内质网应激通过SCAP/SREBP-1c调控L02肝细胞脂质合成代谢

目的 在内质网应激状态下,观察SCAP/SREBP-1c对肝细胞脂质合成代谢的影响.方法 用毒胡萝卜素(Tg)诱导人L02正常肝细胞株建立内质网应激模型,Western blot检测GRP78的蛋白表达.甘油三酯(TG)试剂盒和油红O染色检测肝细胞内脂变程度;实时荧光定量PCR检测SREBP-1c下游脂代谢相关基因FAS、ACC1的mRNA表达情况,Western blot检测nSREBP-1c、FAS、ACC1的蛋白表达情况.通过miRNA瞬时转染沉默SCAP基因的表达,观察上述指标的变化情况.结果 实验组GRP78蛋白的相对表达量与对照组比较,均显著增加(P＜0.05),Tg在体外成功建立肝细胞内质网应激模型.与空白对照组相比,Tg组肝细胞内甘油三酯含量明显增加(P＜0.05),脂滴明显增多;nSREBP-1c的蛋白水平明显升高(P＜0.05);下游靶基因FAS和ACC1的基因和蛋白水平均明显上调(P＜0.05),与nSREBP-1c的升高趋势一致.转染SCAP-3 miRNA载体后,以上指标均明显下调(P＜0.05).结论 内质网应激通过SCAP/SREBP-1c调控肝细胞脂质合成代谢,促进脂质沉积,是NAFLD重要的发病机制之一.靶向干扰SCAP,能减轻内质网应激所致的肝细胞脂肪变程度,成为安全有效的NAFLD防治新靶点.     

内质网应激诱导肝细胞脂肪沉积及可能机制

目的 利用毒胡萝卜素诱导肝细胞内质网应激模型,观察在内质网应激状态下肝细胞脂肪沉积情况,并初步探讨其分子机制.方法 以人L02、HepG2肝细胞株为研究靶细胞,将两种细胞均分为正常对照组和实验组(培养液内含毒胡萝卜素1 μmol/L),采用三酰甘油(TG)试剂盒、油红O染色检测肝细胞脂肪沉积情况,实时荧光定量PCR法检测SREBP-1c、LXRs的mRNA表达情况,蛋白质印迹法检测GRP78、SREBP-1c、LXRs的蛋白表达情况.结果 蛋白质印迹结果显示,实验组GRP78的表达较对照组升高(P＜0.05),表明肝细胞内质网应激模型建立成功.在内质网应激状态下,毒胡萝卜素作用48 h后实验组L02与HepG2细胞脂肪沉积均较对照组增加(P＜0.01).与对照组相比,实验组L02和HepG2细胞SREBP-1c在基因水平和蛋白水平表达均升高(P＜0.05),而LXRs在基因水平和蛋白水平的表达均无变化.结论 内质网应激可能通过上调SREBP-1c诱导肝细胞脂肪沉积,而LXRs未参与该过程.     

肝X受体的激活对小鼠糖尿病肝脏脂肪酸合成酶表达的调节

目的 探讨肝X受体(LXR)对糖尿病肝脏脂肪酸合成酶(FAS)表达的影响及机制.方法 将16周龄、雄性、C57BL/6背景下瘦素受体基因缺陷的db/db小鼠和对照的db/m小鼠,分别予以LXR激动剂TO901317(TO)(3 mg·kg-1·d-1)或DMSO灌胃处理7 d;TO(10 μmol/L)刺激人肝癌细胞系HepG2细胞24 h.此外,HepG2细胞转染小鼠FAS启动子报告基因表达质粒,同时转染pcDNA3.1表达载体或LXR或活化型固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)表达质粒12 h;采用免疫组织化学方法检测FAS蛋白在肝脏上的表达,实时荧光定量PCR和蛋白印迹方法分别在mRNA和蛋白水平检测FAS和SREBP-1的表达及TO对其表达的影响,荧光素酶报告基因方法检测LXR激动剂和SREBP-1c对小鼠FAS启动子活性的影响.结果 免疫组化结果显示FAS蛋白在肝脏广泛表达,主要位于肝细胞胞质内.TO可显著降低db/db小鼠空腹血糖水平[由(12.00±1.06)mmol/L下降到(7.73±0.69)mmool/L,P＜0.01]和糖化血红蛋白水平(由5.67%±0.10%下降到4.87%±0.08%,P＜0.01).db/db小鼠肝脏FAS mRNA水平明显高于db/m小鼠,约为5.5倍(P＜0.01);在蛋白水平,db/db小鼠肝脏上的FAS也明显高于db/m小鼠.TO处理可使db/m小鼠肝脏FAS mRNA表达升高约3.5倍(P＜0.05),可使db/db小鼠肝脏FAS mRNA升高约1.7倍(P＜0.05);TO处理可使db/m小鼠肝脏SREBP-1 mRNA升高约2.4倍(P＜0.05),使db/db小鼠肝脏SREBP-1 mRNA升高约2.1倍(P＜0.01).TO能够上调HepG2细胞FAS的mRNA表达水平,升高约1.9倍(P＜0.05);LXR的激活还能显著增加HepG2细胞中FAS基因启动子活性,约为对照组的1.5倍;过表达LXR或SREBP-1c也能增加HepG2细胞FAS基因启动子活性,分别为对照组的1.9倍和1.6倍(均P＜0.01).结论 LXR可能通过其本身的直接作用和SREBP-1C的间接作用上调肝脏FAS的表达,LXR可能介导了糖尿病肝脏的脂质生成过程.     

乙肝病毒X基因诱导肝细胞脂肪变性作用机制的研究

[摘要] 目的 探讨沉默肝X受体α(liver x receptor alpha,LXRα)对HepG2.2.15细胞脂质代谢相关基因表达的影响。方法 设立空白对照组（不转染任何质粒）、阴性对照组（转染阴性HK质粒）、shLXRα转染组（转染LXRα质粒）。构建针对LXRα基因的shLXRα质粒,转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜及Western blot检测转染质粒24～96h绿色荧光蛋白和LXRα蛋白的表达以确定质粒的最佳干扰时间,根据结果予油酸钠刺激细胞,甘油三酯（TG）检测细胞脂肪变程度,RT-PCR检测固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)mRNA的表达,Western blot检测乙肝病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)及脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)蛋白的表达。结果 成功构建shLXRα质粒并转染HepG2.2.15细胞;与空白对照组和阴性对照组比较,shLXRα转染组LXRα蛋白表达明显下降,于转染后48～72h表达最低[（0.43±0.03） vs (0.61±0.03),(0.33±0.03) vs (0.69±0.02),P＜0.01],差异有统计学意义;随着油酸钠处理时间延长各组TG含量、SREBP-1c mRNA水平、HBx和FAS蛋白表达均逐渐增加,同一时间点,HBx蛋白各组无明显差异（P>0.05）,而TG含量、SREBP-1c mRNA水平、FAS蛋白与空白对照组和阴性对照组比较, shLXRα转染组中表达较低[TG：（21.21±3.39）μg/mg vs（32.61±5.09）μg/mg];SREBP-1c：（0.418±0.051 vs 0.516±0.037;FAS：0.48±0.03 vs 0.63±0.03,P<0.01）,差异有统计学意义。结论 HBx对脂代谢的调控是通过LXRα/ SREBP-1c /FAS途径实现的。     

Effect of different dietary fatty acids on expression of sterol-regulatory elementary binding protein-1c and lipid metabolism in hepatic cells

目的 探讨不同膳食脂肪酸构成对肝细胞脂代谢及固醇调节元件结合蛋白-lc( sterol-regulatory elementary binding protein-1c,SREBP-1c)表达的影响.方法 以HepG2肝细胞为研究对象,分为空白对照组、二十碳五烯酸(EPA)组、棕榈酸(PA)组、EPA和亚油酸(LA)1:1混合组、PA和油酸(OA) 1:1混合组,EPA、PA单独处理组终浓度为150 μmol/L,混合处理组各组分浓度为75 μmol/L,总浓度为150 μmol/L,处理细胞24 h.采用油红O染色观察细胞内脂滴的变化,测定甘油三酯(TG)含量来评价细胞内脂质含量;采用RT-PCR、Western blot法检测SREBP-1c mRNA及蛋白的表达.结果 PA组、PA和OA 1:1混合组SREBP-1c mRNA及蛋白的表达上调,EPA和LA 1:1混合组、EPA组SREBP-1c mRNA及蛋白的表达下调,与对照组相比差异显著(P＜0.05).与对照组相比,EPA和LA 1:1混合组、EPA组肝细胞内TG含量显著减少(P＜0.05);PA和OA 1:1混合组、PA组肝细胞内TG含量显著增加(P＜0.05).结论 PA、OA上调肝细胞SREBP-1 c的表达并促进细胞内TG的合成,可能促进肝细胞脂肪变性;而EPA、LA下调肝细胞SREBP-1c的表达并显著降低肝细胞内TG含量,减轻肝细胞脂肪变性.     

MiR-7下调LXRβ表达而抑制HepG2细胞脂质生成的作用

目的 初步探讨miR-7对LXRβ的抑制作用及其在肝细胞脂质生成中的作用.方法 生物信息学分析,预测LXRβ mRNA的3'-UTR上miR-7的可能结合位点.在人肝细胞系HepG2中转染miR-7,以Real-time PCR、Western blot检测LXRβ mRNA水平和蛋白水平表达的变化;构建LXRβ 3'-UTR报告基因质粒pMIR/LXRβ,Report assay检测报告基因荧光素酶活性;Real-time PCR检测miR-7对LXRβ激动剂诱导的脂质生成相关靶基因FAS、ACC的表达变化.结果 在人肝细胞中,miR-7能够显著抑制LXRβ的表达(P＜0.05),且miR-7能降低LXRβ重组质粒pMIR/LXRβ的荧光素酶活性(P＜0.05).同时抑制其激动剂对脂质代谢相关靶基因的诱导作用.结论 miR-7可通过结合在LXRβ 3'-UTR区域而抑制其表达,进而抑制FAS、ACC的表达而抑制脂质生成.     

滋阴益气活血解毒中药含药血清对脂肪变性HepG2细胞SREBP-1c和FAS表达的影响

目的 探讨滋阴益气活血解毒中药含药血清对脂肪酸孵育HepG2细胞中固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS)表达的影响.方法 HepG2细胞分为对照组、模型组、15％含药血清组;对照组和模型组用正常大鼠血清DMEM培养,15％含药血清组用15％含药血清DMEM培养,模型组、15％含药血清组同时加0.5 mmol/L混合脂肪酸(油酸∶棕榈酸=2∶1);油红O染色法检测细胞内脂质沉积,RT-PCR检测HepG2细胞SREBP-1c和FAS mRNA表达,免疫组化检测HepG2细胞SREBP-1c和FAS蛋白表达.结果 15％含药血清能减少模型细胞脂质沉积,降低模型细胞SREBP-1c和FAS的mRNA及蛋白表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 滋阴益气活血解毒中药含药血清能够调节SREBP-1c和FAS表达,改善混合脂肪酸诱导的HepG2细胞脂肪性变.     

Effect of hepatitis B virus X protein on sodium oleate-induced lipid accumulation in HepG2 cells

目的 探讨乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virusX protein,HBx)是否增加油酸钠诱导HepG2细胞的脂质沉积.方法 将质粒pIRES2-eGFP-HBx瞬时转染入HepG2细胞中,建立表达HBx的细胞模型(HepG2-HBx);以转染空载体pIRES2-eGFP( HepG2-pIRES2)和HepG2细胞(HepG2)作对照.观察转染后绿色荧光蛋白(GFP)的表达;转染后16 h开始用油酸钠处理各组细胞24、48 h(分别命名为HBx/OA组、空/OA组、G2/OA组),细胞内甘油三酯(TG)含量测定及油红O染色了解细胞内脂质沉积情况;在油酸钠处理细胞24h,RT-PCR法检测SREBP-1和LXRα的mRNA表达水平,Westernblot检测HBx、LXRα及FAS蛋白表达水平.结果 转染后16 h HepG2-HBx细胞和HepG2- pIRES2细胞中开始有GFP的表达,提示转染成功;仅在HepG2-HBx细胞内有HBx表达,表明HepG2-HBx细胞模型构建成功.在相同油酸钠处理的条件下,HBx/OA组细胞内脂质含量和TG含量与对照组相比均明显增加(P＜0.01).在油酸钠处理细胞24h,HBx/OA组细胞内LXRα、SREBP-1的mRNA表达量和LXRα、FAS蛋白表达量较对照组均明显增加(P ＜0.01/0.05).结论 HBx通过上调HBx-LXRα-SREBP1/FAS通路脂质合成相关基因表达,可能增加HepG2-HBx细胞对外界脂代谢紊乱因素的易感性,从而增加油酸钠诱导HepG2细胞脂质沉积.     

软脂酸对肝癌HepG2细胞脂质沉积的影响和Srebp1c甲基化调控机制

目的观察饱和游离脂肪酸(软脂酸,PA)对HepG2细胞脂质沉积的影响和固醇调节元件结合蛋白1c(Srebp1c)甲基化调控机制。方法体外培养人肝癌细胞系HepG2细胞,对照组不作处理,软酯酸(PA)组用0.2mmol/L的PA刺激细胞。采用油红O染色检测HepG2细胞内脂质沉积情况;qPCR和Western blot分别测定细胞内基因和蛋白表达;甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测HepG2细胞Srebp1c甲基化状态。结果 0.2 mmol/L的PA刺激能使HepG2细胞发生脂质沉积。与对照组比较,PA组HepG2细胞Srebp1c(P=0.004 6)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)(P=0.023 0)和脂肪酸合酶(FAS)(P=0.012 5)的mRNA表达均异常升高,Srebp1c蛋白表达升高(P0.05),Srebp1c启动子甲基化水平降低(P=0.0253)。结论游离脂肪酸可以导致HepG2细胞脂质沉积性损伤,Srebp1c甲基化程度降低可能是重要原因。     

二氢杨梅素上调SIRT1信号通路改善HepG2细胞甘油三酯蓄积

目的 探究二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)对肝细胞脂质代谢的影响及其与SIRT1信号通路的关系.方法 0.2 mmol/L棕榈酸(palmitic acid,PA)处理HepG2细胞24 h,诱导为脂肪变性肝细胞模型,再用0、5、10、20μmol/L DHM及20 μmol/L DHM+2μmol/L SIRT1抑制剂(EX527)分别干预24 h,CCK-8检测细胞增殖活性,油红0染色检测细胞脂滴形成情况,酶偶联比色法检测甘油三酯(triglyceride,TG)含量,蛋白免疫印迹法检测沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)、固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)的表达.结果 0.2 mmol/L PA和5、10、20 μmol/L DHM对细胞增殖活力没有显著影响(P＞0.05);5、10、20 μmol/L DHM处理后明显减少脂肪变性的HepG2细胞脂滴蓄积和甘油三酯含量(P＜0.01),增加磷酸化的AMPK(p-AMPK)和SIRT1的表达水平,并且降低脂质合成相关基因SREBP-lc、FAS、磷酸化的ACC(p-ACC)的蛋白表达,SIRT1抑制剂能显著增加脂肪变性的HepG2细胞的甘油三酯含量(P＜0.01),削弱DHM对脂肪变性HepG2细胞SREBP-1c、FAS、P-ACC表达的抑制作用.结论 DHM通过上调脂肪变性HepG2细胞SIRT1信号通路改善肝细胞脂肪变性.