菊欧氏杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶celY基因在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

以菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增了该菌的β-1,4-内切葡聚糖酶celY基因及其调控元件并克隆至pUC19载体。测序结果经分析,该基因编码的蛋白序列与菊欧氏杆菌Ech586的β-1,4-内切葡聚糖酶同源性达到98%。将celY的开放阅读框基因插入到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),采用LB-CMC平板刚果红染色筛选含celY基因的转化子。12%SDS-PAGE显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,其相对分子质量与预期结果相符。CMCase活力测定显示重组pET-28a-celY阳性菌分泌到培养基中的CelY酶活力为84.4 U/L,周质中的酶活力为12.7 U/L。β-1,4-内切葡聚糖酶CelY工程菌的获得,为研究菊欧氏杆菌纤维素酶基因在菊欧氏杆菌同源转化中的表达及工程菌的酶学特性提供了重要的资料。     

Persephin基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :获取Persephin(PSP)基因并实现其高效表达。 方法 :利用PCR方法以染色体DNA为模板 ,扩增编码人PSP成熟蛋白的基因片段 ,将其克隆于 pUC19质粒 ,进行序列分析 ,将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA并进行表达。结果 :序列分析结果与文献报道一致 ,表达的hPSP占菌体总蛋白质 15 %左右。结论 :人PSP基因在大肠杆菌Top10中获得了高效、稳定表达 ,为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础。     

变链菌F-ATP酶β亚基基因的克隆与F-ATP酶活性分析

目的分析变链菌F-ATP酶β亚基基因的克隆片段对转化后大肠杆菌的F-ATP酶活性的影响.方法采用PCR方法,以变链菌基因组DNA为模板扩增F-ATP酶β亚基5'末端序列,将克隆片段与载体pVA891酶切后连接,形成重组质粒;并转化大肠杆菌,对转化后大肠杆菌的F-ATP酶活性进行初步分析.结果变链菌F-ATP酶β亚基基因的克隆片段通过构建重组质粒转化进入大肠杆菌,转化后大肠杆菌的F-ATP酶活性与未转化的亲代菌株进行比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论本研究从基因的角度进一步论证了F-ATP酶β亚基基因对细菌F-ATP酶活性具有影响.     

利用增强型绿色荧光蛋白基因作筛选标记克隆载体的构建及鉴定

目的构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记的新型pUC18筛选载体。方法将EGFP基因克隆至pUC18载体的PstI/HindⅢ位点,构建筛选载体pUC18-EGFP,并验证pUC18-EGFP能否利用EG-FP的荧光特性筛选出含基因重组体的阳性克隆。结果经酶切和基因测序鉴定pUC18-EGFP载体构建正确;在外源基因插入该载体后,对LB氨苄平板上的绿色菌落进行酶切和基因测序鉴定,结果证明LB平板上的绿色菌落即为含有重组质粒的克隆。结论成功构建pUC18-EGFP筛选载体,利用EGFP的绿色荧光可筛选出阳性克隆。     

来自大肠杆菌ATCC11105菌株的青霉素酰化酶基因的克隆与表达

利用常规技术 ,将大肠杆菌 ATCC1110 5菌株基因组DNA的青霉素酰化酶基因 (pac)克隆到 p UC19载体上。利用这样构建的质粒转化的大肠杆菌菌株 JM10 9具有较高的质粒稳定性。在培养重组菌株的初始阶段添加苯乙酸(PAA) ,不仅抑制细胞的生长 ,而且降低了青霉素酰化酶(PA)的产量。虽然在所构建的质粒中不含有 PA的全部调控区域 ,但是 ,同样可以观察到葡萄糖对 PA生产的阻遏效应。借助过去资料以及实验中观察到的 PAA和葡萄糖对重组菌产生的 PA生产的影响 ,本研究讨论了 PA的调控机制。纯化了重组菌株组成型表达的 PA,发现其最佳温度…     

小鼠载脂蛋白CⅡ编码基因的克隆

目的：克隆小鼠载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）编码序列。方法：采用逆转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法扩增获得ApoCⅡ编码序列，将ApoCⅡ基因编码片段重组入质粒pUC18，得到重组克隆载体pUCl8-ApoCⅡ，进行序列测定。结果：经测序证实重组质粒pUC18-ApoCⅡ中的ApoCⅡ编码片段的序列与GenBank中的一致。结论：成功构建了含编码小鼠ApoCⅡ基因的重组克隆载体pUC18-ApoCⅡ，为基因工程生产有生物活性的ApoCⅡ、开展ApoCⅡ的免疫学测定及进一步探讨ApoCⅡ治疗高甘油三酯血症的可能性奠定了基础。     

脂联素单链抗体基因的克隆及表达

目的 克隆人脂联素单链抗体基因并进行表达。方法提取分泌抗脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA,通过RT-PCR技术,扩增VH和VL,与质粒pUC19载体连接,形成克隆,并对其进行鉴定分析。结果抗体重、轻链可变区扩增拼接后的重、轻链各约为340bp、350bp,基因全长约710bp,将拼接产物插入pUC19质粒中转化大肠杆菌JM109,得到数个克隆,经酶切分析约含710bp片段,与拼接结果基本相同,经测定特异性较好,与其他杂蛋白及载脂蛋白没有交叉反应。结论抗人脂联素单链抗体基因的克隆和表达较为成功。     

丙型肝炎病毒基因免疫重组真核表达质粒构建的初步研究

目的:利用真核表达载体pCDNA3.1(+)与HCV核心区基因重组,为进一步表达蛋白打基础。方法:首先从1例HCV感染者血清中用反转录-PCR法获得全长的核心区基因并测序,继而将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建重组体。结果:HCV核心区基因为HCV型,将其克隆到原核表达载体pQE-30上并使之在大肠杆菌中得到表达,分子量为22KD,表达量占菌体蛋白的8.7%。然后将核心区基因与真核表达载体pCDNA3.1(+)重组,构建了pCDNAHCVc191和pCD-NAHCVc-hIL2两种重组体。结论:pCDNAHCVc191和pCDNAHCVc-hIL2两种重组体,尤其后者是核心区基因与人白介素-2基因融合,可引发更好的基因免疫效果。上述工作奠定了整个HCV基因免疫研究的基础。     

打靶载体pIJ792的构建

目的利用pIJ790,pIJ773和pUC19等基本质粒,构建金色链霉菌基因打靶筛选体系所需质粒pIJ792。方法以质粒pIJ790为摸板。将PCR扩增的cat基因片段插入到pMD19．T的多克隆位点,得重组质粒pFD31。EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pIJ773．其小片段与pUC19烃同样双酶切后的片段酶连克隆,得新质粒pFD32。pFD31和pFD32再分别经SacⅠ酶切,将pFD31含cat的小片段和pFD32的大片段酶连克隆,筛选得重组质粒pFD33,EcoRⅠ与HindⅢ酶切,将切下的两个小片段与pIJ773经同样双酶切后的大片段进行酶连克隆,最终得筛选质粒pIJ792。结果新质粒pIJ792的抗氯霉素能力超过150μg·mL^-1。结论pIJ792可满足金色链霉菌基因打靶的筛选需要,实现了用于金色链霉菌PCR基因打靶所需筛选体系的构建。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统Cag3基因的克隆表达及其质谱鉴定

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)Cag致病岛(Cag-PAI)编码的Cag3(hp0522)基因重组质粒,转入大肠杆菌中表达,纯化重组蛋白.方法 以Hp 11637基因组为模板,应用PCR技术扩增Cag3基因片段,克隆至pGEM-T载体中测序,然后克隆到高效表达载体pET-28a(+)上,得到了重组表达载体pET-28a(+)-Cag3,转化表达宿主菌大肠埃希菌BL21;经IPTG诱导表达后,将大量表达的重组蛋白用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化;采用串联飞行时间质谱技术对Cag3-His融合蛋白进行鉴定.结果 成功克隆了Cag3基因.经SDS-PAGE分析,表达蛋白相对分子质量与预期大小一致;质谱检测到Cag3重组蛋白的表达.结论 成功构建了Cag3基因的原核表达载体pET-28a(+)-Cag3.     

人巨细胞病毒pp65基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建人巨细胞病毒pp65基因片段毕赤酵母表达载体.  方法   PCR扩增pp651087-1515 nt,克隆于pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α.提取质粒测序鉴定后,与pPIC9K载体连接,转化DH5α,筛选阳性克隆,酶切及测序鉴定.   结果  获得了重组酵母表达载体pPIC9K-pp65,测序结果证实为pp65 1087-1515 nt基因,与基因库报道序列一致.  结论 构建得到人巨细胞病毒pp651087-1515 nt毕赤酵母表达载体.     

波形蛋白基因的构建、表达及鉴定

文章进行波形蛋白(VIM)基因重组质粒的构建,并进行表达与鉴定,为开辟新的肝癌诊断方法奠定基础。从人宫颈癌细胞(HELA)中提取总RNA并采用PR-PCR及PCR技术克隆VIM基因,经酶切连接等构建带有GST标签的PGEX-4T-1-VIM重组表达质粒,在大肠杆菌DH5α菌中扩增重组质粒,并在BL21菌中进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blotting等进行鉴定。重组及表达蛋白Vimentin的融合蛋白,为建立一种新的肝癌早期诊断方法奠定基础。     

PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.     

胆管癌相关FXYD6基因功能区在大肠埃希菌表达的初步研究

目的对胆管癌相关基因FXYD6基因的功能区进行克隆和表达,以便进一步展开该基因功能研究。方法借助生物信息学方法分析FXYD6基因,设计FXYD6基因信号肽剪切后功能区蛋白体外表达序列,并将其克隆到pBV220表达载体上,继而以大肠埃希菌为表达系统,使功能区蛋白（不含信号肽）获得体外表达。结果该基因主要功能位点位于18～95 aa。PCR扩增出剪切掉信号肽序列的功能区序列（即包含18～95 aa的肽链段）,并成功构建pBV220/FXYD6-ex基因功能区重组表达质粒克隆,其在大肠埃希菌DH5α中表达量最高,表达产物主要以包涵体形式存在。结论获得胆管癌相关FXYD6基因融合蛋白表达产物,为后续研究打下基础。     

汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中的克隆及表达

目的：在大肠埃希菌中克隆和表达汉坦病毒SEO型及HTN型S基因。方法：PCR扩增汉坦病毒SEO型L99株及HTN型Z10株S基因读码区，前者经EcoRI及XhoI双酶切，后者经SacI及XhoI双酶切，将两者定向克隆入pET32a（＋），转入感受态E．coli Top10。获取重组质粒，经PCR、双酶切及序列分析鉴定后，转入E．coli BL21感受态。经IFTG诱导表达，其产物经SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：SEO型L99株及HTN型Z10株S基因正确克隆于pET32a（＋），目的蛋白的分子质量约为67．1ku，表达量占菌体总蛋白的40％以上，Western-blot有特异性条带。结论：SEO型及HTN型汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中获得表达，为其后的应用奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白—2基因的真核表达载体构建

目的;利用杆状病毒载体,构建可直接转染昆虫细胞Sf9的含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2)基因的重组穿梭载体（bacmidDNA),最终获得重组蛋白。方法：将编码包含hBMP-2 N-端信号肽,中间前肽以及C－端成熟肽共1188bp的cDNA片断,插入真核表达载体pFastBacl的多克隆位点,受控于pPolh启动子,构建成pFastBacl/hBMP-2重组转移载体。重组子转化大肠杆菌DH10Bac。转座后、挑选阳性菌落,提取bacmid DNA,经PCR鉴定后,以重组bacmidDNA转染Sf9细胞。收集重组病毒,扩大转染Sf9,表达产物行SDS－PAGE初步鉴定。结果：获得了含hBMP-2全长cDNA片段的重组bacmid DNA和重组病毒,经SDS－PAGE证实在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白,经激光密度扫描仪扫描显示分泌性蛋白表达量占细胞蛋白总量的35．6％。结论：利用杆状病毒载体成功构建了可用于直接转染昆虫细胞而无需同源重组的重组bacmidDNA,并在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白。     

急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因异构体cDNA实时定量PCR标准品及标准曲线的构建

目的克隆急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA作为实时定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测PML-RARα融合基因的标准品,从而构建FQ-PCR检测标准曲线。方法应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从急性早幼粒白血病患者骨髓单个核细胞的总RNA中逆转录扩增的PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA,将纯化的PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA与pMD18-T载体进行连接,转化宿主菌E.coli DH5a感受态细胞,氨苄青霉素培养基筛选阳性克隆,提取重组质粒cDNA用限制性核酸内切酶HindⅢ、EcoRⅠ进行双酶切鉴定并测序分析,最后进行实时荧光定量PCR检测。通过检测重组质粒260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR标准品。结果酶切鉴定、PCR扩增及测序分析均证实PML-RARα融合基因重组到pMD18-T载体。结论成功克隆急性早幼粒白血病PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA。     

基因变构人白细胞介素-2克隆构建和原核表达

目的构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏并将其在原核系统中进行高效表达,为研究基因变构IL-2穴88N→R雪的生物学活性奠定基础。方法分离人体T细胞经PHA刺激活化后,提取细胞的RNA为模板,逆转录构建cDNA文库,经套式PCR扩增出编码IL-2的基因,插入T-A载体后获得编码天然IL-2的克隆,核苷酸测序证实成功后,自行设计含有突变位点的引物,利用重组PCR技术,进行定点诱变构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏DNA测序确认变构成功。将改构后的IL-2基因重组于原核pGEX-4T-2质粒上,转化宿主菌E.coli.DH5α中,经IPTG诱导后表达IL-2变构体,表达产物经SDS-PAGE电泳分析。结果获得了人类天然IL-2的编码基因克隆和基因变构IL-2的编码基因克隆,并将变构IL-2穴88N→R雪在大肠杆菌中获得了高效表达。结论IL-2基因的成功定点变构及其在原核生物中获得稳定高效的表达,为进一步在真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2药物奠定基础。     

一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测

通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造，构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽。该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a—T1-GFP，重组质粒在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白His-T1-GFP，经组氨酸亲和层析纯化后，用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His—T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用。经测序证实成功构建了表达型载体pET28a—T1-GFP，融合蛋白His—T1-GFP在大肠杆菌EcoliB L21（DE3）中表达率为20％。经组氨酸亲和纯化，得到纯度达85％的融合蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP，动物实验表明融合蛋白His—T1-GFP能够有效跨过血脑屏障，主要分布在大脑皮层和海马回。该研究成功地构建了-种新的穿膜肽-T1，为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础。