MiRNA-26a通过调控结缔组织生长因子缓解血管平滑肌细胞的钙化

目的 探究miRNA-26a调控结缔组织生长因子对血管平滑肌细胞钙化的作用。方法 将细胞分为对照组、模型组、模型+AR234960组、AR234960+miR-26a mimic组和miR-26a mimic组。对照组细胞正常培养基培养,模型组VSMC细胞诱导钙化,模型+AR234960组的VSMC细胞诱导钙化后加入AR234960激动剂干预,AR234960+miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后用AR234960激动剂和miR-26a mimic处理,miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后转染miR-26a mimic。茜素红染色测定各组细胞钙化沉积;试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）活性;荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞miR-26a、OPG、OPN、BMP-2、Collagen II基因和蛋白表达情况。双荧光素酶基因验证miR-26a与CTGF的结合。结果 平滑肌A7r5细胞钙化后,miR-26a的表达随着钙化时间的增加而降低（P<0.05）,而CTGF的表达随钙化时间的增加而增加（P<0.05）。茜素红染色结果显示,AR234960能够增加细胞的钙化程度,而miR-26a mimic能够减轻细胞钙化。与对照组相比,模型组ALP活性、OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表达显著升高（P<0.05）,OPG mRNA和蛋白的表达显著降低（P<0.05）;与模型组相比,模型+AR234960组上述指标均无显著差异（P>0.05）,而miR-26a mimic组ALP活性、OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表达显著降低（P<0.05）,OPG mRNA和蛋白的表达显著升高（P<0.05）;与miR-26a mimic组相比,AR234960+miR-26amimic组ALP活性、OPN、BMP-2、Collagen II mRNA和蛋白的表达显著升高（P<0.05）,OPG mRNA和蛋白的表达显著降低（P<0.05）。双荧光素酶基因检测结果显示,miR-26a-inhibitor组CTGF 3'-UTR野生型中相对荧光素酶活性较miR-26a-mimic组显著升高（P<0.05）。结论 miRNA-26a能够有效降低细胞中ALP活性及OPN、BMP-2、Collagen II的表达,同时增加钙化细胞中OPG水平,为miRNA-26a通过调控CTGF水平进而对缓解血管平滑肌细胞钙化提供了理论依据。     

瘦素对主动脉瓣膜间质细胞表型转化的影响

目的：探讨瘦素对主动脉瓣膜间质细胞（valvular interstitial cells,VICs）表型转化的影响,揭示瘦素在钙化性主动脉瓣疾病（calcific aortic value disease,CAVD）发生发展中所扮演的角色。方法：胶原酶消化法分离并培养猪主动脉瓣膜间质细胞,采用含不同浓度的瘦素分别刺激细胞24 h,检测细胞裂解液碱性磷酸酶（ALP）活性,并确定最佳刺激浓度。用最佳刺激浓度的瘦素刺激细胞24 h,提取细胞RNA以及蛋白,通过RT-PCR以及Western blot分别测定肌动蛋白（α-SMA）、骨桥蛋白（OPN）的表达情况。结果：瘦素刺激导致ALP表达上调且最大刺激浓度为100 ng/mL。相较于对照组,瘦素刺激组 OPN mRNA及蛋白表达增高,而α-SMA表达无明显变化。结论：瘦素能够诱导VICs向成骨细胞分化,从而促进VICs钙化。     

miR-485-5 p介导SOX5基因表达对肝细胞肝癌细胞活力及迁移侵袭的影响

目的 研究微小RNA(miR)-485-5 p靶向性别决定区Y框蛋白5(SOX5)对肝细胞肝癌(HCC)细胞活力和迁移侵袭能力的影响及作用机制.方法 采用Targetscan 7.1预测软件及双荧光素酶报告基因试验检测miR-485-5 p对SOX5基因的靶向调控作用.qRT-PCR检测HCC组织中miR-485-5 p和SOX5 mRNA的表达水平,并分析两者的相关性.常规培养HCC细胞Huh7,将其分为NC、miR-485-5p mimic和miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组,采用lip2000进行各组质粒的转染.CCK-8实验检测各组细胞的活力,Transwell实验检测各组细胞的迁移侵袭能力.Western blot检测各组细胞中pAkt和pGSK3β蛋白的表达.结果 Targetscan 7.1预测软件、双荧光素酶报告基因试验表明miR-485-5 p靶向调控SOX5.与HCC癌旁组织相比,miR-485-5 p在HCC组织中低表达,SOX5 mRNA在HCC组织中高表达,两者的表达呈负相关性.与NC组相比,miR-485-5 p mimic组和miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组HCC细胞活力和迁移侵袭能力降低.而与miR-485-5 p mimic组相比,miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组HCC细胞活力和迁移侵袭能力增加,过表达SOX5减弱了miR-485-5 p mimic对HCC细胞活力和迁移侵袭能力的抑制作用.与NC组相比,miR-485-5 p mimic和miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组细胞中pAkt和pGSK3β蛋白表达降低.而与miR-485-5 p mimic组相比,miR-485-5 p mimic+oe-SOX5组pAkt和pGSK3β蛋白表达增加,过表达SOX5减弱了miR-485-5 p mimic对Akt/GSK3β信号通路活性的抑制作用.结论 miR-485-5 p靶向调控SOX5表达抑制HCC细胞活力及迁移侵袭能力.     

miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控人骨髓间充质干细胞成骨分化且促进骨质疏松

目的:探讨miRNA-338-3p在骨质疏松症进展中的作用及其对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响.方法:选择60例骨质疏松症患者为研究对象,另选同期60名非骨质疏松者作为对照组.检测两组血清miR-338-3p表达水平.采用RT-qPCR检测miR-338-3p、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)水平.Western blot检测miR-338-3p对RUNX2蛋白表达的影响;采用碱性磷酸酶(ALP)测定法和茜素红染色评估miR-338-3p和RUNX2对成骨分化和矿化能力的影响;采用生物信息学和荧光素酶报告基因检测验证miR-338-3p和RUNX2之间的关系.结果:骨质疏松患者血清miR-338-3p水平相比对照组表达量明显上升(P<0.05),且其表达随着成骨诱导时间的延长而逐渐降低(P<0.05).与对照组比较,miR-338-3p表达情况影响OCN、OPN和Collagen Ⅰ mRNA的水平(P<0.05).与对照组相比,miR-338-3p过表达削弱了hBMSCs矿化能力和ALP活性(P<0.05).双荧光素酶报告基因检测证实,RUNX2是miR-338-3p的直接靶点,miR-338-3p过表达降低了RUNX2蛋白及其mRNA的表达水平(P<0.05).RUNX2过表达可逆转miR-338-3p对hBMSCs成骨分化的抑制作用.结论:miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控hBMSCs的成骨分化,从而促进骨质疏松的进展.     

MicroRNA-27b在高血压脑出血大鼠脑组织中的表达及对星形胶质细胞生物学功能的影响

目的 探讨microRNA-27b（miR-27b）在高血压脑出血（HICH）大鼠脑组织中的表达及对星形胶质细胞生物学功能的影响。方法 选取15只健康WKY大鼠作为对照组,15只自发性高血压大鼠作为HICH组。HICH组通过自体血脑内注射法复制HICH大鼠模型,对照组进行假手术但不注射自体血。HE染色和TUNEL染色检测大鼠脑组织损伤和凋亡情况,实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-27b mRNA相对表达量。将星形胶质细胞分为NC组、miR-27b mimic组及miR-27b inhibitor组,分别转染miR-27b mimic和miR-27b inhibitor质粒,过表达和抑制miR-27b水平。qRT-PCR检测各组细胞miR-27b mRNA相对表达量,CCK-8法检测各组细胞增殖及凋亡情况。结果 HICH组大鼠出血脑组织出现显著损伤,凋亡指数（35.91±3.24）高于对照组（2.75±0.36）（P <0.05）;HICH组miR-27b mRNA相对表达量（3.45±0.48）高于对照组（1.00±0.12）（P <0.05）;miR-27b mimic组的miR-27b mRNA相对表达量高于NC组,增殖活力低于NC组,凋亡率高于NC组（P <0.05）。miR-27b inhibitor组的miR-27b mRNA相对表达量低于NC组,增殖活力高于NC组,凋亡率低于NC组（P <0.05）。结论 miR-27b mRNA相对表达量在HICH大鼠脑组织中显著升高,并抑制星形胶质细胞的增殖,促进星形胶质细胞凋亡。     

长链非编码RNA Linc00658在结直肠癌中的表达及其与西妥昔单抗抵抗的关系

目的：探究长链非编码RNA（LncRNA）Linc00658 在结直肠癌（CRC）中的表达及其与西妥昔单抗抵抗的关系。方法：采用生物信息学方法预测与miR-19a-3p及PTEN表达密切相关的LncRNA，分别用西妥昔单抗和DMSO诱导处理人CRC细胞CaCo2 作为抵抗组和对照组，并利用细胞转染过表达抵抗组细胞的Linc00658作为过表达组，分别转染miR-19a-3p mimic及NC于CaCo2细胞中，作为mimic组及NC组。qRT-PCR检测Linc00658、miR-19a-3p及PTEN mRNA在对照组、抵抗组和过表达组细胞中的表达水平，Western blot检测PTEN及其下游基因磷酸化AKT（p-AKT）及磷酸化mTOR（p-mTOR）的表达，CCK-8 实验检测各组细胞西妥昔单抗的半数抑制浓度（IC50），荧光素酶报告基因实验验证Linc00658与miR-19a-3p的结合及其对miR-19a-3p与PTEN结合作用的影响。结果：相比对照组，抵抗组细胞Linc00658、PTEN mRNA及蛋白表达显著降低，miR-19a-3p、p-AKT及p-mTOR表达显著升高，西妥昔单抗IC50 显著增高（均P ＜0.01）；相比抵抗组，过表达组细胞Linc00658、PTEN mRNA及蛋白表达显著升高，miR-19a-3p、p-AKT及p-mTOR表达显著降低，西妥昔单抗IC50 显著降低（P ＜0.05）；相比NC组，mimic组西妥昔单抗IC50显著升高（P ＜0.01）；miR-19a-3p mimic可显著抑制pGL3-basic-Linc00658荧光素酶活性，提示miR-19a-3p与Linc00658存在结合作用，过表达Linc00658可使miR-19a-3p mimic对pGL3-basic-PTEN的荧光抑制作用恢复。结论：Linc00658通过吸附miR-19a-3p促进PTEN的重新表达及CRC细胞对西妥昔单抗的敏感性。     

miR-138通过靶向LCN2在七氟醚诱导的大鼠认知障碍中的作用及机制

目的 探讨miR-138通过靶向LCN2在七氟醚诱导的大鼠认知障碍中的作用及机制。 方法 将90只7周龄SD大鼠随机分为对照组(n=20)、七氟醚组(n=20)、七氟醚+NC mimic组(n=20)、七氟醚+miR-138 mimic组(n=20)、七氟醚+miR-138 mimic组+vector组(n=5)、七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2组(n=5)。构建七氟醚诱导的大鼠认知障碍模型,七氟醚诱导的大鼠分别注射10 μL miR-138 mimic、NC mimic慢病毒悬液。采用Morris水迷宫实验分析潜伏期、跨台时间和游泳速度;HE染色检测海马神经元的病理变化;TUNEL染色检测海马神经元凋亡情况;实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR)检测miR-138、脂质运载蛋白2（LCN2）的mRNA水平表达;双荧光素酶报告基因系统用于检测miR-138和LCN2之间的关系;Western blotting 检测海马组织中LCN2、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白水平;ELISA实验检测海马组织中IL-6、TNF-α、IL-1β。 结果 与对照组比较,七氟醚组中miR-138表达水平显著降低（P<0.05）;大鼠逃避潜伏期显著增加,穿越平台次数显著减少,海马神经元损伤,海马神经元凋亡数量显著增加,cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平显著升高,Bcl-2显著降低,IL-1β、TNF-α、IL-6水平升高,p-JAK2和p-STAT3蛋白水平降低（均P<0.05）。与七氟醚+NC mimic组比较,七氟醚+miR-138 mimic组中大鼠逃避潜伏期减少,穿越平台次数增加,神经元病理损伤减轻,海马神经元凋亡数量显著减少,cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平降低,Bcl-2水平升高,IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低,p-JAK2和p-STAT3蛋白水平升高（均P<0.05）。双荧光素酶报告基因结果显示LCN2 是miR-138的靶基因,过表达LCN2可显著逆转miR-138对七氟醚诱导的认知障碍大鼠凋亡的作用（P<0.05）。 结论 miR-138靶向LCN2通过JAK2/STAT3通路对七氟醚诱导的认知障碍具有神经保护作用。     

miR-9-5p通过SIRT1/NF-κB通路促进胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨miR-9-5p通过调控SIRT1及NF-κB表达对胰腺癌细胞(PANC-1)凋亡相关基因Caspase-3表达的影响。方法 使用miR-9-5p mimic慢病毒转染人胰腺癌PANC-1细胞建立稳转株(mimic组),空载体转染作为阴性对照组(NC组),以未处理的PANC-1细胞作为空白对照组(空白组)。采用qRT-PCR检测PANC-1细胞中miR-9-5p、SIRT1及Caspase-3 mRNA的表达水平；Western Blot检测SIRT1、NF-κB通路相关蛋白及Caspase-3蛋白表达量；ELISA检测细胞裂解液中SIRT1及Caspase-3蛋白表达；双荧光素酶报告基因实验明确miR-9-5p和SIRT1的靶向关系；Pearson相关分析确定miR-9-5p、SIRT1及Caspase-3 mRNA表达的相互关系。结果 mimic组miR-9-5p mRNA表达较对照组明显升高，结果有统计学意义，提示转染成功。与空白组及NC组相比，mimic组SIRT1 mRNA及蛋白表达水平下调(P<0.01),p-NF-κB p65与NF-κB p65上调(P&...     

MiR-92a-3p靶向KLF4促进肝细胞癌恶性进程

目的:探究微小RNA-92a-3p(miR-92a-3p)对肝细胞癌(HCC)的影响及其分子机制。方法:qRT-PCR检测人肝细胞癌细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B和人正常肝细胞系HL-7702中miR-92a-3p和Krüppel样因子4(KLF4)的表达。将SMMC-7721、Bel-7402细胞分组为Inhibitor NC组、miR-92a-3p Inhibitor组、mimic NC组、miR-92a-3p mimic组、mimic NC+oe-NC组、mimic NC+oe-KLF4组、miR-92a-3p mimic+oe-NC组、miR-92a-3p mimic+oe-KLF4组。qRT-PCR检测细胞中miR-92a-3p和KLF4的mRNA表达水平。Western blot检测KLF4蛋白表达水平。MTT增殖实验检测细胞活力。划痕愈合、Transwell侵袭实验分别检测细胞迁移能力和侵袭能力。通过TargetScan分析miR-92a-3p与KLF4的靶向关系,并通过双荧光素酶实验验证。结果:相比于正常细胞,miR-92a-3p在H...     

二叶式主动脉瓣中miRNA-195调控瓣膜钙化的机制研究

目的：探究二叶式主动脉瓣中miRNA-195调控瓣膜钙化的可能机制。方法：收集35例接受主动脉瓣置换术患者狭窄的二叶式或三叶式主动脉瓣,通过PCR及Western blot分别检测miRNA-195的表达量、果蝇母源抗皮肤生长因子（drosophila mothers against decapentaplegic 7,SMAD7）的mRNA及蛋白表达量。双荧光素酶法预测miRNA-195的靶基因。在猪瓣膜间质细胞中分别沉默和过表达miRNA-195,检测SMAD7的mRNA表达水平并探究两者的相互关系。在人类瓣膜组织上通过免疫组化染色检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2、MMP-9蛋白水平,通过天狼星红染色检测胶原蛋白水平,通过Von Kossa染色比较钙化程度差异,进而研究钙化相关的功能改变。结果：与狭窄的三叶式主动脉瓣相比,狭窄的二叶式主动脉瓣中miRNA-195表达降低,SMAD7的mRNA和蛋白水平升高。双荧光素酶实验提示SMAD7是miRNA-195的直接靶标。在猪瓣膜间质细胞中沉默miRNA-195引起SMAD7 mRNA水平升高,过表达miRNA-195引起SMAD7 mRNA水平降低。狭窄钙化的二叶式主动脉瓣组织中MMP-2、MMP-9及胶原的表达较狭窄钙化的三叶式主动脉瓣升高。结论：在二叶式主动脉瓣中,下调的miRNA-195促进了SMAD7表达,进而促进细胞外基质的纤维化并最终促进其钙化。