大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型的建立

目的：建立大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变的机制研究提供载体。方法：酶消化及自然传代法分离培养大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞，观察其形态学变化。采用MTT法测定第Ⅲ代软骨细胞的生长曲线。采用免疫细胞化学法检测其特征性Ⅱ型胶原的表达情况，对该模型进行鉴定。结果：大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞表达特征性Ⅱ型胶原。第Ⅲ代细胞培养在生长第13天后，细胞分裂能力明显下降，核仁不清，细胞变形明显，以梭形为主，折、旋光性弱，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴；Ⅱ型胶原合成明显下降，细胞增殖率显著降低；呈现自然退变过程。结论：建立椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变机制研究提供较好的细胞学基础。     

Sox9基因在人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型中的表达变化及意义

目的:观察Sox9基因在人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型中的表达变化,探讨其在人颈椎终板软骨细胞退变过程中的作用及意义。方法:选取2011年7～11月在皖南医学院附属弋矶山医院脊柱外科住院接受前路椎体次全切手术的颈椎病患者和颈椎骨折或脱位患者30例,分为对照组(12例)和颈椎病组(18例),建立人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型。运用RT-PCR法检测终板软骨细胞退变过程中Sox9、Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因的表达变化。结果:对照组原代终板软骨细胞大部分呈圆形,而颈椎病组原代终板软骨细胞呈梭形为主;与对照组相比,Sox9基因mRNA的表达明显下降(t=17.973,P<0.01),受其调控的蛋白多糖及Ⅱ型胶原基因基因mRNA的表达均相应减低(t=15.685、9.264,P值均<0.01);Sox9基因mRNA与蛋白多糖基因及Ⅱ型胶原基因mRNA的表达均存在正相关(r=0.976、0.958,P值均<0.01)。结论:Sox9基因在人颈椎终板软骨细胞退变过程中可能起着重要的作用,调节Sox9基因在人颈椎终板软骨细胞中的表达可能是治疗人颈椎椎间盘退变的一条新途径。     

退变腰椎软骨终板细胞生物学特征实验研究

目的 通过对人腰椎软骨终板细胞的培养,观察细胞的形态学和生物学性状,探讨影响其生物学行为的因素.方法 取腰椎退变和未退变终板软骨细胞,在加10%灭火胎牛血清的DMEM培养液中培养.建立体外终板软骨细胞培养模型,采取HE染色、绘制细胞生长曲线、Annexin-V/PI法、免疫组织化学染色、real-time PCR等方法,对细胞形态、活力、生长情况、凋亡、及软骨细胞基质合成进检测.结果 软骨终板细胞可以在体外进行培养;终板软骨细胞的生长情况及细胞表型类似关节软骨,有Ⅱ型胶原表达.退变软骨终板较未退变软骨终板活性及增殖能力降低.细胞凋亡增加,Ⅱ型胶原合成减少.结论 体外成功培养了人腰椎终板软骨细胞,并证明了退变软骨终板细胞凋亡增加,而活性降低,基质合成减少.该研究也为进一步研究终板软骨的生物学性状奠定基础.     

磷酸化p38MAPK及ANK在终板软骨细胞退变模型中表达的变化

目的:探讨终板软骨细胞退变后磷酸化p38MAPK和ANK的表达变化。方法:取大鼠腰椎终板软骨细胞,酶消化法及自然传代法分离培养大鼠终板细胞,建立终板软骨细胞体外自然退变模型。采取甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色法,对该模型进行鉴定。以western-blot检测原代及第四代磷酸化p38MAPK及ANK的表达;RT-PCR检测原代及第四代Ank基因mRNA表达。结果:与原代相比第四代终板软骨细胞磷酸化p38MAPK表达量明显增加(P<0.01);ANK表达量明显下调(P<0.05)。结论:终板软骨细胞的退变伴随p38MAPK表达增强和ANK蛋白的表达减弱,两者与终板软骨细胞的退变存在明显关联,提示通过调控p38MAPK和ANK的表达可能影响终板软骨细胞的退变,可能有助于阻止终板软骨的退变。     

大鼠腰椎终板软骨细胞的培养及其生物学性状的研究

目的通过对大鼠腰椎终板软骨细胞的培养，观察细胞的生物学性状，探讨终板软骨细胞的生物学行为厦影响因素。方法取犬鼠腰椎终板软骨细胞，在加10％灭活胎牛血清的F12-DMEM培养液中培养，建立体外终板软骨细胞培养模型。采取绘制细胞生长曲线、HE、甲苯胺蓝染色厦免疫组织化学染色等方法，对细胞形态、活力、生长情况厦软骨细胞的表型进行鉴定。结果终板软骨细胞可以在体外培养，但细胞活力随着培养时间的延长厦传代逐渐降低；终板软骨细胞的生长情况厦细胞表型类似于关节软骨，有Ⅱ型胶原和aggrecan的表达。结论体外成功培齐了大鼠腰椎终板软骨细胞，为进一步研究终板软骨在椎间盘退变中的作用打下了基础。     

骨形态发生蛋白-7对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因的调节作用

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因表达的调节作用.方法 应用逆转录聚合酶链反应检测不同浓度BMP-7对培养的人椎间盘细胞中软骨特异性基因Sox9和Ⅱ型胶原基因表达的影响.结果 在10ng/ml、100ng/ml、1000ng/mlBMP-7作用下,其对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因mRNA可起到显著的正向调控作用.结论 BMP-7可以按照剂量依赖方式正向调节椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因的表达.提示BMP-7对退变早期的椎间盘具有一定的修复功能.     

人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型的建立及其意义

目的 建立人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,观察人正常颈椎椎体和退变颈椎椎体终板软骨细胞的形态及表征.方法 选择2010年7月至2011年7月49例颈椎骨折、脱位(19例)及颈椎病(30例)患者术中取出的颈椎终板软骨,用酶消化法分别分离培养人正常颈椎椎体终板软骨细胞(对照组)和退变颈椎椎体终板软骨细胞(颈椎病组);用倒置显微镜和HE染色法观察细胞形态学变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线;甲苯蓝染色及反转录-PCR(RT-PCR)法对终板软骨细胞进行鉴定;RT-PCR法检测终板软骨细胞特征性基因蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原的表达.结果 人颈椎椎体终板软骨细胞表达特征性蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原,其生长情况及细胞表型类似于关节软骨细胞.对照组原代终板软骨细胞以多角形为主,增殖速度较快;而颈椎病组原代终板软骨细胞以梭形为主,细胞增殖速度较慢.颈椎病组原代终板软骨细胞表达的蛋白多糖基因(0.695 ±0.052)和Ⅱ型胶原基因(0.726 ±0.035)均低于对照组(0.950±0.032、0.907±0.078,t=7.263、3.681,P=0.002、0.021),Ⅰ型胶原基因则高于对照组(0.795±0.028比0.552±0.070,t=-5.560,P=0.005).结论 成功建立了人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,为椎间盘退变机制研究提供了较好的细胞学基础,解决了以前一直以动物细胞模型为研究对象的局限性.     

骨形态发生蛋白-7对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因的调节作用

目的探讨骨形态发生蛋白-7（BMP-7）对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因表达的调节作用。方法应用逆转录聚合酶链反应检测不同浓度BMP-7对培养的人椎间盘细胞中软骨特异性基因Sox9和Ⅱ型胶原基因表达的影响。结果在10ng/ml、100ng/ml、1000ng/mlBMP-7作用下,其对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因mRNA可起到显著的正向调控作用。结论BMP-7可以按照剂量依赖方式正向调节椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因的表达。提示BMP-7对退变早期的椎间盘具有一定的修复功能。     

椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变的相关性研究

目的 探讨椎体软骨终板内软骨细胞凋亡和椎间盘退变之间的关系.方法 40只成年新西兰白兔,随机平均分为实验组和对照组.实验组采用阻断椎体软骨终板营养途径的方法制作椎间盘退变模型,对照组不做任何处理.术后4周和8周,每组各处死10只动物,切取软骨终板和相应的椎间盘组织.TUNEL法检测终板软骨细胞的凋亡数,免疫组织化学方法检测椎间盘内Ⅱ型胶原阳性细胞数,并对两组数据进行相关性分析.结果 实验组软骨终板内凋亡的软骨细胞在4周、8周时分别为9.9±O.88个/视野和12.4±0.71个/视野,较对照组明显增加,4周、8周组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).相关分析显示,术后4周和8周终板软骨细胞凋亡与Ⅱ型胶原表达之间有高度的相关性,相关系数分别为0.86和0.82(均P＜0.05),表明椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变之间存在有高度的相关性.结论 阻断椎体软骨终板营养途径可导致椎间盘退变的发生,椎体终板软骨细胞凋亡增加可导致椎问盘内Ⅱ型胶原表达进一步减少.     

大鼠膝关节软骨细胞体外培养去分化时间的实验研究

目的:观察大鼠膝关节软骨细胞体外培养后自然退变时间,为骨关节炎研究提供合适靶细胞。方法:大鼠膝关节软骨细胞体外培养,传代,行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色鉴定软骨细胞,通过Western Blot检测其特征性Ⅱ型胶原的表达情况对传代软骨细胞表型进行鉴定。结果:大鼠膝关节第5代软骨细胞和前4代比较,Ⅱ型胶原表达明显减少(P<0.05),结论:大鼠膝关节软骨细胞体外培养前4代能维持正常的软骨细胞表型,第5代开始发生退变,前4代可以做为软骨细胞研究的靶细胞。     

JNK phosphorylation promotes degeneration of cervical endplate chondrocytes throughdown-regulation of the expression of ANK in humans

Background C-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway and ankylosis gene (ANK) play a critical role in endplate chondrocytes degeneration.The purpose of this study was to investigate whether the expression levels of ANK was associated with the activation of JNK.Methods Cartilage endplates of 49 patients were divided into the control group (n=19) and the experimental group (n=30).The patients in the control group were graded 0 and those in the experimental group were graded Ⅰ-Ⅲ according to Miller's classification.Endplate chondrocytes were isolated by enzyme digestion and cultured in vitro.The inverted phase contrast microscope,teluidine blue staining,HE staining,real time RT-PCR,and MTT were used to observe morphological appearances,biological characteristics,and growth curve of endplate chondrocytes from the cartilage endplate of the two groups.Real time RT-PCR and Western blotting were used to analyze the mRNA and protein expression levels of associated factors in the degeneration process in the cultured endplate chondrocytes with or without subjected SP600125.Results The expression levels of type Ⅱ collagen,aggrecan,and ANK in endplate chondrocytes of experimental group were lower than that of control group and phosphorylation level of JNK in the experimental group which was higher than that in the control group.Application of JNK phosphorylation inhibitor to degeneration chondrocytes resulted in a marked decrease in the phosphorylation level of JNK and a significant increase in the expression levels of type Ⅱ collagen,aggrecan,and ANK.Conclusion The degeneration of the human cervical endplate chondrocytes might be promoted by JNK phosphorylation by down-regulating the expression of ANK     

不同下颌前伸力对髁突软骨细胞中Sox9和Ⅱ型胶原表达的影响及其意义

目的:探讨施加不同作用方式的下颌前伸力后大鼠髁突软骨细胞中Sox9及Ⅱ型胶原表达水平,阐明不同作用方式的下颌前伸力对其表达及软骨形成的影响。方法：将28只5周龄雄性Wistar大鼠按下颌前伸力的不同作用方式随机分为动态组、静态组、功能组和对照组(n=7)。各组大鼠按照设定的相关参数接受不同的下颌前伸力刺激。2周后实验结束时取颞下颌关节标本,行免疫组织化学染色,对髁突软骨细胞中Sox9和Ⅱ型胶原的表达进行半定量分析。结果：对照组、动态组和功能组大鼠髁突软骨细胞中Sox9阳性表达细胞数显著高于静态组（P<0.01）,动态组和对照组大鼠髁突Sox9阳性表达面积显著高于静态组和功能组（P<0.01）,功能组Ⅱ型胶原阳性表达面积显著高于其他3组（P<0.01）,静态组Ⅱ型胶原阳性表达面积显著高于对照组（P<0.05）。结论：下颌前伸力的作用方式及作用时间是调控髁突软骨细胞中Sox9及Ⅱ型胶原表达水平的关键因素。