截短型A组轮状病毒VP6在E.coli中的高效表达

目的：研究A组轮状病毒（RV）组特异性抗原（VP6）片段的表达，为RV免疫检测技术提供材料。方法：以pcDNA3.1 VP6为模板，通过PCR扩增得到VP6的截短突变体编码基因VP6 1，将其插入谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX 5X，在E.coli中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。对表达产物进行SDS PAGE和Western blot分析。通过改变宿主菌、培养基、IPTG浓度和培养温度等条件，提高目的蛋白的可溶性表达水平，使用GST Sepharose 4B亲合层析进行初步纯化。结果：选定VP6 氨基酸12～143片段为目的蛋白， PCR扩增其396?bp的编码基因片段，构建出pGEX 5X VP6 1。将该重组质粒转化E.coli后，SDS PAGE和Western blotting 分析均显示，含有截短VP6蛋白的重组融合蛋白GST::VP6 1在E.coli中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％。该蛋白主要以包涵体形式存在，经条件优化，最终通过低浓度IPTG、低温诱导提高重组蛋白的可溶性表达水平，GST亲和层析可对其进行初步纯化。结论：VP6 1蛋白在E.coli中可被高效表达和纯化，为下一步制备抗VP6的特异性单克隆抗体并用于免疫检测打下基础。     

JC病毒衣壳蛋白VP1在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 构建JC病毒衣壳蛋白VP1基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化该蛋白. 方法用PCR方法扩增患者尿液中JC病毒衣壳蛋白VP1的基因,测序正确后将其克隆入pET-32a(+)原核表达载体,IPTG诱导表达VP1融合蛋白.大量表达该融合蛋白并用镍柱亲和层析法纯化. 结果成功构建重组表达载体,30℃,IPTG诱导可见有融合蛋白表达,存在形式为包涵体.该融合蛋白相对分子质量约为59kDa.Western blot证明融合蛋白具有很好的抗原性.用镍柱亲和层析法成功纯化出VP1融合蛋白.结论 成功表达VP1融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

柯萨奇病毒A16型VP1~VP4基因克隆及其表达产物的抗原相关性分析

目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1~VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法
分别扩增出VP1~VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,
用柯萨奇病毒A16型病毒免疫兔血清及肠道病毒71型病毒免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA分析其抗原
相关性及交叉反应性。结果成功构建的重组质粒pQE30a/VP1~VP4并经IPTG诱导,重组蛋白VP1~VP4高效表达并纯化成
功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1~VP4可以被CVA16免疫兔血清特异识别,部分与肠道病毒71型免疫血清存
在交叉反应。结论在大肠杆菌M15中高效表达出柯萨奇病毒A16型VP1~VP4蛋白,经纯化产物具有较强的抗原反应性。
     

肠道病毒71型VP1～VP4基因克隆及其表达产物的免疫原性

目的克隆并表达肠道病毒71型VP1~VP4蛋白基因,初步鉴定其免疫原性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1~VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用8 mol/L尿素洗涤及Ni柱亲和层析纯化后,用肠道病毒71型免疫兔血清和柯萨奇病毒A16型免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA鉴定。结果构建的重组质粒pQE30a/VP1~VP4经IPTG诱导,重组蛋白VP1~VP4高效表达并纯化成功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1~VP4可以被免疫兔血清特异识别。结论肠道病毒71型VP1~VP4蛋白表达载体在大肠杆菌M15中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为今后EV71亚单位疫苗的研究和检测试剂盒提供了参考。     

人细小病毒B19中国株结构蛋白VP1的克隆及表达

目的 :构建人细小病毒B1 9中国株结构蛋白VP1基因片段的重组表达载体 ,探索大量表达VP1蛋白的最佳条件。　方法 :从该科保存的人细小病毒B1 9中国株结构蛋白VP1基因片段的重组克隆载体中获得VP1基因片段 ,将该片段亚克隆入表达载体pQE 30 ,构建VP1 pQE 30原核表达载体 ,并转化至感受态大肠杆菌M1 5中 ,给予不同浓度诱导剂异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)及在不同温度下进行诱导表达。　 结果 :成功构建了融合蛋白VP1 pQE 30的重组表达质粒 ,表达的融合蛋白经 1 5 %SDS PAGE电泳证实其相对分子质量为 2 2 0 0 0。IPTG浓度为 1mmol/L ,诱导表达 5h ,37℃下无表达 ,2 5℃下有表达 ;采用不同的IPTG浓度诱导表达 5h ,0 .0 5mmol/L至 1mmol/L均有表达 ,表达率相近 ,为 (1 6± 1 ) %。　结论 :获得人细小病毒B1 9中国株结构蛋白VP1基因片段的原核表达载体及其产物 ,对进一步研究其纯化及制备单克隆抗体和疫苗有重要意义     

肠道病毒71型VP1基因的表达纯化及初步应用

摘　要：目的 表达纯化肠道病毒71型（EV71）VP1蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法。方法 通过化学法合成肠道病毒EV71型VP1全基因序列,构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,转化大肠杆菌Bl21（DE）3 ,IPTG诱导表达,镍金属亲和层析纯化目的蛋白,产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。以目的蛋白作为包被抗原,初步建立间接ELISA 检测方法。结果 成功构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,表达纯化出较高纯度的EV71 VP1融合蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA 检测方法。检测77份6-10岁健康儿童、手足口病现症患儿血清中抗EV71 VP1 IgG抗体阳性率分别为51.22%、61.11%。结论 表达产物具有较好的免疫原性,可用于肠道病毒EV71抗体检测试剂盒的研制。     

人微小病毒B19 VP2蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的：利用原核系统表达人微小病毒B19的重组蛋白抗原,为建立ELISA方法诊断B19病毒感染提供特异性抗原。方法：采用PCR方法扩增B19 VP2基因,将之插入到T载体中进行测序,验证序列正确后再重组入原核表达载体pET-30a( ),并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行诱导表达。用SDS-PAGE分析表达产物。表达产物经亲合层析柱纯化得到VP2重组蛋白抗原。用B19 VP2 IgG对该蛋白进行了Western-Blot分析。结果：筛选出2株B19 VP2蛋白抗原高表达菌株,经IPTG诱导后,表达VP2重组蛋白量占菌体总蛋白量的24．6％。结论：VP2重组蛋白具有良好的抗原活性。     

重组沙门菌侵袭蛋白A的原核表达与纯化

目的在大肠杆菌中表达重组沙门菌侵袭蛋白A，并对表达产物进行分离和纯化。方法提取沙门菌基因组模板，PCR扩增侵袭因子invA基因目的片段，插入表达质粒载体pET-30c（＋）中，构建pET—invA重组子，经双酶切和测序证实后，转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），异丙基-β-D硫代半乳糖（IPTG）诱导重组蛋白表达，镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组蛋白，SDS—PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果成功构建了沙门菌pET—invA大肠杆菌表达重组子，实现了该蛋白在大肠杆菌中的高效表达，分离纯化的表达产物纯度达到电泳纯。结论沙门菌侵袭蛋白A的成功表达和分离纯化，为该蛋白的免疫学性能研究、相应抗体的制备以及沙门菌快速检测方法的建立奠定了基础。     

肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因部分序列在大肠杆菌中的表达

目的 克隆、表达和鉴定肠道病毒71型广州株EVGZ06VP1基因部分序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础.方法 在成功克隆肠道病毒71型广州株EVGZ06全长VP1蛋白基因并测序的基础上,将部分VP1蛋白基因克隆到表达载体pET28a( )上,构建了重组表达质粒pET28a( )/(502～891)VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2 亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法 检测其抗原性.结果 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量为19 000,与预计大小一致.ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性.结论 本研究成功克隆和表达了肠道病毒71型VP1基因部分序列,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

天津市2018—2020年人轮状病毒株VP7、VP4和NSP4基因特征

目的 对天津流行的人A组轮状病毒VP7、VP4和NSP4基因进行分型和序列特征分析。方法 收集2018—2020年天津市急性腹泻A组轮状病毒（Rotavirus group A, RVA）阳性病例的粪便标本,提取核酸,进行RT-PCR扩增VP7、VP4和NSP4基因片段全长并进行测序和进化树分析。结果 本次研究所有RVA均属于G9P[8]基因型,进化树分析其VP7和VP4基因分别属于G9-VI和P[8]-3亚型。分析NSP4基因片段发现19株为E1型,12株为E2型。TJ株VP7、VP4、NSP4与疫苗株和参考株比对发现在关键位点有氨基酸替代现象。31个TJ-VP7氨基酸序列与 Rotavac G9 和Rotasiil G9 VP7相比,各有4个和3个替换位点。31例天津株VP8*核苷酸序列与Rotarix P[8]-1和RotaTeq相比,各有6个和3个氨基酸差异。天津株VP5*核苷酸与两种疫苗相比,仅在RotaTeq的5-1区I388L这一处发现氨基酸位点变异情况,其余11个氨基酸位点高度保守;而与Rotarix5-1到5-5区氨基酸序列完全一致。TJ E1株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI和ASII区分别有2和3个氨基酸位点发生变异;TJ E2株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI-ASIV分别有3、8、2和5个氨基酸位点发生替换。2018—2020年在天津地区检测到19株G9P[8]-E1型RVA,12株G9P[8]-E2型RVA,这是首次在天津发现G9P[8]-E2重组基因型。结论 与同基因型疫苗株和参考株相比,位于TJ株VP7、VP4和NSP4抗原位点的改变对于疫苗保护效力的影响还需进一步研究。需要对轮状病毒分子变异和重组现象进行持续监测,不只是单一监测G/P分型情况,要考虑多基因片段共同分析和全基因组测序,以便及时追踪和掌握轮状病毒的重组和变异情况。     

我国人细小病毒B19VP1和VP2部分基因序列测定及变异分析

目的 探讨B19病毒中国株的基因变异。方法 采用长片段聚合酶链反应技术，从中国再障患儿血清中扩增HPVB19-XA2株的VP1独特区基因和VP1/VP2基因片段，进行核苷酸序列分析。结果 B19-XA2株的VP1独特区和VP1/VP2连接区基因大部分区域核苷酸序列被测定，其与国外Au株基因核苷酸序列比较，有4个核苷酸突变，并引起编码的2个氨基酸改变。结论 我国B19病毒VP1基因独特区和VP1/VP2连接区基因序列与Au株相比有变异。     

轮状病毒VP7基因的克隆与表达

目的 构建轮状病毒VP7的重组表达质粒,在大肠杆菌中对其进行表达.方法 克隆编码轮状病毒VP7的基因.并在原核表达系统中表达了带有6 xHis标签的融合蛋白.结果 经双酶切鉴定和基因测序证明成功重组了轮状病毒VP7基因的pQE-30重组质粒;蛋白质PAGE电泳表明,获得了分子量约为48000 Mr的蛋白质.结论 本研究获得了重组的轮状病毒VP7蛋白.     

轮状病毒新型VP6基因的拼接合成和序列测定

目的：设计获得轮状病毒（RV）新型VP6基因．方法：本研究在前期工作的基础上，对RV VP6基因的优化合成方法进行了探索研究．我们应用改良的嵌套式PCR策略，通过逐步拼接法对RV VP6基因进行了优化改造．结果：成功地合成了优化的RV VP6基因cDNA序列，该序列长约1220bp，（G＋C）含量达55％．结论：与野生型RV VP6基因相比，优化合成的RV VP6基因（G＋C）含量提高了约20％，这一工作为新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础．     

VP-16诱导前列腺癌细胞PC-3凋亡的研究

为研究ＶＰ－１６对雄激素非依赖性前列腺癌细胞ＰＣ－３凋亡的诱导作用,应用ＨＥ染色观察细胞的形态学改变,以ＤＮＡ凝胶电泳和流式细胞术（ＦＣＭ）分析细胞凋亡和细胞周期分布,同时应用３Ｈ－ＴｄＲ掺入法研究ＶＰ－１６对ＰＣ－３细胞ＤＮＡ合成的影响。结果表明,（１）凋亡的ＰＣ－３细胞呈明显的形态学改变;（２）ＤＮＡ断裂呈梯形变化;（３）ＰＣ－３细胞凋亡率随ＶＰ－１６作用浓度增加和时间延长逐渐增高;（４）ＶＰ－１６能够明显抑制ＰＣ－３细胞ＤＮＡ的合成。提示ＶＰ－１６可诱导前列腺肿瘤细胞凋亡。     

VP 16-213 in acute myelogenous leukaemia

The use of the epipodophyllotoxin VP 16-213 is described in twenty patients with acute myelogenous leukaemia resistant to other chemotherapy. The drug was usually given in 5-day courses of 50 mg/m² daily and occasionally in 24-hr infusions of 250 mg/m², on the basis of its phase-activity.     

VP-16诱导卵巢癌细胞株凋亡的研究

用苔盼蓝、吖啶橙染色、电子显微镜及DNA凝胶电泳等方法进行VP-16对卵巢癌细胞株影响的研究，旨在探讨其杀死肿瘤细胞的作用机制。结果表明，VP-16能使卵巢癌细胞出现典型的凋亡，且表现出时间和浓度的依赖性，DNA电泳呈现梯形改变，证明VP-16可诱导卵巢癌细胞发生程序性死亡，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。     

肠道病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP1外壳蛋白单克隆抗体。方法:利用重组纯化的EV71-VP1蛋白为抗原免疫BALB/c鼠,按常规杂交瘤技术进行细胞融合,对阳性杂交瘤细胞进行筛选及亚克隆,获得1株能稳定分泌抗EV71-VP1抗体的杂交瘤细胞株6F2B9,细胞体外扩大培养后的上清用Protein G柱纯化,超滤后用BCA法测其浓度,用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,间接ELISA方法检测其效价和特异性,间接免疫荧光法检测其与EV71病毒的特异性结合能力。结果:本研究得到的抗EV71-VP1抗体DSE-136,纯化后浓度为1.9 g/L,免疫球蛋白亚类为IgG2b,轻链属于κ链;间接ELISA检测效价为1∶3.2×105;间接免疫荧光结果显示其可与EV71病毒特异性结合。结论:成功制备出1个效价高、特异性好的抗EV71-VP1单克隆抗体DSE-136,为VP1抗原诊断、疫苗研发及其效果评价奠定了基础。     

肠道病毒71型VP3结构蛋白的原核表达

目的 利用大肠杆菌原核表达系统优化表达纯化肠道病毒71型(EV71)VP3结构蛋白,为后续单克隆抗体制备及检测试剂盒研发提供前期基础.方法 采用PCR方法扩增EV71病毒VP3基因,将其插入表达载体pET28a(+),构建pET28a-VP3重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,分别在25 ℃、37 ℃下经IPTG诱导表达,重组表达的蛋白产物经凝胶电泳初步分析,比较不同温度诱导表达的蛋白产物.结果 成功构建pET28a-VP3重组质粒,不同温度下诱导表达的蛋白产物在30.5 kDa左右位置均出现目的条带;37 ℃下诱导表达的蛋白超声破碎并离心后,目的蛋白基本位于沉淀中,而25 ℃诱导表达的蛋白产物有少量目的蛋白溶解于上清液中. 结论 在25 ℃或37 ℃下均能利用大肠杆菌原核表达系统有效表达EV71病毒VP3蛋白;37 ℃诱导时蛋白可融性表达低,目的蛋白获取效率较高.     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达

目的：构建重组质粒柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus group A type 16,CA16）VP1,并进行原核表达及鉴定。方法用PCR方法扩增CA16 VP1序列,构建其重组表达质粒pET21b-CA16 VP1,并转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,间接ELISA方法检测重组蛋白CA16 VP1的抗原性和有效性。结果成功原核表达并纯化了CA16 VP1蛋白,可与小鼠抗CA16病毒血清特异性结合,与太原市老年人群中部分血清存在高反应性。结论 CA16 VP1蛋白获得成功表达,ELISA检测具有良好的抗原性和有效性,为CA16诊断试剂盒的研究奠定基础。