转染Smac对肝癌细胞凋亡的影响

目的探讨过表达Smac基因对人肝癌HepG2细胞凋亡、细胞周期及凋亡相关蛋白Survivin、半胖氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表达的影响。方法从人K562细胞中扩增Smac cDNA,构建含Smac cDNA的真核表达载体pEGFP-C1-Smac,并转染人肝癌细胞HepG2。流式细胞仪检测分析细胞凋亡百分率,凋亡相关蛋白Survivin、Caspase-3的表达及细胞周期。结果转染Smac基因组、转染空载体组、未转染组细胞凋亡率差异有统计学意义（P〈0.05）。转染Smac基因组细胞凋亡率高于未转染组,也高于转染空载体组细胞,差异均有统计学意义（P〈0.05）。转染Smac基因组细胞Survivin的表达显著高于未转染组,也显著高于转染空载体组细胞,差异均有统计学意义（P〈0.05）。未转染组、转染空载体组、转染Smac基因组中Caspase-3蛋白表达差异无统计学意义（P〉0.05）。未转染组、转染空载体组、转染Smac基因组HepG2细胞的G0/G1期、S期、G2/M各期细胞比例差异无统计学意义（P〉0.05）。结论过表达Smac可诱导人肝癌HepG2细胞凋亡率增加,促进细胞凋亡。     

STC 1 过表达抑制人宫颈癌CaSki 细胞增殖

目的研究STC1基因对人宫颈癌CaSki细胞增殖及周期的影响。方法 CaSki细胞分为3组：实验组转染pcDNA3.1（＋）-STC1质粒;空载体转染pcDNA3.1（＋）空载体;空白对照组不加任何干扰。挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及Western blot检测细胞中STC1基因表达水平;MTT法检测转染STC1基因对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测转染STC1基因后细胞周期的变化。结果稳定转染后,与空载体组相比,实验组STC1基因的表达水平显著提高（P﹤0.01）,CaSki细胞存活率下降（P﹤0.05）,G1期细胞比例显著上升（P﹤0.05）,细胞出现G1期阻滞。结论 STC1基因与CaSki细胞增殖相关,其高表达引起的宫颈癌细胞增殖速度降低可能与其所致的细胞G1期延长有关。     

Notch1(NICD)过表达真核载体构建及对大鼠BMSCs增殖分化的影响

目的 构建Notch1(NICD)过表达真核载体,探讨其对大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenehymal stem cells,BMSCs）增殖分化的影响。方法 以大鼠BMSCs为研究对象,构建Notch1(NICD)过表达真核载体,将pEGFP-N1-NICD质粒转染BMSCs,实验分为空白对照CON组、空载体组和转染组,转染48h后观察细胞一般形态,Realtime PCR和Western blotting检测NSE、GFAP 和Notch1基因和蛋白表达,流式检测转染后细胞凋亡和细胞周期情况;MTT检测增殖情况。结果 经DNA测序结果,重组质粒pEGFP-N1-NICD编码序列与设计完全一致,转染48h后转染组和空载体组的BMSCs均可表达绿色荧光。转染组Notch1、GFAP基因相对表达量显著高于空载体组和CON组（P＜0.05）,Western blotting检测结果与之类似。转染48h后,转染组活细胞比率及早期凋亡率、晚期凋亡率与CON组和空载体组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）;空载体组与CON组晚期凋亡率比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,转染组细胞处于G1/G0细胞比例显著高于CON组和空载体组（P＜0.01）,而处于S和G2/M期细胞比例显著低于CON组和空载体组（P＜0.01）,转染组增殖曲线值随时间逐渐低于CON组和空载体组,到第4d时显著低于CON组和空载体组（P＜0.05）。结论Notch1(NICD)过表达真核载体构建成功,高表达Notch1(NICD)基因可能在一定程度上诱导BMSCs凋亡、抑制其增殖,且表现诱导向神经胶质样细胞分化。     

分泌型丛生蛋白通过抑制线粒体自噬缓解H2O2诱导的心肌细胞损伤 #br#

目的 探讨分泌型丛生蛋白（sCLU）对心肌细胞氧化损伤的影响及其机制。方法 采用大鼠心肌细胞 H9C2。实验1分为Control组（仅更换培养基）和H2O2组（100 µmol/L H2O2处理）。实验2分为Control组、pcDNA3.1组 （转染 pcDNA3.1 对照空质粒）、pcDNA3.1-sCLU 组（转染 pcDNA3.1-sCLU 过表达质粒）、H2O2组（100 µmol/L H2O2处 理）、H2O2+pcDNA3.1 组（pcDNA3.1 对照空质粒转染 48 h 后加入 100 µmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU 组 （pcDNA3.1-sCLU 过表达质粒转染 48 h 后加入 100 µmol/L H2O2处理）。实验 3 分为 DMSO 组（加入 1% 体积分数 的 DMSO）、Mdivi-1 组（10 µmol/L 的 Mdivi-1 处理）、H2O2+DMSO 组（加入 1% 体积分数的 DMSO 处理 30 min 后加入 100 µmol/L的H2O2处理）、H2O2+Mdivi-1组（10 µmol/L的Mdivi-1处理30 min后加入100 µmol/L的H2O2处理）、H2O2+ pcDNA3.1-sCLU 组（pcDNA3.1-sCLU 过表达质粒转染 48 h 后加入 100 µmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU+ Mdivi-1组（pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48 h后加入10 µmol/L的Mdivi-1处理30 min,再加入100 µmol/L H2O2 处理）。采用MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二 醛（MDA）水平。DFCH-DA荧光探针测定细胞活性氧（ROS）水平。实时定量聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验 检测细胞中sCLU表达,Western blot法检测CLU、PINK1、Parkin和LC3蛋白表达水平。结果 （1）实验1。与Control 组比较,H2O2组细胞中sCLU mRNA、细胞培养上清中sCLU蛋白及细胞中CLU蛋白相对表达水平均降低（P＜0.01）。 （2）实验2。与Control组比较,H2O2组细胞活力、SOD水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低,细胞凋亡率、ROS水平、MDA 水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均升高（P＜0.05）;与H2O2组比较,H2O2+pcDNA3.1-sCLU组细胞活力、SOD水平、 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均升高,细胞凋亡率、ROS水平、MDA水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。（3） 实验3。与DMSO组比较,Mdivi-1组细胞活力与细胞凋亡率差异无统计学意义;H2O2+DMSO组细胞活力下降,细胞 凋亡率升高（P＜0.05）。与H2O2+DMSO组比较,H2O2+Mdivi-1组、H2O2+pcDNA3.1-sCLU组和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+ Mdivi-1 组细胞活力均升高,细胞凋亡率均下降（P＜0.05）。与 H2O2+Mdivi-1 组比较,H2O2+pcDNA3.1-sCLU 组和 H 2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组细胞活力差异无统计学意义,细胞凋亡率降低（P＜0.05）。结论 sCLU对氧化应 激条下的心肌细胞具有保护作用,其机制可能与线粒体自噬的抑制有关。     

沉默Sp5对mEPMCs中Wnt信号通路相关因子及增殖能力的影响

目的 探讨沉默转录因子特异蛋白5(Sp5)对小鼠胚胎腭突间充质细胞（m EPMCs）中Wnt信号通路相关因子及增殖能力的影响。方法 体外分离并培养孕14.5 d C57BL/6J小鼠的mEPMCs，细胞免疫荧光染色鉴定细胞来源；利用慢病毒转染技术沉默mEPMCs中Sp5基因的表达，Western blot验证转染效率。后续实验设空白对照组、空载病毒组、沉默组（Sp5-shRNA组）。各组细胞转染72 h后，采用Western blot及RT-qPCR法分别检测β-连环蛋白（β-catenin）、丝氨酸/苏氨酸激酶（GSK-3β）、Wnt家族成员3a(Wnt3a)、特异性周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白及m RNA的表达；CCK-8法检测细胞增殖能力；免疫荧光法检测5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）阳性细胞增殖率；流式细胞术检测细胞周期。结果 成功分离mEPMCs并沉默Sp5的表达。Western blot及RT-qPCR结果显示，Sp5-shRNA组β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白及mRNA表达水平均高于空白对照组和空载病毒组（P<0....     

β-arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞 A549的增殖影响

目的：观察外源性β-arrestin2基因对人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3 c．1-β-arrestin2质粒和空载体pcDNA3．1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western blotting检测β-arrestin2基因表达的影响。采用MTT（四甲基偶氮唑盐）法分析转染细胞的增殖情况。结果经脂质体转染和筛选,建立了稳定表达β-arrestin2基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较,转染β-arrestin2基因的细胞生长速度明显减慢（ P ＜0．05）。结论β-arrestin2基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。     

Omi/HtrA2基因表达对食管癌细胞EC9706凋亡及对耐药影响的实验研究

目的：研究凋亡促进因子Omi/HtrA2基因过表达对食管癌细胞EC9706凋亡及对耐药性的影响。方法用脂质体包裹转染人食管癌EC9706细胞,实验分为对照组、空载体组、Omi载体组、顺铂组、Omi+顺铂联合组,采用RT-PCR检测不同干预组Omi/HtrA2基因mRNA表达的变化,MTT法检测不同干预组细胞生长抑制率,流式细胞术检测不同干预组细胞的凋亡率,分析Omi/HtrA2基因蛋白表达对细胞耐药性的影响。结果①Omi/HtrA2基因mRNA在EC9706细胞中的表达：对照组为（0.113±0.009）,空载体组为（0.106±0.006）,Omi载体组为（0.436±0.021）,顺铂组为（0.196±0.013）,Omi+顺铂联合组为（0.639±0.032）,顺铂组、Omi+顺铂联合组较对照组、空载体组明显增强,差异有统计学意义（P<0.01,P=0.011,P=0.000）,对照组与空载体组比较无显著性差异（P>0.05,P=0.725）。②MTT法检测Omi/HtrA2的表达对细胞生长的抑制率：对照组为0,空载体组为2.89%,Omi载体组为27.61%,顺铂组为30.02%,Omi+顺铂联合组为48.47%,与对照组相比,Omi载体组、顺铂组、Omi+顺铂联合组均显著抑制EC9706细胞的生长,差异具有显著性（P=0.000）。③流式细胞术检测Omi/HtrA2的表达对凋亡的影响：对照组细胞凋亡率为10.76%,空载体组为13.26%,Omi载体组为38.14%,顺铂组为45.86%,Omi载体+顺铂联合组为56.64%,与对照组、空载体组比较,Omi载体组、顺铂组、Omi载体+顺铂联合干预组细胞凋亡率明显提高,差异具有显著性意义（P=0.000）。结论 Omi/HtrA2基因过表达可以明显抑制癌细胞的生长,提高癌细胞的凋亡率及癌细胞对化疗药物的敏感性,且Omi/HtrA2基因的表达与化疗药物具有协同抗癌作用。     

PD-L1过表达在DENV-2诱导血管内皮细胞自噬和凋亡中的作用机制

目的　探讨PD-L1过表达在Ⅱ型登革病毒（DENV-2）影响血管内皮细胞自噬和凋亡中的作用及机制。方法　以血管内皮细胞EAhy926为研究对象,以含梯度DENV-2（1×108~2×109 pfu/L）的无血清培养基处理细胞24 h和48 h,同时以无血清培养基处理细胞作为对照组,无血清培养基加入空白孔作为调零孔,MTT法检测细胞增殖活力。以PD-L1过表达慢病毒液和空载慢病毒液处理细胞,分别设空载对照组和转染组。DENV-2（1.2×109 pfu/L）处理细胞12、24、48 h作为DENV-2 12 h组、DENV-2 24 h组及DENV-2 48 h组,同时设置对照组（无血清培养基处理）;另以DENV-2处理空载对照组和转染组48 h,以蛋白印迹法检测LC3B、Beclin-1及Bcl-2蛋白表达变化,流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果　1×108~2×109 pfu/L DENV-2可剂量依赖性抑制EAhy926细胞增殖,DENV-2 24 h和48 h的半数抑制浓度（IC50）分别是1.8×109 pfu/L和1.2×109 pfu/L。与对照组比较,DENV-2 12 h组、DENV-2 24 h组及DENV-2 48 h组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调,细胞总凋亡率增加（均P＜0.05）。与空载对照组比较,转染组PD-L1蛋白表达上调（P＜0.01）。DENV-2处理48 h,与空载对照组相比,转染组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调,细胞总凋亡率降低（均P＜0.01）。结论　DENV-2通过上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达及下调Bcl-2蛋白表达,从而诱导EAhy926细胞自噬和凋亡,而过表达PD-L1可抵抗DENV-2的诱导效应。     

表皮生长因子受体通路基因干扰与放线菌素D联合对胶质瘤生长抑制作用的研究

目的探讨靶向性表皮生长因子受体（EGFR）信号转导通路关键基因丝氨酸苏氨酸激酶（AKT）小分子干扰RNA构建体与化疗药放线菌素D（ACTD）联合对胶质瘤生长的抑制作用。方法选择AKT的siRNA靶序列构建靶向AKT的siRNA表达质粒,并以空载siRNA表达质粒为对照进行脂质体介导的小分子干扰siRNA表达质粒单独及分别与化疗药物ACTD对胶质瘤细胞C6系生长抑制作用的研究。TUNEL法分析细胞凋亡;流式细胞术分析细胞周期变化,^3H-TdR掺人法分析细胞增殖。结果与c6细胞和转染空载体的C6细胞比较,转染siRNA表达质粒组AKT表达下调72％。TUNEL法发现C6组和空载转染组几乎没有凋亡细胞,而siRNA表达质粒组的凋亡率明显增加（Χ^2=35．26,P〈0．01）;流式细胞分析发现siRNA表达载体转染后S期指数较对照细胞减少,而加入化疗药物ACTD后S期指数较对照细胞明显减少^3H-TdR掺人法发现与C6组和空载转染组比较,转染组细胞自第2天起存活率均明显下降（P〈0．01）,且加入ACTD后治疗各组之间存活率也有明显差异（均P〈0．01）;以siRNA表达载体转染组联合ACTD组减低最显著。结论靶向AKT的siRNA表达质粒联合化疗药ACTD显著抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。因此,质粒介导的siRNA表达载体为胶质瘤靶向性基因治疗与化疗药物联合可以成为胶质瘤治疗的一种新策略。     

HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（Core）真核表达载体,并研究其对人宫颈癌 HeLa细胞自噬功能的影响。方法 以 HCV复制子质粒 pJFH1为模板,PCR法扩增 HCV Core 基因片段,经纯化回收后与 PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并经测序验证其序列的正确性。转染宫颈癌 HeLa细胞,并设 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒空白对照组,通过免疫印迹法验证 HCV Core蛋白在 HeLa细胞中的表达,并用免疫荧光（IF）和免疫印迹检测自噬生物标记物微管相关蛋白 1轻链 3（LC3）的表达水平。结果 获得 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,测序结果表明构建的重组质粒序列完全正确,HCV Core重组蛋白可在 HeLa细胞中有效表达;免疫荧光和免疫印迹结果表明,HCV Core过表达细胞 LC3焦点和 LC3 Ⅱ蛋白表达水平明显增多,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞 LC3 Ⅱ水平（1.069±0.049）高于 PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组（0.776±0.047）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建了 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core 重组质粒,HCV Core 蛋白过表达可诱导 HeLa 细胞自噬。     

外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠阴茎肌源性干细胞增殖的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠阴茎肌源性干细胞体外增殖的影响。方法本试验自2020年12月至2021年6月在滕州市中心人民医院精准实验室完成。取健康雄性Wister大鼠5只, 体质量(200±50)g, 取其阴茎海绵体并采用酶消化法分离肌源性干细胞, 应用密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化。取第2代肌源性干细胞分为两组进行培养, 实验组:200 μl生长培养基+肌源性干细胞, 分别用终浓度为10 μg/L、30 μg/L、50 μg/L、70 μg/L、90 μg/L外源性碱性成纤维细胞生长因子进行干预;对照组:加入200 μl生长培养基+肌源性干细胞。分别于培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h加入四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液。应用免疫细胞化学法鉴定大鼠阴茎肌源性干细胞, MTT比色法检测细胞增殖情况。统计学方法采用独立样本t检验、Tukey检验。结果 (1)肌源性干细胞多呈Sca-1阳性反应[表达量为(79.90±1.82)%], 少数呈Desmin阳性反应[表达量为(68.60±0.72)%]。(2)两组肌源性干细胞均随培养时间的延长而明显增殖(...     

siRNA 靶向沉默 Lipocalin-2基因下调 MMP-9表达对降低人肺癌 A549细胞的侵袭、迁移能力的影响

目的：利用针对 Lipocalin-2的小干扰 RNA（siRNA）,观察 Lipocalin-2基因沉默对人肺癌 A549细胞MMP-9表达及侵袭、迁移能力的影响。方法采用 Real-time PCR 和 Western blot 检测 Lipocalin-2在3种肺癌细胞株（A549、NCI-H661、NCI-H446）及正常人支气管上皮细胞（HBE）的表达情况。设计并构建靶向 Lipocalin-2的 siRNA 转染 A549细胞,采用 Real-time PCR 和 Western blot 检测转染效率及 Lipocalin-2基因沉默对 MMP-9 mRNA 和蛋白表达的影响。Transwell 小室检测细胞侵袭能力。细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 Lipocalin-2 mRNA 和蛋白在肺癌A549、NCI-H661、NCI-H446细胞株中的表达水平均显著高于 HBE 细胞,差异有统计学意义（ P ＜0.05）。siRNA-Li-pocalin-2转染组 Lipocalin-2 mRNA 和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较,差异有统计学意义（ P ＜0.05）;siRNA-Lipocalin-2转染组 MMP-9 mRNA 和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较,差异有统计学意义（ P ＜0.05）;siRNA-Lipocalin-2转染组穿膜细胞数、平均迁移距离与阴性对照组和空载体对照组比较,差异有统计学意义（ P ＜0.05）。结论 Lipocalin-2基因沉默通过下调 MMP-9表达降低了人肺癌 A549细胞的侵袭和迁移能力。     

肿瘤易感基因101的裸鼠荷瘤实验

目的探讨胃癌细胞SGC7901中高表达的肿瘤易感基因101（TSG101）对肿瘤增殖的作用及机制。方法将不同TSG101表达水平的胃癌细胞亚系接种于裸鼠体内,观察移植瘤生长状况及相关因子的表达。结果 TSG101转染组裸鼠的移植瘤体积明显高于空质粒组与未转染组（P〈0.05）。TSG101转染组瘤组织切片中血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达明显高于空质粒组和未转染组（P〈0.05）。结论 SGC7901细胞中高表达的TSG101可能通过上调VEGF的表达增强胃癌细胞增殖。     

人β_3-AR和PPAR-γ2基因真核表达载体及β_3-AR稳定表达细胞株的构建

目的构建高效表达人β3-肾上腺素受体(hβ3-AR)的真核细胞表达载体,为进一步研究hβ3-AR的功能以及与过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2(PPAR-γ2)调控基因之间的相互影响奠定基础。方法从人肾旁脂肪组织提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增hPPAR-γ2、hβ3-AR cDNA全长序列。将EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的hβ3-AR cDNA与同样进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR。将XbaⅠ和AflⅡ双酶切后的hPPAR-γ2cDNA与同样进行XbaⅠ和AflⅡ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2。通过限制性内切酶酶切鉴定后对DNA序列进行测序,鉴定重组质粒中hβ3-AR和hPPAR-γ2基因的完整性和可靠性。运用定点诱变方法,对野生型hPPAR-γ2和hβ3-AR质粒进行定点诱变,构建Pro12Ala突变的hPPAR-γ2和Trp64Arg突变的hβ3-AR的pcDNA3·1(+)载体,电穿孔法将人hβ3-AR重组表达载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR(突变型和野生型)转染到SH-SY5Y细胞中,用G418筛选获取稳定转染细胞株,并用RT-PCR、Western blot方法进行鉴定。结果酶切和测序分析显示重组质粒构建正确,并在转染的SH-SY5Y细胞中获得hβ3-AR的高效表达。结论成功克隆了人PPAR-γ2、β3-AR基因全长cDNA,并成功构建了人野生型和突变型的hPPAR-γ2和hβ3-AR的真核表达重组体〔pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2和pcDNA3·1(+)/hβ3-AR〕。成功获得了稳定表达hβ3-AR基因的SH-SY5Y细胞株。