细胞Cx43的表达，增强细胞活力；Cx43的调节可能是部分通过ILK途径实现的。     

神经肽Y1受体激动药诱导大鼠心肌细胞肥大的研究

 目的 探讨神经肽Y1受体激动药[Leu31,Pro34]NPY在诱导心肌细胞肥大中的作用.方法 用不同浓度[Leu31,Pro34]NPY刺激原代培养心肌细胞,采用放射性核素3H-leu掺入法检测培养心肌细胞蛋白质合成速率.应用荧光定量PCR方法检测[Leu31,Pro34]NPY对培养心肌细胞肥大相关基因ANF、β-MHC mRNA表达的影响.结果 [Leu31,Pro34]NPY(10-9 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L)作用心肌细胞24 h后可明显增加心肌细胞3H-leu的掺入量 (P＜0.01),并可诱导心肌细胞β-MHC表达增加(P＜0.01),对ANF表达的影响不明显.结论 神经肽Y1受体激动药[Leu31,Pro34]NPY可加快细胞蛋白质合成速率、促进心肌细胞β-MHC表达,直接诱导心肌细胞的肥大.     

中药糖肾清1号对糖尿病肾病模型大鼠肾组织中纤维化因子表达的影响

目的观察中药糖肾清1号对糖尿病肾病肾组织局部纤维化因子表达的影响。方法 建立糖尿病肾病大鼠模型,设正常对照组、模型组、阳性对照药组、糖肾清1号甲、乙、丙、丁组及各组又分大、中、小剂量治疗组,分别采用RT-PCR、Western blot检测大鼠TGFβ1、CTGF mRNA转录及蛋白表达水平进行检测,采用光镜、电镜进行组织形态学检测。结果糖肾清1号呈量效依赖性下调TGFβ1、CTGF mRNA的转录和蛋白表达（P〈0.05或P〈0.01）,减少细胞外基质的沉积（P〈0.05或P〈0.01）。结论糖肾清1号可通过抑制TGFβ1、CTGFmRNA转录和蛋白表达,抑制肾组织纤维化的发生发展。     

耐力训练过程中大鼠心肌组织心钠素、脑钠素基因的表达

本研究采用定量反转录聚合酶链式反应技术,观察大鼠在11周中等强度耐力训练过程中心肌心钠素(ANP)和脑钠素(BNP)基因表达的变化.结果显示,大鼠心室BNP mRNA表达在训练第24天、第3天和第77天均较对照组显著增强(P＜0.01),心房BNP mRNA表达无显著变化.大鼠训练第38天,心室ANP mRNA表达显著高于对照组(P＜0.01),其余各时相较对照组变化不明显,训练第3天心房ANP mRNA表达显著高于对照组(P＜0.01),其余各时相较对照组变化不明显.结论:在耐力训练过程中,心肌BNP基因表达与ANP不一致,心室BNP基因表达变化与心肌肥大的发展过程一致,提示BNP在运动性心肌肥大发展过程中起着一定的作用.     

解偶联蛋白2对高糖高脂高尿酸诱导的心肌细胞凋亡的作用及机制

目的 研究解偶联蛋白2(UCP2)在高糖高脂高尿酸小鼠心肌细胞(MCM)中的作用及机制.方法 以25mmol/L高糖培养基+300μmol/L软脂酸钠干预MCM 18h模拟合并高脂血症的2型糖尿病组(高糖+高脂组),在糖尿病组的基础上再用1500μmol/L尿酸干预18h模拟2型糖尿病合并高尿酸组(高糖+高脂+高尿酸组).随后,采用UCP2抑制剂Genipin抑制心肌线粒体UCP2表达,进一步将2型糖尿病合并高尿酸组分为溶媒对照组、Genipin组.研究UCP2在高糖高脂合并高尿酸心肌细胞损伤的机制时,再分为Genipin组、Genipin+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组.采用流式细胞仪检测各组心肌细胞的凋亡水平,q-PCR法和Western blotting检测心肌细胞中UCP2的表达情况,DHE染色及ELISA法检测活性氧簇(ROS)水平.结果 与高糖+高脂组比较,高糖+高脂+高尿酸组心肌细胞凋亡明显增加(P<0.05),心肌细胞中UCP2的表达水平明显降低,同时ROS的水平明显上升(P<0.05).采用Genipin抑制UCP2的表达水平后,高糖高脂高尿酸干预后心肌细胞凋亡水平及ROS水平升高更加明显(P<0.05).在此基础上应用抗氧化剂NAC后,高尿酸所诱导的心肌细胞凋亡及ROS升高被明显逆转(P<0.05).结论 UCP2可以通过抑制氧化应激缓解高糖高脂合并高尿酸所诱导的心肌细胞凋亡.     

醛固酮自分泌环在高糖致人系膜细胞损伤中的作用

目的研究高糖环境下人系膜细胞(HMC)中醛固酮自分泌环及活性氧(ROS)、癌胚纤连蛋白(FN)表达水平的变化,进一步探讨醛固酮自分泌环与ROS、癌胚FN mRNA表达的关系。方法常规培养HMC,取对数生长期细胞分为5组:正糖组(5mmol/L D-葡萄糖),渗透压对照组(5mmol/L D-葡萄糖+20mmol/L L-葡萄糖),正糖+依普利酮组(5mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L依普利酮),高糖组(25mmol/L D-葡萄糖),高糖+依普利酮组(25mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L依普利酮)。采用RT-PCR法检测醛固酮合酶(CYP11B2)、11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ(11βHSD2)、癌胚FN mRNA表达水平,Western blotting检测CYP11B2蛋白表达水平,放射免疫法分析细胞培养液中醛固酮水平,通过激光共聚焦显微镜观察盐皮质激素受体(MR)蛋白表达及转位情况,荧光显微镜和荧光酶标仪检测细胞内ROS水平。结果与正糖组比较,高糖组HMC细胞CYP11B2 mRNA及蛋白表达上调,ROS和癌胚FN mRNA表达亦上调,培养液中醛固酮浓度升高(P<0.05)。高糖可促进MR蛋白发生核转位,定量分析显示高糖组胞质/胞核荧光强度比值较正糖组降低30%(P<0.05)。与高糖组比较,高糖+依普利酮组ROS及癌胚FN mRNA表达下调(P<0.05)。结论高糖负荷可通过激活HMC局部醛固酮自分泌环而导致HMC损伤。     

心肌细胞肥大过程中心脏发育相关转录因子及下游心脏肥大标志基因的时序性表达规律研究

目的 观察在心肌细胞肥大过程中心脏发育相关转录因子及下游心脏肥大标志基因时序性表达规律,为心肌肥大机制研究提供线索.方法 用异丙肾上腺素(ISO)干预心肌细胞,用CCK-8、细胞计数仪、免疫组化分别检测细胞存活率、细胞直径及表面积,用RT-PCR、Western blotting分别检测相关基因mRNA及蛋白表达水平.结果 用ISO成功构建心肌细胞肥大模型.ISO干预后,GATA结合蛋白4(GATA4)、肌细胞增强因子2C(MEF2C)、GATA5、脑钠肽(BNP)、心房利钠因子(ANP)于24h开始升高,P300、α-肌球蛋白重链(α-MHC)、T-框蛋白5(TBX5)于12h开始升高,血清应答因子(SRF)、β-MHC mRNA于6h开始升高(P＜0.05);其中GATA4、d-MHC、β-MHC、SRF、P300 mRNA表达呈先升后降的趋势,至干预72h GATA4、SRF、α-MHC、β-MHC、P300 mRNA表达仍高于正常(P＜0.05),而MEF2C降至正常(P＞0.05);GATA5、TBX5、ANP、BNP mRNA表达与对照组相比持续升高(P＜0.05),而NKX2.5 mRNA(P＞0.05)无明显变化.ISO干预48h后,GATA4蛋白表达水平升高,HEY2蛋白表达水平降低(P＜0.05).结论 在心肌细胞肥大过程中,MEF2C的时序表达规律与心脏发育过程相似,而GATA4、GATA5、SRF、TBX5的时序性表达规律与心脏发育过程不完全一致,提示其在心肌细胞肥大由代偿转为失代偿过程中的重要作用.同时GATA4、MEF2C、SRF与乙酰化酶P300的时序性表达规律相似,提示在心肌细胞肥大过程中其时序性表达可能受P300调控.     

131^I-FIAU在不同载体介导的HSV1-tk转导心肌细胞中的实验研究

目的为以单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因（HSV1-tk）为报告基因的核素心脏显像寻找合适的载体并提供依据。方法以胶原酶单次消化法获得乳鼠原代心肌细胞，分别应用重组腺病毒Ad5-HSV1-tk（Ad5-tk）和脂质体lipofectamine^TM2000包裹的重组质粒pDC316-tk（pDC316-tk／lipoplex）将报告基因HSV1-tk转导入细胞，以空载体腺病毒作为对照；采用Iodogen固相氧化法对特异性报告探针氟-碘阿糖呋喃基脲嘧啶（FIAU）进行131^I标记，经Sep-Pak C18反相色谱层析柱纯化后，测定标记物的标记率和放化纯；比较各组细胞对131^I-FIAU的摄取情况，并应用半定量反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫细胞化学方法，在mRNA和蛋白质水平检测不同载体介导HSV1-tk转导心肌细胞后HSV1-tk的表达。结果131^I-FIAU的标记率为（53．82±2．05）％，放化纯为（94．85±1．76）％，标记物在体外稳定存在；转导后5h，Ad5-tk感染组和pDC316-tk／lipoplex转染组对131^I-FIAU的摄取率分别为（12．55±0．37）％、（2．09±0．34）％，且各时间点摄取率前者均明显高于后者（t=12．978～38．253，P均〈0．01）；2种载体介导心肌细胞转导后24h，RT—PCR即可检测到HSV1-tk mRNA的表达，且Ad5-tk感染组的表达水平明显高于pDC316-tk／lipoplex转染组（3．11±0．14与1．60±0．05，t=17．663，P〈0．01）；免疫细胞化学检测中二者阳性率分别为（81．70±0．40）％、（22．06±0．32）％，差异有统计学意义（t=23．237，P〈0．01）。结论腺病毒载体介导HSV1-tk感染心肌细胞的效率和对标记探针的摄取率均明显高于脂质体介导组，其可做为活体报告基因心脏显像的载体，可得到更为清晰的显像图。     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体mRNA和蛋白表达的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对肺泡巨噬细胞Toll 样受体(toll-like receptor,TLR2/4)基因和蛋白的影响,为探讨骨髓MSCs移植对早期炎症介质的影响及炎症级联反应的调控机制做铺垫。 方法 巨噬细胞分为PBS对照组、骨髓MSCs对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对照组和LPS+骨髓MSCs处理组,各组均取1,3,6,12 h时相点。流式细胞仪检测骨髓MSCs表面标记阳性细胞率和巨噬细胞TLR2/4蛋白的表达;RT-PCR方法检测各组不同时相点巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达变化;ELISA法检测各组不同时相点上清液中TNF-α浓度变化。 结果 与PBS对照组、骨髓MSCs对照组比较,LPS对照组巨噬细胞TLR2/4mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.01),1h时开始增高,12h时达到峰值;同时TNF-α浓度也明显增高(P＜0.01),6h时TNF-α浓度达到峰值。与LPS对照组比较,LPS+ MSCs组巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达降低(P＜0.01),TNF-α浓度也降低(P＜0.01)。 结论 LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达升高,TNF-α浓度也升高,后者峰值时间出现略早,说明TLR2/4表达与TNF-α之间存在一个正反馈环;骨髓MSCs可以明显降低LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达及TNF-α浓度,说明骨髓MSCs打破了上述正反馈环。     

病毒感染心肌细胞的心肌肌凝蛋白重链基因表达和细胞力学

目的：探讨病毒直接损伤心现细胞的机制。方法：采用柯萨奇B3病毒感染体外培养心现细胞，检测心肌细胞收缩力以及心肌细胞的α－MHC和β－MHC的基因表达，并与正常心肌细胞相对比。结果：柯萨奇B3病毒感染后的心肌细胞收缩力比正常心肌细胞的心肌收缩力明显降低（P＜0．01），并且感染后24h比12h下降更为显著（P＜0．05），心肌细胞收缩蛋白α－MHC和β－MHC的基因表达也发生了改变，阿萨奇B3病毒感染后心肌细胞的α－MHC基因表达明显降低，而β-MHC基因表达升高，结论：柯萨奇B3病毒感染后的心肌细胞收缩力下降，使心肌细胞以α－MHC基因表达为主转向以β－MHC基因表达为主。