胞内磷酸化蛋白酪氨酸激酶的流式细胞术检测

目的: 建立流式细胞术检测细胞内磷酸化蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的方法。方法: 用佛波醇酯(PMA)及植物血凝素(PHA)刺激Jurkat细胞,用两种不同的固定和透膜方法处理细胞,加磷酸化PTKs特异性单抗P-Tyr-100及FITC标记的二抗,建立胞内磷酸化PTKs的流式细胞检测技术;同时,用免疫印迹方法检测磷酸化PTKs以资对照。用双色荧光技术,对结核杆菌抗原(Mtb-Ag)活化的外周血单个核细胞(PBMC)中的γδT细胞进行胞内PTKs分析。结果: PHA及PMA刺激能够使Jurkat细胞中磷酸化PTKs明显增加,流式细胞术与免疫印迹方法检测的结果一致。通过双色荧光技术检测发现,Mtb-Ag刺激PBMC,可以优先诱导γδT细胞胞内PTKs的活化。结论: 利用流式细胞术可在单细胞水平分析细胞内PTKs的磷酸化状态。     

人外周血γδT细胞激活后IL-2和IFN-γ表达的特点

目的: 探讨人外周血γδT细胞在不同刺激剂激活后产生Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ的不同特点。方法: 健康成人外周血单个核细胞(PBMC)用佛波醇酯(PMA)、离子霉素(ionomycin)和抗CD28单抗(mAb)以不同组合刺激6~8h后;用流式细胞术胞内细胞因子检测法测定γδT细胞和αβT细胞IL-2和IFN-γ的表达;或用结核杆菌抗原(Mtb-Ag)刺激γδT细胞加IL-2扩增3~8天后检测γδT细胞IL-2的表达。结果: PBMC经PMA+ionomycin刺激后,与αβT细胞中产生IL-2细胞(14.0%)相比,γδT细胞中极少数细胞(1.1%)表达IL-2;但分泌IFN-γ细胞在γδT细胞中(56.1%)明显多于αβT细胞(8.5%)。如加抗CD28mAb联合刺激后,IL-2产生细胞在αβT细胞中明显增加,但在γδT细胞中未见增加;而IFN-γ表达细胞在两类细胞中均有明显增加;PBMC用Mtb-Ag激活后扩增3天后在γδT细胞中开始检测到IL-2表达,第5~6天时达高峰,第8天时逐渐下降。结论: 多克隆短时刺激对PBMC中γδT细胞表达IFN-γ能力强于αβT细胞,但产生IL-2很少;MtbAg能诱导γδT细胞表达IL-2,但过程较慢。     

CD69在人外周血活化的γδT细胞表面的表达

目的:观察CD69在人外周血γδT细胞表面的表达及与γδT细胞活化的关系.方法:抗CD3单克隆抗体及结核杆菌低分子多肽刺激人外周血单个核细胞(PBMC)及纯化的T细胞,流式细胞仪检测不同时相γδT细胞表面CD69分子的表达率.结果:抗CD3单抗、Mtb抗原刺激PBMC后3h,γδT细胞表面即表达CD69,24h达高峰;单独抗CD3或Mtb抗原刺激纯化的T细胞,CD69分子表达升高不明显,加入激发型抗CD28单抗作为第二信号,CD69表达率明显升高.结论:CD69分子在活化的γδT细胞表面高表达,可作为γδT细胞完全活化的一个指标.     

结核杆菌耐热抗原和磷酸类抗原对人外周血 γδ T细胞活化和增殖的比较

目的:比较结核杆菌耐热抗原(Mtb-HAg)和磷酸类抗原(HDMAPP)刺激正常人外周血γδT细胞活化和增殖的特点。方法:健康成人外周血单个核细胞(PBMC,1×106/ml),分别加Mtb-HAg(5μg/ml)和HDMAPP(2×10-9mol/ml)进行刺激,同时给予IL-2(50 u/ml)维持细胞增殖,另外设立只加IL-2的对照组。培养10 d后,采用抗CD3-FITC和抗TCRγδ-PE荧光抗体标记细胞,流式细胞术检测γδT细胞的比例。结果:正常人PBMC经Mtb-HAg刺激扩增后γδT细胞在扩增细胞中的比例明显低于HDMAPP组(P0.01),均明显高于IL-2对照组(P0.01)。各个体对2种抗原刺激扩增γδT细胞呈线性正相关关系(R2=0.855 1,P0.01)。结论:Mtb-HAg和HDMAPP均可优势激活人γδT细胞,且后者较前者有更强的活性。     

成人外周血细胞中Th2功能亚群分化的体外实验研究

目的:研究在中性条件和Th2极化条件下CD3单克隆抗体(CD3mAb)激活的人外周血αβT细胞Th1/Th2型细胞因子的表达.方法:用CD3mAb、IL-2刺激人外周血单个核细胞(PBMC),作为CD3mAb激活的T淋巴细胞(CD3AT)的中性条件培养;用CD3mAb、IL-2、rhIL-4和抗人IL-12抗体,作为Th2极化条件.分别收集PBMC和培养后第7、14和21天细胞,加PMA、ionomycin和monensin作用6 h后,用多色荧光抗体标记,在流式细胞仪上检测αβT细胞中胞内IFN-γ或IL-4产生细胞的比例.结果:PBMC中IFN-γ 或IL-4 αβT细胞分别为23.6%、2.4%.与中性条件相比,Th2极化条件下培养3周,αβT细胞中IFN-γ产生细胞明显减少(P＜0.001),IL-4 产生细胞显著增加(P＜0.001);同时产生IFN-γ IL-4 细胞从3.6%增加至6.1%.结论:体外Th2极化条件可以使人外周血αβT细胞分化为Th2功能亚群.     

期刊文摘

流式细胞术检测淋巴细胞增殖方法的建立[李学义 ,朱　平 ,樊春梅 ,王彦宏 ,史战国 .中国免疫学杂志 ,2 0 0 3;1 9(1 ) :4 3- 4 6 ]　　目的 :建立一种用流式细胞仪同时测定T淋巴细胞增殖与细胞因子分泌的方法 .方法 :用非特异性刺激剂PMA、PHA刺激1 0例正常人外周血单个核细胞 ,体外培养 2、4、6、8、1 0h ,流式细胞术在单细胞水平检测T淋巴细胞的功能性激活、表面活化标志性抗原 (CD6 9)的表达、DNA合成 (BrdU掺入法 )及胞内细胞因子 (IL 4、IFN γ)分泌 .选择合适的刺激剂、调整细胞浓度、优化实验方法 ,确定最佳实验条件 .结果 :…     

急性T淋巴细胞白血病细胞系JM分泌抑制因子在体外对T细胞凋亡及细胞周期的影响

目的　研究急性 T淋巴细胞白血病细胞系 JM分泌的抑制因子 (TL SFJM)在体外对 T细胞凋亡及细胞周期的影响 .方法　以 TL SFJM作用于有丝分裂原 PHA、蛋白激酶 C(PKC)活化剂 PMA和同种异体抗原 (alloantigen)活化的人或小鼠 T细胞 ,应用流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期 .结果　 TL SFJM在体外可诱导 PHA/IL - 2活化的小鼠胸腺细胞的凋亡 .TL SFJM在体外可诱导 alloantigen活化的人外周血单个核细胞 (PBMC)的凋亡 ,且把细胞周期阻遏在 G1期 .TL SFJM对 PMA诱导的人 PBMC活化抗原 CD2 5的表达无明显影响 ,也不引起凋亡 .结论　 TL SFJM在体外可诱导 PHA、alloantigen活化的 T细胞凋亡 .     

雷公藤甲素对CIA大鼠γδT细胞胞内细胞因子表达的影响

目的观察雷公藤甲素对II型胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠外周血γδT细胞表达细胞因子TNF-α和IL-10的影响,探讨γδT细胞在CIA中的作用机制和雷公藤甲素对γδT细胞的免疫调节作用.方法 Wistar大鼠背部及尾根部多点皮内注射牛Ⅱ型胶原诱导CIA动物模型,大鼠经雷公藤甲素治疗后,取外周血分离淋巴细胞,用流式细胞仪,通过直接荧光标记的抗TNF-α和抗IL-10抗体来检测单个细胞水平γδT细胞胞内细胞因子的表达.结果 CIA模型大鼠外周血中γδT细胞与正常大鼠相比较,所占淋巴细胞的百分比显著下降(6.96±0.74) %,γδT细胞胞内 TNF-α(2.22±0.36)%和IL-10(1.00±0.20)%的表达均明显降低(P<0.01).通过雷公藤甲素治疗后,γδT细胞的数量和TNF-α与IL-10的表达均恢复至正常水平.结论雷公藤甲素可调节CIA大鼠外周血γδT细胞的数量和TNF-α及IL-10表达水平,而达到治疗类风湿性关节炎的目的.     

白介素-9产生细胞在不同淋巴细胞亚群中的比例

目的:应用流式细胞术测定胞内细胞因子,检测不同T淋巴细胞亚群和其他淋巴细胞亚群中白介素-9(IL-9)产生细胞的比例。方法:23名健康成年人外周抗凝血加等量1640培养液后,加佛波酯、离子霉素及莫能霉素培养6 h。收集细胞后,先用不同荧光素标记的抗人CD3、抗人CD8和抗人T细胞抗原受体γδ(TCRγδ)单抗,或抗人CD19和抗CD56单抗作细胞表面染色,再经过溶血,固定和透膜处理后,加抗胞内细胞因子的抗IL-9和IL-17的荧光抗体作胞内染色,用流式细胞仪检测和分析IL-9产生细胞在不同T淋巴细胞亚群和其他淋巴细胞亚群中的分布频率。结果:IL-9产生细胞在总T细胞(CD3+T)、CD4+T细胞、CD8+T细胞和γδT细胞中的百分比分别为0.35±0.31、0.22±0.13、0.31±0.29和1.07±1.05。γδT细胞中的IL-9产生细胞明显高于其他淋巴细胞亚群(P<0.01)。同时也发现自然杀伤细胞(NK细胞)中也有少量IL-9产生细胞。另外还发现,共表达IL-9和IL-17的细胞在CD3+T及其亚群CD4+T和CD8+T细胞中的比例很低(0.03%~0.06%),但在γδT细胞中的比例可达(0.28±0.34)%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:用流式细胞术测定单细胞水平胞内细胞因子的技术发现,不仅CD4+T细胞中,而且CD8+T细胞和γδT细胞以及NK细胞中均存在产生IL-9的细胞。     

环孢素A抑制正常人外周血记忆CD4~+T细胞产生IL-22的实验研究

目的探讨环孢素A(CsA)是否能够抑制正常人CD4+T细胞产生白细胞介素22(IL-22)。方法使用密度梯度离心法制备正常人外周血单个核淋巴细胞(PBMCs),加入PMA+Inomycin刺激细胞后,做细胞内细胞因子染色,流式细胞仪检测正常人外周血PBMCs中产生IL-22的T细胞亚群,以及IL-17-IFN-γ-IL-22+CD4+T细胞亚群(Th22);PMA+Inomycin刺激正常人PBMCs,同时加或不加环孢素A(CsA)后,做细胞内细胞因子染色,流式细胞仪检测IL-22+CD4+T细胞和IFN-γ+CD4+T细胞的比例,以及IL-22+CD4+T细胞表达记忆表型分子CD45RO情况。结果正常人外周血中产生IL-22的T细胞以CD4+T细胞为主,且存在仅分泌IL-22,不分泌IL-17和IFN-γ的Th22亚群;CsA以剂量依赖方式抑制CD4+T细胞产生IL-22和IFN-γ;CsA抑制外周血PBMCs中记忆CD4+T细胞产生IL-22。结论 CsA能抑制正常人外周血中记忆CD4+T细胞产生IL-22。     

白桦脂酸对γδT细胞杀伤胰腺癌细胞功能影响及机制研究

目的:观察白桦酯酸作用前后对人γδT细胞增殖及对胰腺癌SW-1990细胞杀伤活性的影响,探讨其发生的机制。方法:分离健康者外周血单个核细胞(PBMC)在体外经多种细胞因子诱导为γδT细胞,收集培养第7天的γδT细胞,给予不同浓度白桦酯酸诱导48h,CCK8法检测白桦酯酸对γδT细胞增殖的影响,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测胰腺癌SW-1990细胞增殖率;γδT细胞分泌细胞因子的检测;流式细胞术(FCM)检测白桦酯酸作用前后γδT细胞穿孔素(PFP)、颗粒酶B(GrB)、NKG2D、CD107a的表达变化;乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定白桦酯酸对γδT细胞杀伤胰腺癌细胞株SW-1990的活性影响。结果:白桦酯酸浓度在0.013～1.6μg/mL时能促进γδT细胞生长;经白桦酯酸诱导后的γδT细胞PFP、GrB、CD107a、NKG2DIFN-γ和TNF-а的表达显著高于对照组(P<0.05),对胰腺癌SW-1990细胞的杀伤活性亦显著高于对照组(P<0.05)。结论:白桦酯酸在一定浓度范围内能够促进γδT细胞增殖,并增强其对胰腺癌SW-1990细胞的杀伤活性,其机制可能与上调γδT细胞表面PFP、GrB、CD107a、NKG2D的表达和增加γδT细胞IFN-γ和TNF-а分泌有关。     

PG肿瘤分泌物对PBMC活性及细胞因子分泌的影响

目的应用PG肿瘤细胞分泌的上清液培养正常外周血单个核细胞(PBMC),探讨PG肿瘤细胞分泌物对正常PBMC的活性及分泌细胞因子的影响,以进一步揭示肿瘤的免疫逃逸机制。方法将不同浓度的肿瘤细胞培养上清液与体外分离的PBMC一起培养,用MTT法检测细胞代谢活性,流式细胞术检测细胞内细胞因子分泌的变化情况。结果 PG培养上清能够提高PBMC活性,并使Th1、Th2类细胞因子表达增加。结论肿瘤上清确实能使PBMC活化,同时激活PBMC细胞分泌细胞因子。     

钙拮抗药及烧伤血浆对大鼠PBMC内NF-кB活化和炎症介质产生的影响

目的：探讨外周血单个核细胞(PBMC)内上游信号分子及核因子-кB(NF-кB）在烧伤后炎症级联反应中的作用。方法：体外检测在烧伤血浆作用下的PBMC内游离Ca^2 及NF-кB活化的变化，观察钙通道阻断药对NF-кB活化及IL-6、NO表达水平的调控作用。结果：不同时相点的烧伤血浆可使体外PBMC内Ca^2 明显增加，培养的PBMC核内NF-кB的积累明显增加，培养上清中NO和IL-6高表达。应用尼莫通(Nimodipine)和丹曲林(Dan-trium)对NF-кB的活化有调节作用，对IL-6和NO亦有下调作用。结论：烧伤血浆可使PBMC内信号分子浓度明显增高，NF-кB过度活化，并易位进入细胞核内，NF-кB介导的促炎性细胞因子和NO过度表达。两种钙通道阻断药有调控细胞内信号转导的作用，对烧伤后全身炎症反应综合征(SIRS)可能有防治作用。     

白藜芦醇增强乳腺癌细胞对γδ T细胞的敏感性及其机制研究

目的探讨γδT细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性,观察白藜芦醇增强γδT细胞的抗肿瘤活性。方法体外扩增培养人γδT细胞并用流式细胞术进行鉴定。实验分为对照组、白藜芦醇组、γδT细胞组、白藜芦醇+γδT细胞组及白藜芦醇+γδT细胞+c-FLIP质粒组。LDH释放实验检测γδT细胞对MDA-MB-231乳腺癌细胞的杀伤活性;western blot实验检测白藜芦醇及γδT细胞处理后MDA-MB-231细胞的细胞Fas-相关性死亡结构域样白介素-1β转换酶抑制蛋白(c-FLIP)的表达水平、活化半胱天冬酶(caspase)8、caspase 9、caspase 3的活化和细胞色素c的释放。结果流式细胞实验结果显示在体外用Br HPP和IL-2培养14天的人单个核细胞、CD3和γδTCR,确定这些定向培养的效应细胞为γδT细胞。LDH释放实验显示γδT细胞+白藜芦醇组对MDA-MB-231的杀伤活性为(68.2±7.1)%,显著高于γδT细胞组的(21.4±3.2)%(P0.05)和白藜芦醇+γδT细胞+cFLIP质粒组的(27.9±3.6)%(P0.05)。Western blot实验结果显示白藜芦醇处理能显著降低MDAMB-231细胞中c-FLIP蛋白的表达,γδT细胞+白藜芦醇组MDA-MB-231的活化caspase 8及细胞色素c的释放均显著高于γδT细胞组和白藜芦醇+γδT细胞+c-FLIP质粒组。结论白藜芦醇下调乳腺癌细胞c-FLIP的表达,提高乳腺癌细胞对γδT细胞的敏感性。     

MtbAg体外激活扩增的人γδT细胞表面L-选择素的动态变化

目的: 研究结核杆菌抗原(MtbAg)激活扩增的人外周血γδT细胞表面L-选择素(CD62L)的表达。方法: 用MtbAg和rIL-2刺激人外周血单个核细胞(PBMC)促使γδT细胞增殖,用CD3单克隆抗体(CD3mAb)和rIL-2刺激人PBMC促使αβT细胞增殖。取新鲜PBMC和刺激后培养3~21天的γδT细胞和αβT细胞,用多色荧光抗体标记,在流式细胞仪上检测γδT细胞表面CD62L的表达,并与αβT细胞作比较。结果: 新鲜未刺激PBMC中γδT细胞CD62L表达率为43.9%,明显低于αβT细胞的76.6%;用MtbAg或CD3Ab激活后培养第6天时CD62L在γδT细胞的表达(90.7%)和在αβT细胞表达(87.2%)均达到高峰;以后CD62L表达逐渐下降,15~21天γδT细胞CD62L的表达在低水平(16.2%~10.6%)维持,αβT细胞表面的CD62L表达(23.6%~17.5%)亦在低水平维持。结论: 新鲜PBMC中γδT细胞CD62L表达明显低于αβT细胞,但在激活后增殖过程中CD62L在γδT细胞的表达,与αβT细胞相似,呈现先上升再下降的趋势,最后稳定在低水平。     

钙离子载体和Poly(I:C)诱导人外周血来源的树突状细胞成熟的研究

目的:探讨从健康人外周血中体外诱导培养出成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法.方法:用密度梯度离心法分离人外周单个核细胞(PBMC),再用贴壁法获取单核细胞后加入GM-CSF和IL-4,培养5天后分5组:第1组为对照组,仅含有上述细胞因子;第2组,加入多聚次黄嘌呤胞嘧啶核苷酸[Poly(I:C)];第3组,加入钙离子载体(A23187);第4组,加入Poly(I:C)和CI;第5组,加入TNF-α.显微镜下观察培养细胞形态,流式细胞术检测DC表型,体外同种混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC刺激T细胞的增殖活性.结果:第四组细胞具有典型的树突状细胞的特征,且高表达CD83、CD80、CD86和CD40分子,具有更强的刺激T细胞增殖能力.结论:经过组合细胞因子诱导能够培养出PBMC来源的DC,且经CI和Poly(I:C)进一步诱导后获得更成熟和功能更强DC.     

临床试剂rIL-2和实验试剂IL-2对γδT细胞体外扩增影响的研究

目的检测经临床试剂重组白细胞介素2(rIL-2)和实验试剂白细胞介素2(IL-2)体外辅助扩增后γδT细胞的细胞纯度及对肿瘤细胞的细胞毒性差异。方法应用梯度离心法分离10例正常人外周血单个核细胞,经IL-2和唑来膦酸(Zol)联合刺激γδT细胞进行扩增,采用流式细胞仪鉴定γδT细胞及其纯度,并检测其对肿瘤细胞的细胞毒性作用。结果在Zol存在的情况下,经实验用IL-2刺激的γδT细胞纯度最高达97.3%,经临床试剂rIL-2刺激的纯度为51.42%(P<0.05),且IL-2扩增后的γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用较rIL-2明显。结论在Zol的存在前提下,IL-2能促使人外周γδT细胞迅速增生,达到实验所需要的细胞纯度,并对肿瘤细胞具有较强的细胞毒性作用,而rIL-2则不能。     

不同活化系统对CD4+T细胞凋亡诱导配体表达的影响

目的: 探讨不同活化系统对CD4 T细胞凋亡诱导配体在细胞内和膜表面表达的影响. 方法: 分别以PMA、PHA、SEB和单向混合淋巴细胞反应(MLR)刺激PBMC,以免疫荧光染色结合三色流式细胞术分析比较刺激前后的CD4 T细胞中,3种主要的凋亡诱导配体TRAIL、FasL和TNF-α在细胞内和膜表面表达的变化. 结果: ① FasL在静止CD4 T细胞表面的表达基本为阴性,PMA和PHA上调其表达;FasL在静止CD4 T细胞内有一定程度表达,PMA、PHA和MLR下调其在胞内的表达. ② TRAIL在静止CD4 T细胞表面几乎不表达, SEB微弱上调其表达;TRAIL在静止CD4 T细胞胞内有低水平表达,SEB和MLR微弱上调其表达, PHA则下调其表达. ③ TNF-α在静止CD4 T细胞表面几乎不表达,PMA和PHA对其表达有一定上调作用;TNF-α静止CD4 T细胞胞内有一定水平表达,SEB和MLR明显上调其表达. 结论: FasL、TRAIL和TNF-α都是Th细胞重要的效应分子,不同免疫应答过程有不同的表达模式.     

蛋白激酶C在乙醇诱导人γδT细胞凋亡中的作用

目的: 观察蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)在乙醇诱导人γδT细胞凋亡中的作用。方法: 用结核杆菌多肽抗原(MtbAg)刺激正常人外周血单个核细胞,获得Mtb-Ag激活的T细胞(γδT细胞为主);采用Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术观察不同浓度乙醇对人γδT细胞凋亡诱导情况,并观察Rottlerin (PKC抑制剂)预处理对乙醇诱导γδT细胞凋亡的影响。结果: 4.0%的乙醇作用结核杆菌抗原活化的γδT细胞4 h、12 h、24 h均可显著诱导γδT细胞凋亡(P<0.01);5.0 μmol/L和40.0μmol/L Rottlerin可显著抑制4.0%乙醇诱导γδT细胞凋亡(P<0.01),凋亡抑制率分别为75.17%和58.95%。结论: PKC途径参与乙醇诱导人γδT细胞凋亡信号传导。     

SLE患者PBMC中IFN-γ和IL-6的表达

目的 :在单个细胞水平上研究系统性红斑狼疮 (SLE)患者外周血单个核细胞 (PBMC)的细胞内细胞因子IFN γ和IL 6的表达与疾病发病的关系。方法 :用酶联免疫斑点法 (ELISPOT)检测患者PBMC的细胞内细胞因子IFN γ和IL 6的表达情况。结果 :活动期SLE患者PBMC中IL 6及Th2 Th1 比值与正常人相比显著升高 (P <0 .0 1)。结论 :在SLE患者PBMC中细胞因子IL 6升高 ,表达倾向于向Th2 偏移 ,Th1 Th2 平衡在SLE发病机制中起重要作用。