姜黄素改善N2a/APP695swe细胞线粒体功能和抑制细胞凋亡的作用

目的：观察姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞线粒体形态和功能及细胞凋亡的影响;探讨其可能的神经保护机制。方法：实验细胞分为4个组：N2a/APP695组（WT）、N2a/APP695swe组（APP）、溶剂对照组（DMSO,5 μmol/L）、姜黄素组（Curcumin,5 μmol/L）。流式细胞术分别检测细胞凋亡、活性氧水平和膜电位水平、免疫细胞化学检测细胞色素C的表达、电镜观察细胞线粒体形态的改变,Western blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达,分光光度检测Caspase3、Caspase9酶活性。结果：流式细胞术结果显示,Curcumin组细胞的凋亡率、活性氧水平较APP组明显降低[（0.05±0.01） vs. （0.18±0.01）,P=0.000;（49.67±4.16） vs. （197.67±8.08）,P=0.000];而Curcumin组线粒体膜电位较APP组升高[（1.00±0.03） vs. （0.64±0.03）,P=0.000]。电镜结果发现姜黄素可以减轻线粒体的肿胀,改善其形态。同时免疫细胞化学结果显示姜黄素减少了细胞色素C的释放。Western blot检测发现,与APP组相比,Curcumin组Caspase3、Caspase9蛋白的表达均降低[（0.62±0.12） vs. （1.39±0.10）,P=0.000;（0.64±0.20） vs. （1.78±0.03）,P=0.000];并且Curcumin组较APP组的Caspase3与Caspase9的活性明显降低[（0.66±0.04） vs. （2.12±0.06）, P=0.000;（0.58±0.04） vs. （0.93±0.03）, P=0.000]。结论：姜黄素能抑制N2a/APP695swe细胞的凋亡,其机制可能与改善线粒体功能有关。     

姜黄素通过提高Rab家族蛋白的表达增强N2a/APP695swe细胞的自噬作用

目的：研究姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞中自噬和Rab家族蛋白的影响,并且探讨姜黄素调节N2a/APP695swe细胞自噬的可能机制。方法：采用N2a/WT和N2a/APP695swe细胞,并将其分为4个组：N2a/WT组（WT组）、N2a/APP695swe组（APP组）、DMSO溶剂对照组（DMSO组,5 μmol/L,24 h）、curcumin处理组（curcumin组,5 μmol/L,24 h）。Western blot分别检测各组自噬标志性蛋白LC3BⅡ和底物蛋白SQSTM1的表达,以及Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7、Rab9、Rab24和Rab33B的表达;共聚焦显微镜观察免疫荧光进一步验证各组LC3BⅡ与SQSTM1蛋白的表达情况。结果：Western blot结果表示,curcumin组LC3BⅡ蛋白表达量明显高于APP组和DMSO组（0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,P=0.000）;同时,curcumin组SQSTM1蛋白表达量则明显低于APP组（0.67±0.01 vs. 1.02±0.02,P=0.000）。共聚焦显微镜观察免疫荧光实验再次验证了LC3B和SQSTM1蛋白的这种表达趋势。Western blot进一步检测发现,与APP组相比,curcumin组Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的蛋白表达量均明显增加（1.00±0.02 vs. 0.63±0.02,P=0.000;0.94±0.03 vs. 0.79±0.03,P=0.000;0.75±0.00 vs. 0.56±0.01,P=0.000;0.88±0.04 vs. 0.59±0.03,P=0.000）,而Rab9和Rab24的改变差异无统计学意义（1.04±0.02 vs. 1.06±0.02,P=0.578;0.79±0.00 vs. 0.80±0.00,P=0.067）。结论：姜黄素提高N2a/APP695swe细胞的自噬水平,其机制可能与增强Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的表达有关。     

姜黄素通过增强Rab7的表达促进N2a/APP695swe细胞中的自噬流

目的:观察姜黄素(curcumin)对稳定表达APP695swe的Neuro-2a小鼠脑神经瘤细胞(N2a/APP695swe)中自噬流的作用;再进一步深入探讨其作用于N2a/APP695swe细胞中自噬流的可能机制.方法:首先将细胞分成4组:野生型对照组(WT组)、空白对照组(Control组)、溶剂对照组(Sham组)、姜黄素组(Curcumin组).透射电镜观察各组中自噬体形态特点,Western blot检测p62和LC3Ⅱ的表达;并分别运用Western blot及免疫荧光检测Rab7蛋白表达,实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测Rab7 mRNA表达.在N2a/APP695swe细胞中分别过表达及沉默Rab7后,将细胞分成5组:Control组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-Rab7组、NC-siRNA组和Rab7-siRNA组.再运用透射电镜观察各组自噬体形态特点,Western blot检测p62和LC3Ⅱ蛋白表达.结果:经姜黄素处理后,透射电镜观察到细胞中的自噬体主要为单层膜结构的自噬溶酶体,同时,自噬活性关键性蛋白LC3Ⅱ的表达增加(P=-0.000),而自噬底物蛋白p62的表达减少(P=0.000);Rab7在蛋白水平及mRNA水平均明显升高(P=0.000、0.000).过表达Rab7后,自噬体主要为单层膜结构的自噬溶酶体,p62蛋白表达明显减少(P=0.000),LC3Ⅱ蛋白表达无明显变化(P=0.669).沉默Rab7后,自噬体主要为双层膜结构的早期自噬体形态,p62蛋白表达明显增加(P=0.000),LC3Ⅱ蛋白表达无明显变化(P=0.622).结论:姜黄素促进N2a/APP695swe细胞中的自噬流,其作用机制可能与增强Rab7表达有关.     

顺铂通过ROS促进乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的：探索顺铂（cisplatin）促进乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制的分子机制。方法：采用不同浓度的顺铂处理稳定表达HBV的HepAD38细胞,台盼蓝染色检测细胞活力,筛选出顺铂最适浓度,分别采用Real-time PCR和Southern blot检测HBV DNA水平,Western blot检测HBsAg和HBcAg蛋白表达。在顺铂诱导组加或者不加氧化应激抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）,采用CellROX Orange Reagent染料在激光共聚焦显微镜下检测细胞内ROS水平,并且检测HBV DNA 水平、HBsAg及HBcAg的蛋白水平。结果：台盼蓝染色筛选出顺铂的最适浓度为6 μmol/L。Real-time PCR实验结果显示,PBS组,0.5、2.0、6.0 μmol/L顺铂处理后HBV DNA 拷贝数/细胞分别为515.152±18.924、1 215.758±49.001（P=0.000）、1 678.182±117.223（P=0.000）、2 110.606±143.640（P=0.000）;Southern blot结果与Real-time PCR结果一致,顺铂以剂量依赖方式增加HBV DNA水平。Western blot结果表明,与PBS组相比,6.0 μmol/L顺铂组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为3.102±0.099（P=0.000）、4.001±0.200（P=0.000）;顺铂可以促进HBV复制和病毒蛋白的表达。进一步采用NAC与顺铂联合处理HepAD38细胞,Real-time PCR实验结果表明,顺铂组、顺铂+NAC组HBV DNA 拷贝数/细胞分别为2 180.444±82.573（P=0.000）、1 041.778±50.918（P=0.000）,2组差异具有统计学意义。Western blot实验结果表明,顺铂组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为3.139±0.061（P=0.000）、3.812±0.109（P=0.000）,顺铂+NAC组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量分别为2.101±0.088（P=0.000）、1.613±0.073（P=0.000）,2组之间HBsAg、HBcAg蛋白差异均具有统计学意义。结论：顺铂通过增强细胞内ROS水平,促进HBV复制,而NAC可以部分抑制顺铂刺激的HBV复制作用。     

Wnt/β-catenin/TCF-4信号通路调节livin表达在肾癌细胞增殖凋亡中的研究

目的：研究人肾癌细胞系786-0中Wnt/β-catenin/TCF-4通路与livin的关系,探索Wnt/β-catenin/TCF-4通路在肾癌细胞中的凋亡调节机制。方法：不同浓度吲哚美辛处理肾癌786-0细胞,CCK-8法检测各组细胞活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡改变;荧光定量PCR检测β-catenin、TCF-4、caspase-3及livin转录水平变化;Western blot检测β-catenin、caspase-3及livin蛋白表达水平变化。结果：随吲哚美辛浓度增加,细胞活力降低,呈剂量-效应关系（P=0.000）。流式结果显示伴随吲哚美辛浓度升高,细胞凋亡逐渐增加,25 μmol/L组、50 μmol/L组和100 μmol/L组凋亡率分别为（32.07±1.01）%、（40.03±1.95）%和（72.33±0.02）%,与对照组比较差异存在统计学意义（P=0.000,P=0.002,P=0.000）。Real-time PCR结果显示,β-catenin、TCF-4和livin相对表达水平均呈下降趋势（P=0.002,P=0.000,P=0.000）,而caspase-3相对表达呈明显上升趋势（P=0.001）。Western blot分析显示在25 μmol/L组、50 μmol/L组和100 μmol/L组中β-catenin相对表达量分别为0.568±0.020（P=0.001）、0.396±0.030（P=0.000）、0.142±0.038（P=0.000）;livin相对表达量分别为0.139±0.016（P=0.005）、0.050±0.006（P=0.000）、0.011±0.001（P=0.000）;而caspase-3相对表达量分别为0.278±0.035（P=0.046）、0.396±0.071（P=0.000）、0.518±0.015（P=0.000）。结论：吲哚美辛介导的肾癌细胞中β-catenin/TCF-4降解可能导致livin的转录抑制和caspase-3表达水平的上调,进而诱导肾癌细胞凋亡。     

尼可地尔对APPsw/SH-SY5Y细胞氧化应激和Aβ生成影响的研究

目的　探讨K_ATP开放剂尼可地尔对APPsw/SH-SY5Y细胞氧化应激和β-淀粉样蛋白（Aβ）生成的影响及其相关机制。方法　APP695swe质粒瞬时转染SH-SY5Y细胞24 h后,尼可地尔（1 mmol/L）和K_ATP阻断剂格列美脲（10 μmol/L）分别或共同作用24 h,收集细胞进行生化,real-time PCR,western blot和 ELISA检测;PI3K抑制剂LY294002（10 μmol/L）预处理,检测p-AKT和p-GSK-3β蛋白的表达。结果　尼可地尔可以明显降低MDA的生成（P＜0.05）,增加总SOD和GSH的水平（P＜0.05）;尼可地尔可以明显降低APP695 mRNA和APP695蛋白的表达（P＜0.05）,并能降低细胞外液Aβ1-42的水平（P＜0.05）。尼可地尔可以明显上调p-AKT和p-GSK-3β蛋白的表达（P<0.05）,并可被LY294002预处理所抵消。结论　尼可地尔可能通过抑制氧化应激,激活PI3K/Akt/GSK-3β通路等机制减少APPsw/SH-SY5Y细胞Aβ的生成。     

慢病毒介导shRNA特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1基因表达抑制舌癌细胞迁移侵袭能力

目的：探讨特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1（phosphatase of regenerating liver cell-1,PRL-1）基因表达对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法：设计、合成5条针对PRL-1基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰序列,构建于慢病毒载体质粒中,PCR电泳及基因测序验证。转染293T细胞,Western blot筛选最佳干扰序列,包装产生慢病毒。转染TCA8113细胞,筛选、建立稳定转染细胞株;real-time PCR检测PRL-1基因沉默效率;划痕实验和Transwell实验分别比较慢病毒转染细胞（KD组）、空病毒转染细胞（NC组）及TCA8113细胞（CON组）迁移、侵袭能力变化。结果：PCR电泳及基因测序证实5条shRNA序列定向插入慢病毒载体质粒中。Western blot筛选出PRL-1-shRNA-1基因沉默效率最高,包装获得慢病毒滴度为 7×108 TU/ml。通过转染、筛选,建立了TCA8113细胞稳定转染细胞株;real-time PCR测得PRL-1基因mRNA表达明显下降（F=809.120,P=0.000）;PRL-1基因沉默后细胞迁移能力降低,穿过人工基底膜的细胞数KD组（25.5±0.4）明显少于NC组（81.5±2.0）和CON组（88.5±2.3）（F=1 092.970,P=0.000）。结论：沉默PRL-1基因表达能有效抑制舌癌细胞迁移、侵袭能力。     

ROS介导棕榈酸诱导的肾小球足细胞骨架及裂孔隔膜损伤

目的：探讨棕榈酸（palmitic acid,PA）对足细胞肌动蛋白纤维骨架及裂孔隔膜蛋白损伤的影响。方法：应用PA刺激体外培养的条件永生性小鼠肾小球足细胞株,分为对照组（1% BSA）和PA（150 ?滋mol/L）组。采用Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;免疫荧光染色法观察检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达;油红“O”、透射电镜以及BODIPY染色检测PA刺激下足细胞内脂质积聚情况。应用不同浓度PA刺激足细胞,分为对照组（1% BSA）、50 ?滋mol/L PA组、150 ?滋mol/L PA组、300 ?滋mol/L PA组。采用Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。进一步应用氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine,NAC）预处理足细胞,分为对照组（1% BSA）、PA（150 ?滋mol/L）组、NAC组、PA（150 ?滋mol/L）+ NAC组。采用DCFH-DA染色检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生;Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。结果：Western blot结果示300 ?滋mol/L PA组足细胞内Nephrin和Podocin 的表达（0.360±0.030,0.900±0.040）分别与对照（Ctr）组（1.000±0.030,1.000±0.030）和50 ?滋mol/L PA组（0.912±0.020,0.900±0.040）相比都明显减少（P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.003）。免疫荧光显示与Ctr组相比,PA组足细胞Nephrin（t=6.014,P=0.010）和Podocin（t=6.171,P=0.010）蛋白的表达减少。使用NAC预处理足细胞清除ROS,与PA组（1.21±0.04,1.30±0.03）相比,PA+NAC组Nephrin（2.87±0.05）和Podocin（2.69±0.06）的表达减少（P=0.000,P=0.000）。结论：ROS介导了棕榈酸诱导的足细胞骨架及裂孔隔膜损伤。     

姜黄素抑制脂多糖诱导视网膜色素上皮细胞炎症反应

目的：探讨姜黄素（curcumin）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells, RPE）炎症反应的抑制作用。方法：体外培养人RPE细胞株ARPE-19,CCK-8测定不同浓度姜黄素（5、10、20、30、40 ?滋mol/L）或不同浓度姜黄素和脂多糖（5 ?滋g/mL）刺激后细胞的活性,以此确定姜黄素的最适作用浓度。实时荧光定量（real-time poly－merase chain reaction, RT-PCR）检测白细胞介素（interleukin,IL）-8和IL-6的mRNA表达变化,酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定IL-6和IL-8的蛋白表达水平。Western blot检测IκB-α、p-IκB-α蛋白表达变化。结果：CCK-8：不同浓度姜黄素对ARPE-19细胞活性无影响（P5 ?滋mol/L=0.998,P10 ?滋mol/L=1.000,P20 ?滋mol/L=0.124,P30 ?滋mol/L=0.092,P40 ?滋mol/L=0.078）,预先作用不同浓度的姜黄素对细胞活性有保护作用,20 ?滋mol/L保护作用明显（P=0.041）。PCR：姜黄素+LPS组IL-8的mRNA相对表达量（4.965±3.863）比LPS组（106.331±37.314）明显降低（P=0.000）,姜黄素+LPS组IL-6的mRNA相对表达量（0.992±0.374）比LPS组（2.175±0.560）明显降低（P=0.005）。ELISA：姜黄素+LPS组IL-8的蛋白表达量[（191.600±18.773） pg/mL]比LPS组[（589.025±38.880） pg/mL]明显降低（P=0.000）,姜黄素+LPS组IL-6的蛋白表达量[（113.906±27.947） pg/mL]比LPS组[（243.380±38.001） pg/mL]明显降低（P=0.000）。Western blot：与LPS组相比较,姜黄素+LPS组的p-IκB-α蛋白的表达水平降低（P=0.001）。结论：姜黄素通过抑制NF-κB活性抑制了脂多糖诱导视网膜色素上皮细胞的炎症反应,保护视网膜色素上皮细胞。     

二甲双胍通过干预上皮-间质转化逆转尼古丁诱导的肺癌吉非替尼耐药

目的：探讨尼古丁（nicotine,NIC）诱导EGFR敏感突变PC-9肺癌细胞株吉非替尼耐药及二甲双胍对其作用。方法：PC-9分成4组：空白组、尼古丁组、二甲双胍组、尼古丁和二甲双胍组,利用定量反转录聚合酶连锁反应（quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测E-cadherin和Vimentin信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）的表达,Western blot检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达,细胞计数试剂盒（cell counting Kit-8,CCK-8）检测不同分组细胞对吉非替尼药物敏感情况。Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移。结果：尼古丁诱导PC-9细胞上皮间质转化呈时间浓度依赖,在10 μmol/L尼古丁处理72 h后,发生E-cadherin下调和Vimentin上调最明显,故选该条件做以下实验。CCK-8提示,相比空白组,尼古丁组PC-9细胞对吉非替尼敏感性减弱,在吉非替尼浓度为0.05 μmol/L最明显（P=0.000）。Matrigel侵袭实验提示尼古丁组穿膜细胞数较空白组明显增多[（15.70±1.53）个/高倍视野 vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000];迁移实验的结果与之相似。与空白组相比,尼古丁组E-cadherin mRNA 表达水平明显降低[（0.932±0.100） vs. （0.459±0.024）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],Vimentin mRNA表达水平明显升高[（1.200±0.200） vs. （1.973±0.129）,F=20.998,P=0.000,P=0.000]。蛋白水平变化与之相同。尼古丁＋二甲双胍组可以增加尼古丁作用PC-9对吉非替尼的敏感性,在吉非替尼浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μmol/L时有统计学意义。尼古丁＋二甲双胍组可以减弱尼古丁组的穿膜数[（17.00±2.00）个/高倍视野vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000],迁移实验呈现相同的结果。相比于尼古丁组,尼古丁＋二甲双胍组上调E-cadherin mRNA[（0.459±0.024） vs. （0.838±0.058）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],下调Vimentin mRNA[（1.973±0.129） vs. （1.467±0.115）,F=20.998,P=0.000,P=0.003）]。结论：尼古丁通过上皮间质转化诱导PC-9细胞吉非替尼耐药,二甲双胍可以逆转上述现象。