胃癌细胞血管生成拟态的形态学及机制研究

目的:血管生成拟态(Vasculogenic mimicry,VM)是近年来发现的一种全新的肿瘤微循环模式.本研究通过体外三维培养的方式对胃癌细胞血管生成拟态进行形态学的研究,并探讨其可能的分子机制.方法:体外三维培养SGC-7901细胞,观察其是否可以形成血管生成拟态.免疫细胞化法检测参与血管生成拟态形成的胃癌细胞中MMP-2与MT1-MMP的表达水平.观察PI3K信号通路抑制剂对MMP-2和MT1-MMP的表达水平及对胃癌细胞血管生成拟态的影响.结果:胃癌细胞SGC-7901在体外三维培养条件下能够形成血管生成拟态.参与血管生成拟态的癌细胞中MMP-2与MT1-MMP高表达.PI3K信号通路抑制剂能够抑制MMP-2与MT1-MMP的表达,导致SGC-7901细胞血管生成拟态的能力明显降低.结论:体外三维培养时胃癌细胞SGC-7901具有形成血管生成拟态的能力.PI3K信号通路的抑制剂可以抑制胃癌血管生成拟态的形成,其机制之一可能是通过抑制MMP-2与MT1-MMP的表达.     

基质金属蛋白酶-1和膜型1基质金属蛋白酶在胆囊癌血管生成拟态中的表达及临床意义

目的 探讨基质金属蛋白酶-1 （MMP-1）和膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）在胆囊癌血管生成拟态中的表达及临床意义.方法 收集手术病理确诊的原发性胆囊癌74例和胆囊腺瘤、慢性胆囊炎各10例的石蜡标本及相关临床资料,应用免疫组化测定上述病变组织的MMP-1、MT1-MMP表达.应用Kaplan-Meier生存比较、Cox风险模型分析与胆囊癌血管生成拟态（VM）的相关性和临床意义.结果 ①胆囊癌MMP-1、MT1-MMP表达明显高于胆囊腺瘤、胆囊炎（P＜0.000 1）;VM（＋）胆囊癌MT1-MMP表达明显高于VM（-）胆囊癌（P=0.003 9）,而MMP-1则无差别.②MMP-1表达与VM（-）胆囊癌的Nevin分期（P=0.003 6）、分化程度（P=0.010）、肝转移（P=0.003）和淋巴结转移（P=0.002）正相关;MT1-MMP表达与VM（-）或VM（＋）胆囊癌的Nevin分期（P=0.013或P=0.033）、浸润深度（P=0.045或P=0.035）、淋巴结转移（P=0.046或P=0.025）和肝转移（P=0.030或P=0.027）正相关;MMP-1、MT1-MMP表达与VM（-）胆囊癌正相关.③VM（＋）胆囊癌MT1-MMP表达在Nevin S3-s5期（P =0.000 1）、侵犯浆膜（P=0.001）、淋巴结转移（P =0.000 2）和肝转移（P=0.004）同样分组条件下分别明显高于VM（-）胆囊癌;MMP-1仅在肝转移组,VM（＋）胆囊癌表达显著高于VM（-）（P=0.038）.④无论在MMP-1、MT1-MMP单独表达阳性或二者均阳性,VM（＋）胆囊癌患者术后5年生存期都明显短于VM（-）组（P=0.025 1或P=0.022 5或P=0.025 0）.Cox多因素分析表明,VM、浸润深度、淋巴结转移、肝转移、手术方式是影响胆囊癌患者预后的独立因素.结论 胆囊癌MMP-1、MT1-MMP高表达,MT1-MMP表达与胆囊癌VM相关,MMP-1则与胆囊癌VM无关.MMP-1,MT1-MMP可作为评判胆囊癌Nevin分期、浸润深度、淋巴结或肝转移及判断预后的重要指标;而MT1-MMP还可作为判断胆囊癌否存在VM和VM胆囊癌预后的重要指标.     

逆转录病毒介导shRNA抑制Mig-7基因对人肝癌细胞血管生成拟态及体外侵袭转移的抑制作用

目的探讨逆转录病毒介导的短发夹RNA（shRNA）干扰迁移诱导基因7（Mig-7）对肝细胞癌（HCC）细胞血管生成拟态 （VM）形成及体外侵袭转移能力的影响。方法设计2条Mig-7 mRNA寡核苷酸序列（Mig-7 shRNA-1,Mig-7 shRNA-2）和1条 作为负对照的无关序列（Mig-7 shRNA-N）。构建Mig-7shRNA 逆转录病毒表达载体质粒,并将要接受转染的人肝癌细胞 MHCC-97H分为6组：转染Mig-7 shRNA-1组;转染Mig-7 shRNA-2组;转染Mig-7 shRNA-N组;转染空载质粒组（Vector）;重 组人血管内皮抑素（ES,商品名：恩度）组;MHCC-97H细胞对照组（Control）。半定量PCR、Western blot检测其对Mig-7表达的 影响;三维细胞培养观察其对VM形成的影响;细胞间粘附实验、Transwell侵袭实验及迁移实验观察其对细胞粘附、侵袭及迁移 能力的影响。结果转染后,Mig-7 shRNA-1组与Mig-7 shRNA-2组中Mig-7 mRNA与蛋白的表达、MHCC-97H细胞形成VM 能力、细胞侵袭、迁移能力明显减低（P<0.05）,细胞间粘附能力明显增加（P<0.05）;Mig-7 shRNA-N 组、Vector 组、ES 组中 MHCC-97H细胞Mig-7的表达、VM形成、细胞间粘附、迁移、侵袭能力较MHCC-97H细胞组均无明显变化。结论逆转录病毒 介导的shRNA能够有效下调Mig-7的表达并明显抑制HCC细胞VM形成能力及侵袭转移能力,增加细胞间的粘附作用;ES对 HCC细胞的Mig-7表达、VM形成、侵袭转移及粘附能力无明显影响。     

MIG7调节肝细胞癌中血管生成拟态的形成及其对肝癌转移潜能的影响

目的探讨肝细胞癌（HCC）中迁移诱导基因7（ MIG7）的表达与血管生成拟态（VM）形成的相关性,以及MIG7的表达与不同肝癌细胞株VM形成能力及转移潜能的关系。方法应用免疫组织化学方法分析配对的40例HCC原发灶及其转移灶标本中MIG7蛋白的表达和VM形成情况;应用三维培养技术培养不同转移潜能的人肝癌细胞株（高转移潜能肝癌细胞MHCC-97H、低转移潜能肝癌细胞MHCC-97L和非转移肝癌细胞Huh-7）及人正常肝细胞L-02,分别检测VM形成情况; 应用RT-PCR技术检测不同转移潜能肝癌细胞中 MIG7 mRNA的水平;应用Western blot技术检测不同转移潜能肝癌细胞株中MIG7蛋白表达水平。结果①40例配对的HCC原发灶和相应转移灶中,MIG7蛋白的表达与VM形成呈正相关（ rs=0.595,PMIG7 mRNA和蛋白表达及VM的形成能力均大于低转移潜能肝癌细胞株MHCC-97L及非转移肝癌细胞株Huh-7。人正常肝细胞L-02未见VM形成。结论MIG7高表达的肝癌组织中VM形成能力强,MIG7通过调节VM的形成影响HCC的侵袭转移,MIG7是抑制HCC侵袭转移的潜在靶点。     

骨形成蛋白-2对肺癌A549细胞膜型基质金属蛋白酶-1表达的影响

目的:探讨骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对人肺癌A549细胞膜型基质金属蛋白酶-1(membrane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP)表达的影响.方法:Western杂交检测MT1-MMP蛋白质表达.采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测细胞培养液中活性基质金属蛋白晦-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的浓度.结果:BMP-2可促进A549细胞MT1-MMP蛋白质表达,并呈剂量和时间依赖关系.ELISA进一步显示BMP-2可增加A549细胞培养液中活性型MMP-2的含量.结论:BMP-2可促进A549细胞MT1-MMP的表达及MMP-2的激活.肺癌组织中BMP-2表达的增加可通过促进肺癌细胞MT1-MMP表达及MMP-2激活而促进肺癌细胞的侵袭转移,此可能为肺癌侵袭转移的另一重要机制.     

鳖甲煎丸通过RhoA/ROCK信号通路抑制肝癌细胞血管形成拟态的生成

目的观察鳖甲煎丸对肝癌细胞血管生成拟态（VM）形成的作用及其对RhoA/ROCK通路信号分子和VE-cadherin、PI3K 表达的影响,探讨鳖甲煎丸抑制肝细胞肝癌（HCC）转移侵袭的分子机制。方法将40只雄性SD大鼠随机分为4组,分别以鳖甲 煎丸高（H）、中（M）、低剂量（L）及生理盐水（N）灌胃,4 d后采血,制备药物血清。肝癌HepG2细胞体外Matrigel三维培养,药物 血清及RhoA/ROCK抑制剂Y-27632（P）干预24 h后,应用图像采集和分析系统检测各组VM形成情况,采用Western blotting技 术检测各组细胞RhoA和ROCK1的表达水平,ELISA法检测各组细胞培养上清中VE-cadherin、PI3K的含量。结果鳖甲煎丸 可显著抑制HepG2 细胞VM的生成,且VM管径显著高于阴性对照组（P<0.01）,Y-27632 完全抑制了HepG2 细胞VM的生成 （P<0.01）;同时,鳖甲煎丸和Y-27632 都能够抑制HepG2 细胞中RhoA、ROCK1 的表达（P<0.05）,降低细胞培养上清中VEcadherin 、PI3K的表达水平（P<0.05）。结论鳖甲煎丸可抑制肝癌细胞VM的形成,其作用机制可能与其能抑制三维培养的 HepG2细胞中RhoA/ROCK通路信号分子及VE-cadherin、PI3K的表达有关。     

过表达miR-23b-3p对甲状腺未分化癌FRO细胞侵袭和迁移的影响

目的探讨miR-23b-3p对甲状腺未分化癌(ATC)FRO细胞侵袭和迁移能力的影响。 方法qRT-PCR法检测52例ATC癌组织及其癌旁组织中miR-23b-3p和锌指E盒结合同源框1(ZEB1)的表达水平,并分析两者的相关性。培养人ATC细胞株FRO,将miR-23b-3p mimic及其阴性对照转染至FRO细胞中,qRT-PCR检测miR-23b-3p和ZEB1 mRNA表达水平。体外三维培养观察细胞血管生成拟态(VM)形成能力;Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力;Western blotting检测ZEB1、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表达水平,双荧光素酶报告实验验证miR-23b-3p和ZEB1的靶向调控关系。 结果ATC组织中miR-23b-3p表达水平低于癌旁组织,而ZEB1的表达水平高于癌旁组织,且两者在ATC组织中的表达水平呈负相关。过表达miR-23b-3p能显著下调ZEB1表达水平,抑制FRO细胞VM形成以及侵袭和迁移能力,同时抑制细胞中VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达。荧光素酶报告实验证实ZEB1是miR-23b-3p的靶基因。 结论过表达miR-23b-3p可能通过靶向下调ZEB1表达抑制FRO细胞的侵袭和迁移能力。     

罗勒多糖对乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭的影响

目的 观察罗勒多糖对乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭性的影响。方法 将体外培养的MDA-MB-231细胞分为实验组和对照组。实验组细胞用不同浓度罗勒多糖（100、300μg/mL）处理,对照组不加任何刺激因子。Transwell小室检测细胞侵袭能力,RT-PCR、Western blotting方法检测与侵袭相关的基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）的表达。结果 ①罗勒多糖可抑制MDA-MB-231细胞的侵袭力（P<0.01）;②罗勒多糖抑制MT1-MMP分子的mRNA表达（P<0.05）及下调其蛋白表达水平。③罗勒多糖对MMP-2及MMP-9分子的mRNA表达无影响。结论 罗勒多糖可通过下调MT1-MMP的表达抑制MDA-MB-231细胞的侵袭。     

RNA干扰抑制血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的实验研究

目的 探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)shRNA真核表达载体(pGenesil-1-MT1-MMP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)MT1-MMP基因mRNA表达及蛋白表达的影响.方法 构建质粒表达载体pGenesil-1-MT1-MMP和pGenesil-1-HK;实验分为3组:空白对照组,阴性对照组(加入pGenesil-1-HK),RNA干扰(RNAi)组(加入pGenesil-1-MT1-MMP).用脂质体瞬时转染VSMC,48 h后通过荧光显微镜观察转染效果,流式细胞仪检测转染效率.于转染后72 h采用RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA表达水平,用Western blot方法检测MT1-MMP蛋白质表达水平.结果 瞬时转染VSMC 48 h后通过流式细胞仪检测转染效率高达85.5%,转染pGenesil-1-MT1-MMP质粒72 h后,RNAi组MT1-MMP mRNA及蛋白质水平明显下调(P<0.05).结论 靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒能够高效地转染入VSMC,并能有效下调MT1-MMP基因mRNA和蛋白的表达.     

MT1-MMP在乳腺癌中的独特表达模式

目的探讨MT1-MMP在乳腺癌患者肿瘤组织中的表达特点。方法采用免疫组化、半定量RT-PCR和原位杂交方法分别
检测43例乳腺癌组织中MT1-MMP蛋白和mRNA的表达,研究MT1-MMP在乳腺癌组织中的表达特点。结果采用免疫组化
方法检测乳腺癌组织中MT1-MMP蛋白表达,发现阳性染色位于癌细胞胞膜;而采用原位杂交的方法检测到MT1-MMP mRNA
的阳性染色位于乳腺癌癌巢周围的间质细胞。采用半定量RT-PCR方法检测癌组织中MT1-MMP mRNA表达,所有标本均有
MT1-MMP mRNA的表达,其中MT1-MMP免疫组化阳性染色的乳腺癌组织中相对表达量高（0.759±0.0802）;在MT1-MMP免
疫组化阴性染色的乳腺癌中相对表达量低（0.547±0.0886）,差异有统计学意义（P<0.01）。结论MT1-MMP 很可能是由乳腺癌
癌巢周围的间质细胞产生,激活后锚于癌细胞膜发挥作用,MT1-MMP在乳腺癌组织中的产生和作用有其独特的特点。
     

赖氨酰氧化酶对胃癌细胞血管生成拟态的影响

目的 研究赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase,LOX）对胃癌细胞MGC-803和BGC-823体外血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）的影响.方法 培养胃癌细胞,分别加入含有不同浓度LOX或LOX的抑制剂β-氨基丙腈（beta-aminopropionitrile,BAPN）作用72h,用过碘酸雪夫（periodic acid-schiff stain,PAS）染色方法检测VM形成的数量.结果 在两种胃癌细胞株中,随着LOX浓度的增加,VM形成的数量也增加,LOX浓度与VM的形成呈正相关（r=0.847和r=0.851）;此效应可被BAPN抑制,随着BAPN的浓度增加,VM形成的数量相应减少,BPAN与VM的形成呈现负相关（r=-0.791和r=-0.834）.结论 外源性添加LOX可以促进胃癌MGC-803和BGC-823细胞株VM的形成.     

Ki-67与血管生成拟态在原发性肝细胞癌中的表达及意义

目的：探讨 Ki-67与血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）在原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）中的表达情况。方法：取87例 HCC 石蜡标本,运用免疫组织化学染色法检测Ki-67的表达,并运用过碘酸雪夫（periodic acid-schiff stain,PAS）和 CD34双染色法进一步标记VM。结果：Ki-67高表达组VM阳性率高于Ki-67低表达组,差别具有统计学意义（P〈0.05）。结论：肝细胞癌组织内存在VM表达,且与癌细胞的Ki-67表达密切相关,Ki-67可能参与 VM的形成,是 VM形成的机制之一。     

肝细胞肝癌中EphA2表达与血管生成拟态及临床病理的关系

目的探讨肝细胞肝癌中EphA2表达与血管生成拟态及临床病理的关系及临床意义。方法收集2007年6月—2012年7月接受肝细胞癌切除术的石蜡标本207例,应用免疫组化和CD31、PSA双重染色技术检测EphA2蛋白的表达和血管生成拟态的存在,并分析与临床病理之间的联系。结果 EphA2蛋白的阳性率为76.81%,其表达与肝硬化、Edmondson分级、肿瘤分期有关（P〈0.05）;且VM与EphA2蛋白表达之间存在呈正相关联系（γ=0.1432,P=0.0396）。结论 EphA2蛋白的高表达可能促进VM形成,同时VM与EphA2联合检测对肝细胞肝癌的进展及预后判断有重要意义。     

从胆囊癌的一种新血供方式--血管生成拟态看胆囊癌诊疗观点改变

从胆囊癌的一种新的血液供应方式——血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）论述胆囊癌诊疗观点的改变。1994.1—2000.12同济医院确诊的74例原发性胆囊癌标本及其临床病理学和人口统计学资料;H＆E染色＋CD31/PAS双重染色（Envision法）,胆囊癌VM（＋）/（-）临床参数单/多因素、Cox模型风险和Kaplan-Meier生存分析＋log-rank检验。细胞、动物实验：胆囊癌GBC-SD、SGC-996细胞二/三维培养,侵袭力、迁移力、VM形成测定和倒置光显微镜、透射/扫描电镜VM形态学观察以及动态磁共振荷瘤鼠胆囊癌移植瘤血流动力学检测。信号通道研究：胆囊癌细胞三维培养和裸鼠移植瘤VM组织切片的免疫组化、免疫荧光、Western blotting、QRT-PCR检测,以探讨相关信号通道。13.5%（10/74）胆囊癌存VM,其中4.3%（13/306）管腔内含红细胞,即胆囊癌VM是高倍光学显微镜下由胆囊癌细胞围成管腔、内衬癌细胞而非血管内皮细胞、有圈PAS阳性界膜分隔、腔内含红细胞的管道结构;VM（＋）胆囊癌腺癌居多,有较高的血行转移机会;VM是影响胆囊癌患者预后的独立危险因素,有VM存在胆囊癌患者生存期短,预后差。体外胆囊癌GBC-SD细胞三维培养、荷瘤鼠胆囊癌石蜡切片经H＆E染色和CD31/PAS双重染色,光/电镜观察,85.7%存在VM,其VM结构与临床结果一致;MRI增强扫描提示,荷瘤裸鼠胆囊癌移植瘤中心或瘤体周围存在VM血供而不致出现肿瘤坏死而呈现MRI强化信号。发现胆囊癌存在VM-相关PI3-K/MMPs/Ln-5γ2和EphA2/FAK/Paxillin信号通路。高侵袭胆囊癌存在VM这一特殊生物学特性。因高侵袭胆囊癌VM不能被常规病理学检测,故建议对临床恶性程度高、易血行转移、预后差胆囊癌,常规开展胆囊癌标本CD31/PAS双重染色检查。对胆囊癌根治术后复发、辅助化疗＋抗血管生成靶向疗效差者,应考虑存在VM,采取?     

Amotl2促进肝细胞肝癌血管生成拟态及EMT形成

目的:研究Amotl2对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响及其在诱导肝癌上皮间充质转化（EMT）及血管生成中的作用。方法:将Amotl2过表达质粒和干扰质粒分别转染至肝癌细胞系HepG2和Bel7402中,Western blot检测转染前、后HepG2和Bel7402中Amotl2、EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin）表达变化情况;划痕、侵袭实验检测Amotl2对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响;三维培养检测Amotl2对HCC细胞形成血管样结构的影响。结果:促进Amotl2表达后HepG2表现出EMT样改变,E-cadherin表达下降、Vimentin表达上升、细胞迁移侵袭和三维成管的能力增强。抑制Amotl2表达后Bel7402由间质样表型转变为上皮样表型,E-cadherin表达上升、Vimentin表达下降、细胞迁移侵袭和三维成管的能力减弱。结论:Amotl2可能通过诱导EMT促进原发性肝癌的迁移侵袭能力和血管生成拟态的形成。     

原发性肝癌中血管生成拟态的表达和预后相关性分析

目的:探讨原发性肝癌中是否存在血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM),进一步探究VM在原发性肝癌中与肝硬化、临床分期、病理分级、组织分型的关系及预后相关性分析。方法:收集142例经手术治疗、临床及随访资料完整的原发性肝癌患者的病理蜡块,重新切片,采用CD31、PAS双重染色观察VM的表达情况,分析VM表达的临床意义。结果:在原发性肝癌和正常肝组织中VM阳性率分别为38.7%(55/142)和0%(0/15)(P<0.01);VM的表达与原发性肝癌的临床分期、肿瘤大小、肝细胞癌Edmondson分级呈正相关(P<0.05);VM的表达与是否伴有肝硬化相关(P<0.05);VM阳性组与阴性组12个月、24个月、36个月的生存率分别为46%/72%,35%/52%,19%/44%,差异有统计学意义。结论:原发性肝癌中存在VM;缺血、缺氧可诱导VM的表达;表达VM者临床分期更晚;肝硬化可增加VM的表达;表达VM者生存率更低。