HIV-1感染的小动物模型

[目的]对感染SARS-CoV的恒河猴进行病毒、血清学等指标检测及研究,确定模型动物成功感染,并为SARS发病机制,疫苗评价,药物筛选确定参考指标。[方法]SARSCo-V经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。[结果]用巢式RT-PCR在感染后每天提取的咽拭子标本中检测SARS-CoV的RNA,以细胞培养冠状病毒为阳性对照,以正常恒河猴咽拭子为阴性对照,在8只动物病毒接种第5天开始可检测到大小为797bp的目的条带,阳性检出最长可持续到第15天。进一步用病毒分离实验对PCR结果进行确证,8只动物中的5只恒河猴接种5天的咽拭子标本中,经Vero细胞培养,细胞产生了典型细胞病变(CPE),提示SARS冠状病毒能感染恒河猴并有病毒的复制和排毒。IFA方法证实为SRAS-CoV抗原存在。SARS-CoV感染恒河猴后,可以检测出免疫反应。在SARS冠状病毒接种前和接种后第5、8、11、15、19、23、26、30、34、每隔4-7天以及安乐死时采血,制备血清测定抗体,8只恒河猴接种病毒前均血清中SARS冠状病毒特异性抗体IgG为阴性,10天后安乐处死的5只感染猴在11-15天开始,至安乐死时,均为阳性。IgG阳性的5只恒河猴均有一定的中和抗体产生,且对SARS病毒感染细胞有一定的保护性。感染SARS病毒猴后与正常猴比较,其细胞杀伤效应明显增强。感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。     

恒河猴感染SARS-CoV的病毒学、血清学检测

目的对感染SARS-CoV的8只恒河猴进行病毒学、血清学指标检测。方法SARS-CoV经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐处死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。结果RT-PCR证实感染病毒检出时间为5~16d,8只猴中的5只分离到了病毒,感染15d后可检测到抗体。结论感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。     

大鼠自发性乳腺癌瘤株的建立和病理学研究

[目的]评价重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂对预防治疗SARS-CoV病毒感染恒河猴的作用。[方法]10只恒河猴随机分为2组,每组5只。分别为试验组(重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂)和对照组(空白干扰素)。分别在攻毒前19h和1h,攻毒后7h、23h、31h、47h、55h、71h、95h和119h不同时间经鼻吸入受试物,0.4ml/只。按计划定时取咽拭子做real-timePCR检测和病毒分离;取静脉血做病毒分离检测、中和抗体、IgG、血常规、血生化和血凝指标。[结果]1.SARS感染对照组:全部动物咽拭子标本经real-timePCR均检出SARS-CoV病毒,持续时间从攻毒后2天至8天。攻毒后2天3只、5天1只、7天2只,其咽拭子标本中病毒分离阳性,进一步证实病毒在体内的复制。攻毒后,诱导产生高滴度的抗体和中和抗体,证实病毒感染。大体解剖全部动物肺脏为灰白色,有大面积出血,其中2只动物肺脏与胸壁有粘连,组织病理称典型SARS肺炎性病变。2.干扰素试验组:和对照组相同时间取的咽拭子等标本中,real-timePCR检测和病毒分离均未检出病毒。攻毒后病毒导致机体产生的中和抗体和IgG抗体的反应很弱。血常规、血生化和血凝指标结果表明干扰素试验组动物攻毒后各项指标较试验前比较没有显著性改变;大体解剖动物肺脏为灰粉色,4只动物肺脏有少量出血,其中1只动物肺脏与胸壁有粘连,组织病理未见典型SARS肺炎性病变。因而认为,重组人干扰素α2b鼻腔喷雾剂可以有效阻断SARS-CoV病毒对恒河猴的感染;;为预防人类感染SARS提供参考。     

SARS-CoV病毒抗体对恒河猴SARS-CoV的感染保护作用

目的研究了实验感染产生中和抗体以及输入SARS-CoV中和抗体对SARS-CoV感染恒河猴的保护作用。方法动物分3组，分别为SARS感染恢复动物组，输入抗SARS阳性血清动物组和SARS模型对照组，分别接种病毒，1—7d进行病毒检测和血清学检测，7d后安乐处死动物，进行病理检测。结果实验感染产生中和抗体，输入SARS-CoV中和抗体的恒河猴体内SARS-CoV复制得到一定程度的抑制，病理变化也比模型组轻。结论SARS—CoV中和抗体（包括被动免疫）是一种有潜力的SARS治疗方法。     

SARS-CoV感染猴模型病毒学研究

建立SARS-CoV病毒分离培养方法,确定SARS-CoV病毒感染动物后在不同时间和不同组织病毒的复制和存活时间,并比较中国恒河猴和食蟹猴对病毒的敏感性,筛选出对SARS冠状病毒敏感的动物,完善SARS冠状病毒感染猴模型的病毒学指标。方法:SARS-CoV经鼻腔接种实验用猴,定期采集动物的鼻咽拭子、血浆和组织标本进行病毒分离培养,分离出来的病毒用免疫荧光方法和中和试验等方法进行测定。结果:SARS冠状病毒均可感染恒河猴和食蟹猴,在鼻咽拭子、血浆和组织中可以分离到病毒。结论恒河猴和食蟹猴均可作为SARS感染动物模型,而病毒分离培养可以作为感染模型的重要指标。     

SARS-CoV动物模型研究之中国现状

目的综合对比SARS-CoV感染的恒河猴、布氏田鼠及Lewis大鼠的病理学、免疫学以及病毒的复制与外排情况的变化,来探讨此三种动物在建立SARS模型上的特点。方法SARS病毒感染8只恒河猴、9只Lewis大鼠和20只布氏田鼠,在感染后不同时间安乐死动物,应用光镜对动物的各脏器进行病理观察研究;用病毒分离和RT-PCR方法检测病毒外排与复制的情况;用ELISA法检测动物产生特异性抗体情况。结果在SARS-CoV感染恒河猴、Lewis大鼠和布氏田鼠后,肺组织均出现一定的与人类SARS疾病相似的病理改变,在动物体内均可检测到活病毒或病毒核酸,并可检测到特异性IgG抗体的存在。在病死率上布氏田鼠最高;在病毒的复制与外排方面恒河猴的检出率最高,持续时间最长;在抗体产生情况上恒河猴与Lewis大鼠基本相似;在病理变化上恒河猴病变最重且最为复杂,与人类SARS疾病的病理变化最为接近。结论布氏田鼠,Lewis大鼠,特别是恒河猴动物模型可以用于SARS发病机制、疫苗和药物的研发,恒河猴动物模型是目前研究SARS疾病最理想的动物模型。     

SARS恢复猴和灭活疫苗免疫实验猴再次感染SARS-CoV研究

目的研究SARS-CoV实验感染恢复猴，以及灭活疫苗免疫猴对SARS—CoV再次感染的疾病状况。方法动物分四组，分别为SARS感染恢复动物组，灭活疫苗免疫不同时间2组和SARS模型对照组。动物分别接种病毒，1～7d进行病毒检测和血清学检测，7d后安乐处死动物，进行病理检测。结果实验感染SARS-CoV猴和灭活疫苗免疫猴均产生了中和抗体，猴体内SARS-CoV复制得到一定程度的抑制，病理变化也比SARS-CoV模型组轻。结论SARS-CoV感染恢复猴对SARS-CoV再次感染有一定抵抗作用；灭活疫苗免疫是预防实验猴感染SARS—CoV的有效方法。     

SARS病原体的检测及其在动物模型鉴定及疫苗评价中的应用

目的:通过RT-PCR及病毒分离等方法，鉴定SARS感染性动物模型是否成立，并对疫苗效果进行评估。方法:选用3周岁的健康SPF级恒河猴8只，分为SARS实验感染动物模型组及疫苗组(Sino 3 SARS灭活疫苗20030904批肌内注射，免疫2次)。经鼻吸入Sino 1 SARS毒株，病毒攻击后7d动物进行安乐死。自病毒攻击后的第一天起每日连续采集动物咽拭子标本，病毒攻击后的第二天、第五天、第七天采集血浆标本。将标本进行病毒分离及RT-PCR检测．结果：模型组动物病毒攻击后第一天至第七天咽拭子RT-PCR检测均为阳性。注射疫苗组动物仅在病毒攻击后第一天咽拭子RT-PCR检测呈阳性。模型组动物血浆RB-PCR检测呈现阳性，疫苗组动物血浆RT-PCR检测均为阴性。病毒分离结果显示仅在模型动物咽拭子标本中分离到病毒，未在疫苗组动物的咽拭子标本分离到病毒．血浆标本中均未分离到病毒．结论：RT-PCR及病毒分离可以及时有效地检测出病毒在体内的复制情况，可作为模型鉴定、疫苗评估及药物筛选的重要手段。     

SARS-CoV恒河猴模型动物中组织病理学动态变化

目的在感染的8只恒河猴的SARS-CoV模型动物中,观察肺等组织中出现的系列病理学改变,为针对抗SARS药物筛选、疫苗评价中的免疫病理反应等奠定实验依据。方法SARS-CoV经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第5、7、10、15、20、30和60天,分别安乐处死动物,组织病理取材,制片,观察。结果经病毒分离和RT-PCR证实动物感染是成功的。系列病理改变表明,早期肺组织可见间质性肺炎,水肿、结构破坏、出血,巨噬细胞浸润;后期出现内皮细胞受损及再生,透明膜形成,小血管玻璃样变,肺组织纤维化及肺气肿形成,肺泡网状纤维和弹力纤维破坏并增生等,脾脏、淋巴结生发中心早期有萎缩,后期有恢复等病理学改变均和SARS患者相似。结论感染恒河猴出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,为进一步研究该病毒的病原特性、发病机理、药物筛选、疫苗评价等方面的研究奠定了重要基础。     

气管插管法接种H5N1病毒感染恒河猴及系统组织病毒检测

目的测试气管插管法接种高致病性禽流感病毒H5N1感染恒河猴的优势效果及疾病分析,为有效感染恒河猴、制备H5N1疾病模型提供实验依据。方法使用人源H5N1病毒液经气管插管滴入恒河猴上呼吸道进行感染,观察感染恒河猴的临床表现,每天采集咽拭子、鼻灌洗液,在感染前2 d感染后第3、5、7天采血,感染后第3和7天分别解剖1只恒河猴,取支气管淋巴结、肠淋巴结、鼻甲、心、肝、脾、肺、肾、肠、气管、脑及血液进行病毒分离、核酸载量检测和血常规测定。结果感染后第2天恒河猴出现食欲下降,活动减少,并伴有一过性体温升高,白细胞数和淋巴细胞数下降。咽拭子、鼻灌洗液、肺、心、气管、脑、肝、肾、肠和血液中都能分离到H5N1病毒。结论气管插管法接种H5N1病毒能有效感染恒河猴,并在猴体内多组织中分离、检测到病毒,为制备完善的H5N1模型和检测指标确定、进一步研究H5N1病毒的致病机制等奠定了基础。     

SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity

Objective To develop a specific SARS virus-targeted antibody preparation for emergent prophylaxis and treatment of SARS virus infection. Methods By using phage display technology, we constructed a naive antibody library from convalescent SARS patient lymphocytes. To obtain the neutralizing antibody to SARS virus surface proteins, the library panning procedure was performed on purified SARS virions and the specific Fab antibody clones were enriched by four rounds of repeated panning procedure and screened by highthroughput selection. The selected Fab antibodies expressed in the periplasma of E. coli were soluble and further purified and tested for their binding properties and antiviral function to SARS virus. The functional Fab antibodies were converted to full human IgG antibodies with recombinant baculovirus/insect cell systems and their neutralizing activities were further determined. Results After four rounds of the panning, a number of SARS-CoV virus-targeted human recombinant Fab antibodies were isolated from the SARS patient antibody library. Most of these were identified to recognize both natural and recombinant SARS spike （S） proteins, two Fab antibodies were specific for the virus membrane （M） protein, only one bound to SARS-CoV nucleocapsid protein. The SARS-CoV S and M protein-targeted Fab or IgG antibodies showed significant neutralizing activities in cytopathic effect （CPE） inhibition neutralization test, these antibodies were able to completely neutralize the SARS virus and protect the Vero cells from CPE after virus infection. However, the N protein-targeted Fab or IgG antibodies failed to neutralize the virus. In addition, the SARS N protein-targeted human Fab antibody reacted with the denatured N proteins, whereas none of the S and M protein specific neutralizing antibodies did. These results suggested that the S and M protein-specific neutralizing antibodies could recognize conformational epitopes which might be involved in the binding of virions to cellular receptors and the fusion activity of the virus Conclusion The SARS-CoV spike protein and membrane proteins are able to elicite efficient neutralizing antibodies in SARS patients. The neutralizing antibodies we generated in this study may be more promising candidates for prophylaxis and treatment of SARS infection.     

SARS Research in China

The first case of severe acute respiratory syndrome(SARS)in Guangdong province was reported on2Jan2003,whileretrospective survey has datedthe first index case on16Nov2002.In months that followed,pandemic of SARS widelyspread over the world until July2003,infecting8454people and claiming908deathsin39countries andregions global-ly.On16Dec2003,a32years old photographerlivinginsuburban Guangzhou presented withsymptoms of SARSinfec-tion.There were3other ensuing cases betweenthe end of2003and…     

The 53rd annual meeting of the Japanese Association for Laboratory Animal Science

[目的]探讨乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠模型筛选抗HBV药物的可行性。[方法]用公认抗HBV复制药物拉米夫定对我们建立高复制HBV转基因鼠进行实验,选我们建立的1.3copy高复制HBV转基因小鼠20只,随机分成两组,每组10只。采用灌胃针灌胃法给药。对照组灌喂生理盐水,实验组灌喂拉米夫定,剂量为100mg/kg,每天2次,连续灌21d,每7d采血1次。荧光定量PCR检测血清中HBVDNA。[结果]实验组用拉米夫定前小鼠血清HBVDNA5.50±0.42(拷贝数log10数值),3周后HBVDNA已显著降低(4.63±0.57),4周后,小鼠血清HBVNDA为4.08±0.51,停药1周后,再次检测血清HBVDNA,小鼠血清HBVDNA又恢复正常水平(5.70±0.39)。[结论]我们建立的高复制HBV转基因小鼠模型验证了拉米夫定对HBV复制的抑制程度和持续时间,表明该模型可应用于抗HBV药物的筛选、评价研究。     

SARS恒河猴动物模型比较病理学研究

目的综合对比 SARS 患者和恒河猴动物模型的病理学改变,为恒河猴动物模型应用于阐明 SARS 病变机制等研究提供理论依据。方法 SARS 病毒感染8只恒河猴,在感染后不同时间安乐死动物,应用光镜、组织化学、免疫组化法对动物的各脏器进行观察研究,并与人类 SRAS 患者的病理改变进行比较。结果人类 SARS 患者的主要病理变化主要包括肺部病变,免疫器官损伤及全身中毒性脏器损伤三方面,恒河猴动物模型出现的病理改变基本符合人类 SARS 病变特点。结论SARS 病毒感染的恒河猴具有类似人类 SARS 的病理改变,可以作为 SARS 发病机制等研究的模型动物。