靶向P75NTR的siRNA技术诱导U251胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的:利用靶向P75神经营养因子受体(P75NTR)基因的小干扰(siRNA)技术诱导胶质瘤凋亡.方法:利用脂质体介导P75NTR-siRNA质粒转染U251胶质瘤细胞系,RT-PCR方法检测P75NTR的mRNA表达以确定基因沉默效果,绘制细胞生长曲线,原位细胞凋亡实验检测细胞凋亡情况,Western blot方法检测稳定转染后第3天时P75NTR、促凋亡基因Caspase-3和凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表达.结果:转染P75NTR siRNA质粒后U251细胞P75NTR的mRNA表达水平显著下降,细胞增殖能力下降,凋亡细胞数量增加.与对照组和空载组比较,P75NTR与Bcl-2在RNAi组蛋白表达水平显著降低,Caspase-3则明显升高.结论:靶向P75NTR的siRNA技术可通过调控凋亡相关基因表达机制诱导胶质瘤细胞凋亡.     

bFGF小分子干扰RNA诱导胶质瘤U251细胞凋亡作用的研究

目的:初步探讨以小分子干扰RNA沉默碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导胶质瘤细胞系U251凋亡的机制.方法:将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组,按4×105个细胞每孔接种于6孔细胞培养板,培养24h后,空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有bFGF小分子干扰RNA(siRNA)的重组腺病毒(rAd5-bFGF)转染,转染72h后检测各组细胞的凋亡及细胞周期变化情况及其相关蛋白的表达.结果:与正常对照组、空载体组比较,实验组U251细胞经转染bFGF-siRNA后出现了明显的细胞凋亡(P<0.05),但细胞周期未见变化(P>0.05);Western blot结果显示,实验组U251胶质瘤细胞经转染bFGF-siRNA 72 h后,bFGF蛋白表达明显降低,同时STAT3及Bcl-2蛋白表达降低,Bax及Caspase-3蛋白表达增强.结论:bFGF小分子干扰RNA能够诱导U251细胞凋亡,其作用可能是通过调节STAT3信号转导通路实现的.     

RNAi沉默PRDX Ⅲ基因表达诱导U251胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的探讨RNAi沉默PRDXⅢ基因表达诱导U251胶质瘤细胞凋亡。方法设计合成针对PRDXⅢ的siRNA,脂质体介导转染人U251多形胶质母细胞瘤细胞,RT-PCR法检测转染后24 h PRDXⅢmRNA的表达水平,Western-blotting检测转染后48 h PRDXⅢ蛋白的表达水平,筛选出有效的干扰序列;流式细胞仪、DNAladder、PI染色检测转染后48 hU251细胞的凋亡状况,MTT检测转染后48 h U251细胞的生长抑制率。结果 RT-PCR、Western Blotting检测显示空白对照组、空载体组和无关序列组PRDXⅢmRNA表达无明显变化,干扰序列1、3使PRDXⅢmRNA的表达明显降低。DNA ladder显示干扰组出现明显梯形电泳条带,空白对照组、空载体组和无关序列组细胞未见明显梯形电泳条带。PI染色结果显示空白对照组,空载体组和无关序列组细胞未见明显凋亡,而干扰组细胞核的染色质高度浓染,部分细胞核裂解为碎块,符合凋亡形态学的改变。FCM检测结果显示干扰组细胞凋亡率明显高于空白对照组、空载体组、无关序列组（P〈0.01）。MTT检测干扰组对U251细胞生长的抑制率为44.4%,明显减慢了细胞生长（P〈0.01）。结论 RNAi技术成功地抑制了U251细胞中PRDXⅢ基因的表达,并诱导U251细胞凋亡,表明PRDXⅢ基因与胶质瘤的凋亡有关,PRDXⅢ基因有可能成为胶质瘤基因治疗的靶基因。     

pten基因对人胃癌BGC823细胞PI3'K/AKT耐药通路的影响

目的:研究外源性pten基因转染对人胃癌BGC823细胞PI3'K/AKT耐药通路的影响。方法:以无内源性pten表达的人胃癌BGC823细胞株转染PEAK8空载质粒和PEAK8-pten质粒,给予足叶乙苷和阿霉素诱导,RT-PCR方法分析目的基因的表达,免疫沉淀后Western-blot检测AKT活性。结果:RT-PCR显示转染pEAK8-pten质粒组有pten强表达。pten基因的导入对化疗药诱导的AKT活性有抑制作用。结论:pten基因转染能抑制人胃癌BGC823细胞体外生长,促进凋亡,并通过抑制AKT活性加强化疗药物的疗效。     

TREM-1siRNA对内毒素刺激巨噬细胞杉RAW264．7分泌炎性因子影响

目的探讨靶向小鼠髓样细胞触发受体1（triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1）的小分子干扰RNA（small inter-feting RNA,siRNA）在体外对内毒素刺激小鼠巨噬细胞株RAW264．7分泌肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白纽胞介素1p（interleukin1B,IL-1β）的抑制作用。方法合成1条靶向小鼠TREM-1分子的siRNA序列,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告因子,荧光显微镜观察EGFP的荧光强度,验证siRNA序列的干扰率。以pLKO1-1为载体构建针对TREM-1的pLKO1．1-TREM1-shRNA干扰质粒。将小鼠巨噬细胞株RAW264．7分为4组：空白组;内毒素组（LPS组）;空质粒组（pLKO1．1组）：采用脂质体法将pLKO1．1转染细胞;干扰组（siRNA组）：将pLKO1．1-TREM1-shRNA转染细胞;转染72h后用内毒素刺激24h,并以实时定量PCR分别检测TREM．1、TNF-α与IL-1β的表达;以ELISA分别检测上清液中TNF-α、IL-1β含量。结果与LPS组比较,siRNA组中TREM．1、TNF—α、IL-1β的mRNA显著下降（P〈0．01）,上清液中TNF-α、IL-1β含量明显降低（P〈0．01）。结论小分子干扰RNA可能通过抑制TREM-1基因的表达而减少内毒素诱导小鼠巨噬细胞264．7中TNF-α、IL-1β的分泌。     

外源性p16基因治疗鼠C6脑胶质瘤的体内实验研究

目的 研究p16基因抑制脑胶质瘤生长的作用。方法 将p16基因表达缺失的大鼠C6胶质瘤细胞（对照组）和转染外源性p16基因的C6细胞（转染组）种植于SD大鼠右侧尾状核，荷载C6脑前质瘤鼠用p16cDNA原位治疗（治疗组），并以空载体治疗作为对照（空载组）每组10只，观察各组大鼠一般情况。生存期，MRI动态变化及病理改变，通过原位杂交及免疫组化染色检测肿瘤p16mRNA及蛋白表达，以AgNOR平均计数检测增殖活性，以Tunel法检测细胞凋亡。除治疗组1只尚有残留外，余瘤体消失，转染组和治疗组肿瘤细胞增有p16mRNA蛋白表达，且增殖活性下降，但凋亡不增加。结论 转染外源性p16基因后的C6胶质瘤细胞致瘤性显著降低，且对荷载脑胶质瘤鼠具有明显的治疗作用。有可能成为恶性胶质瘤基因治疗的优选靶之一。     

转染Smac对肝癌细胞凋亡的影响

目的探讨过表达Smac基因对人肝癌HepG2细胞凋亡、细胞周期及凋亡相关蛋白Survivin、半胖氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表达的影响。方法从人K562细胞中扩增Smac cDNA,构建含Smac cDNA的真核表达载体pEGFP-C1-Smac,并转染人肝癌细胞HepG2。流式细胞仪检测分析细胞凋亡百分率,凋亡相关蛋白Survivin、Caspase-3的表达及细胞周期。结果转染Smac基因组、转染空载体组、未转染组细胞凋亡率差异有统计学意义（P〈0.05）。转染Smac基因组细胞凋亡率高于未转染组,也高于转染空载体组细胞,差异均有统计学意义（P〈0.05）。转染Smac基因组细胞Survivin的表达显著高于未转染组,也显著高于转染空载体组细胞,差异均有统计学意义（P〈0.05）。未转染组、转染空载体组、转染Smac基因组中Caspase-3蛋白表达差异无统计学意义（P〉0.05）。未转染组、转染空载体组、转染Smac基因组HepG2细胞的G0/G1期、S期、G2/M各期细胞比例差异无统计学意义（P〉0.05）。结论过表达Smac可诱导人肝癌HepG2细胞凋亡率增加,促进细胞凋亡。     

苦参碱对大鼠胶质瘤模型的作用的实验研究

目的：研究C6胶质瘤细胞在大鼠脑内成瘤后，苦参碱对其作用。方法：采用脑立体定向术建立胶质瘤大鼠模型，通过TUNEL及免疫组织化学方法捡测苦参碱对胶质瘤大鼠模型肿瘤细胞的作用。结果：TUNEL及免疫组织化学Fas表达结果均显示在空白对照组与阴性对照组差异无统计学意义（P〉0．05）；低剂量组高于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（P〈0．01）；高剂量组高于低剂量组、阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：苦参碱具有诱导体内胶质瘤细胞凋亡的作用，可能是通过增加Fas的表达来实现的。     

Notch1(NICD)过表达真核载体构建及对大鼠BMSCs增殖分化的影响

目的 构建Notch1(NICD)过表达真核载体,探讨其对大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenehymal stem cells,BMSCs）增殖分化的影响。方法 以大鼠BMSCs为研究对象,构建Notch1(NICD)过表达真核载体,将pEGFP-N1-NICD质粒转染BMSCs,实验分为空白对照CON组、空载体组和转染组,转染48h后观察细胞一般形态,Realtime PCR和Western blotting检测NSE、GFAP 和Notch1基因和蛋白表达,流式检测转染后细胞凋亡和细胞周期情况;MTT检测增殖情况。结果 经DNA测序结果,重组质粒pEGFP-N1-NICD编码序列与设计完全一致,转染48h后转染组和空载体组的BMSCs均可表达绿色荧光。转染组Notch1、GFAP基因相对表达量显著高于空载体组和CON组（P＜0.05）,Western blotting检测结果与之类似。转染48h后,转染组活细胞比率及早期凋亡率、晚期凋亡率与CON组和空载体组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）;空载体组与CON组晚期凋亡率比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,转染组细胞处于G1/G0细胞比例显著高于CON组和空载体组（P＜0.01）,而处于S和G2/M期细胞比例显著低于CON组和空载体组（P＜0.01）,转染组增殖曲线值随时间逐渐低于CON组和空载体组,到第4d时显著低于CON组和空载体组（P＜0.05）。结论Notch1(NICD)过表达真核载体构建成功,高表达Notch1(NICD)基因可能在一定程度上诱导BMSCs凋亡、抑制其增殖,且表现诱导向神经胶质样细胞分化。     

靶向survivin的siRNA对肝癌HepG2细胞增殖和转移能力的影响

目的探讨针对人survivin基因的siRNA对肝癌细胞HepG2的体内外抑制作用。方法合成survivin基因的RNA干涉（RNA interferance,RNAi）特异性片段,构建survivin特异性的RNA干涉载体pSiS,转染HepG2细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。细胞计数检测细胞生长情况;Western blotting检测细胞中survivin蛋白表达的变化;通过AnnexinV法染色和流式细胞术检测细胞凋亡;观察裸鼠皮下HepG2移植瘤的形成。结果成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体pSiS,获得了稳定转染的细胞HepG2／pSiS。与HepG2、HepG2／pSi（空质粒对照细胞）相比,HepG2／pSiS细胞生长曲线十分平缓,差异有统计学意义（P〈0．01）;Westernblotting显示,HepG2／pSiS细胞中survivin蛋白表达减少,细胞凋亡率增加（P〈0．01）。HepG2／pSiS移植瘤形成明显受到抑制。结论Survivin特异性siRNA可明显促进肝癌细胞HepG2的凋亡,抑制该肿瘤细胞体外生长和体内移植成瘤。     

Pim-3基因转染对心肌缺氧／复氧损伤的保护作用

目的：克隆原癌基因Pim-3并构建其GFP表达质粒，探讨Pim-3对心肌细胞遭受缺氧／复氧损伤时所起的保护作用。方法：采用RT-PCR从Wistar大鼠心肌组织中提取并克隆Pim3基因，经酶切和连接反应构建GFP表达质粒，分别为pEGFP-N2-Pim-3质粒和pEGFP-N2（空载质粒），经脂质体转染人原代培养的心肌中，随机分为七组，分别为对照组、对照＋pEGFP-N2组、对照＋pEGFP-N2-Pim-3组、缺氧复氧损伤组、缺氧复氧损伤＋pEGFP-N2组、缺氧复氧损伤＋pEGFPN2-Pim-3组、缺氧预适应处理组。实验结束时全自动生化仪检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、四唑盐（MTT）比色试验测定细胞存活率、TUNEL法与P1-An-nexin V法测定心肌细胞凋亡、流式细胞仪测定心肌细胞线粒体膜电位（△ψm），并且测定Pim-3 mRNA及蛋白表达水平（RT-PCR、Western-blotting法）的改变。结果：经酶切证实和测序鉴定，成功克隆大鼠Pim-3基吲，并且细胞转染效率达15％；在缺氧复氧损伤后，pEGFP-N2-Pim-3转染组较pEGFP-N2转染组／未转染组的LDH值明显降低（p〈0．01），细胞存活率则明显升高（P〈0．01），凋亡细胞明显减少（P〈0．01），线粒体膜电位（△皿m）则明显升高（P〈0．01）；电镜结果表明转染了pEGFP-N2-Pim-3的心肌细胞线粒体膜大都完整，嵴清晰，较之pEGFP-N2转染组／未转染组损伤明显减轻；RT-PCR和Western-blotting结果显示，Pim-3在正常组几乎不表达，缺氧复氧损伤组明显升高（p〈0．01），缺氧预处理组的表达则比缺氧复氧损伤组更为升高（P〈0．05）。结论：外源性Pim-3基因转染人心肌细胞，对心肌细胞的缺氧／复氧损伤具有明显的保护作用。     

has-miR-181b慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建靶向has-miR-181b基因的慢病毒表达载体。方法根据has-miR-181b序列设计互补的单链寡核苷酸引物序列进行退火延伸后连入经双酶切的pGCSIL-GFP载体质粒,与辅助元件载体质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0共同导入感受态细胞T293进行慢病毒包装,收集、浓缩并测定病毒滴度。用所得病毒转染U87胶质瘤细胞;实时定量PCR检测转染后miR-181b表达,流式细胞术检测细胞凋亡以及Transwell实验评价细胞侵袭能力的改变。结果目的序列成功连接入载体,测序分析证实目的序列载体构建成功,并测得病毒滴度为6×109 TU/ml;病毒转染U87胶质瘤细胞能够显著上调has-miR-181b表达,该病毒载体能够有效诱导胶质瘤细胞凋亡,显著抑制U87细胞的侵袭性。结论成功建立高效稳定表达has-miR-181b的慢病毒转染系统,体外实验中能够有效诱导U87胶质瘤细胞凋亡,并且可以抑制胶质瘤的侵袭能力。     

Construction and identification of lentiviral vector carrying has-miR-181b

目的 构建靶向has-miR-181b基因的慢病毒表达载体.方法 根据has-miR-181b序列设计互补的单链寡核苷酸引物序列进行退火延伸后连入经双酶切的pGCSIL-GFP载体质粒,与辅助元件载体质粒pHelper1.0及pHelper 2.0共同导人感受态细胞T293进行慢病毒包装,收集、浓缩并测定病毒滴度.用所得病毒转染U87胶质瘤细胞;实时定量PCR检测转染后miR-181b表达,流式细胞术检测细胞凋亡以及Transwell实验评价细胞侵袭能力的改变.结果 目的序列成功连接入载体,测序分析证实目的序列载体构建成功,并测得病毒滴度为6×109TU/ml;病毒转染U87胶质瘤细胞能够显著上调has-miR-181b表达,该病毒载体能够有效诱导胶质瘤细胞凋亡,显著抑制U87细胞的侵袭性.结论 成功建立高效稳定表达has-miR-181b的慢病毒转染系统,体外实验中能够有效诱导U87胶质瘤细胞凋亡,并且可以抑制胶质瘤的侵袭能力.     

大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应

目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组)。RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况。结果与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P<0.01或P<0.05)。结论成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体。其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加。     

survivin特异性RNAi表达载体的构建及其干扰效果鉴定

目的构建survivin基因的RNAi真核表达载体并观察其对转染腺样囊性癌细胞株ACC-2后survivin表达变化以及对细胞凋亡的影响。方法设计、合成siRNA（small interfering RNA）,构建表达载体pGenesibshRNA-survivin,将重组质粒导入人腺样囊性癌ACC-2细胞株。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测转染后的ACC-2细胞中survivinmRNA表达的变化,用TUNEL检测细胞凋亡的变化。结果经测序模版序列和设计序列完全正确,在pGenesil—shRNA-survivin转染ACC-2细胞株中,survivinmRNA表达明显降低,转染的ACC-2细胞凋亡显著增加。结论成功构建了survivin基因的RNAi真核表达载体,且其对腺样囊性癌细胞有一定的干扰效果。     

反义IGF—1抑制脑胶质瘤体内外增殖的实验研究

目的：明确IGF－1在肿瘤发生发展中的作用,为基因治疗优选靶的。方法：（1）转染含反义IGF－1cDNA的表达型质粒至鼠C6胶质瘤细胞,对比转染前后细胞IGF－1的表达、增殖活性等变化。（2）对Wistar大鼠－C6胶质瘤动物模型实施反义IGF－1基因治疗,对比治疗与否肿瘤大小、IGF－1表达、淋巴细胞浸润等的差别。结果：（1）含反义质粒的C6细胞系IGF－1表达减低,增殖活性下降约35％。（2）反义IGF－1治疗后的肿瘤8周内完全消失,而对照组持续增大,治疗组肿瘤的凋亡细胞、淋巴细胞浸润增加,IGF－1表达、细胞增殖活性下降,结论：反义IGF－1基因转染能有效抑制C6胶质瘤的体内外增殖,增殖活性下降和免疫系统攻击可能是双重原因。     

锌指蛋白185 对胶质瘤细胞增殖影响的研究

目的 探讨锌指蛋白 ZNF185 在人脑胶质瘤细胞增殖中的作用。方法 标本取自 2011 年 1 月-2013 年12 月于唐山市工人医院就诊, 经病理确诊为胶质瘤患者的肿瘤组织, 以瘤旁组织作对照。提取不同组织总蛋白,Western-blot 检测 ZNF185 的表达。提取瘤旁组织总 RNA, 反转录扩增 ZNF185 编码序列并克隆至 pEGFPC2 质粒,构建 ZNF185 表达载体。采用 Lipofactamine2000 将 ZNF185 表达载体转染人胶质瘤细胞系 SF767, 以转染 pEGFPC2空载体细胞作为对照。采用流式细胞仪检测细胞周期变化; MTT 法检测细胞增殖活性。结果 与瘤旁组织相比,ZNF185 在人脑胶质瘤组织中表达显著降低（P < 0.01）; 转染 ZNF185 表达载体的胶质瘤细胞与对照细胞比ZNF185 的表达显著增加（P < 0.01）; 过表达 ZNF185 导致 SF767 细胞 G0~G1 期细胞比例显著增加（P < 0.05）, 而 S期细胞比例减少（P < 0.05）。同时, 过表达 ZNF185 也导致 SF767 细胞的增殖速度显著降低（P < 0.05）。结论ZNF185 在人脑胶质瘤细胞中发挥抑制细胞增殖的作用。     

siRNA沉默PKM2抑制胶质瘤U87细胞的增殖和糖代谢能力

目的探讨小分子RNA干扰(siRNA)沉默M2型丙酮酸激酶(PKM2)基因表达对人脑胶质瘤U87细胞增殖和代谢的影响。方法合成PKM2siRNA并转染胶质瘤U87细胞,靶向抑制PKM2表达;将未转染和转染无义siRNA的细胞分别作为空白组和阴性对照组。MTT法检测U87细胞增殖,葡萄糖和乳酸检测试剂盒检测培养基代谢物。结果 PKM2siRNA能有效抑制U87细胞PKM2表达。下调PKM2表达后,细胞增殖能力受到明显抑制,同时葡萄糖消耗量和乳酸生成量也显著下降。结论干扰PKM2表达可显著抑制胶质瘤的增殖和代谢能力,可作为胶质瘤治疗的潜在靶点。     

OCCLUDIN对非小细胞肺癌SPC-A1细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的 探讨OCCLUDIN对非小细胞肺癌细胞SPC-A1增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法 培养非小细胞肺癌细胞SPC-A1,通过siRNA转染干扰OCCLUDIN表达,实验中分为空白对照组（control组）、空转组（siCtrl组）和 siRNA转染组（siOCLN组）。采用 CCK-8、流式细胞术和 Western blot检测 OCCLUDIN对 SPC-A1细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果 siOCLN 组细胞在 24、48、72、96 和 120 h 的增殖能力较 control 组和 siCtrl 组均明显降低（P＜0.05）。siOCLN 组细胞凋亡率高于 control 组和 siCtrl 组（P＜0.05）;siOCLN 组 Bax、caspase-3、caspase-9、AIF和 Cyt C等凋亡相关蛋白水平较control组和siCtrl组表达明显升高（P＜0.05）,而抗凋亡蛋白Bcl-2水平较control组和siCtrl组表达明显下降（P＜0.05）。同时,siOCLN组 AKT和 PI3K蛋白磷酸化水平较 control组和 siCtrl组明显降低（P＜0.05）。结论 OCCLUDIN可能通过调控PI3K/AKT信号通路促进SPC-A1细胞的增殖和抑制凋亡。     

靶向血管内皮生长因子和神经生长因子的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的利用RNA干扰（RNAi）技术，构建靶向血管内皮生长因子（VEGF）、神经生长因子（NGF）双基因的短发夹RNA（short hairpin，shRNA）真核表达载体用于胶质瘤基因治疗。方法分别设计并体外合成靶向基因VEGF、NGF的特异性编码shRNA序列的寡核苷酸，克隆到经BglⅡ—HindⅢ酶切线性化的pSUPER质粒H1启动子下游，构建shRNA重组质粒，进而脂质体介导瞬时转染胶质瘤细胞系U251，半定量RT-PCR检测VEGF mRNA、NGF mRNA表达。结果重组质粒经过酶切鉴定和测序，插入片段的序列大小、位点和方向均与已合成的寡核苷酸的序列完全一致，在瞬时转染胶质瘤细胞后下调了VEGF mRNA、NGF mRNA的表达。结论成功构建靶向基因VEGF、NGF的shRNA真核表达载体，为进一步应用RNAi技术，研究其对胶质瘤的抑制作用奠定基础。