黄芪多糖对体外培养大鼠软骨细胞内糖胺多糖合成的影响及其机制

目的：研究黄芪多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖（GAG）合成的影响。方法：分离大鼠关节软骨细胞传代培养并加入IL-1β造模,分别将100,10,1,0.1 mg/L的黄芪多糖作用于该软骨细胞,以4.5 mg/L的硫酸氨基葡萄糖作为阳性对照。其后检测细胞增殖、细胞内GAG含量、细胞内葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ（GlcAT-1）mRNA含量和透射电镜观察细胞形态学改变。结果：各浓度的黄芪多糖均对大鼠软骨细胞增殖率无影响。100 mg/L的黄芪多糖可以增加软骨细胞内GAG的合成（P〈0.01）;1,10,100 mg/L的黄芪多糖能够增加GlcAT-1 mRNA的表达。结论：黄芪多糖能逆转IL-1β对体外培养的大鼠软骨细胞GAG合成的抑制作用,其主要机制可能与促进GlcAT-1的表达有关。     

硫酸氨基葡萄糖对大鼠软骨细胞增殖的影响

目的：探讨硫酸氨基葡萄糖（GS）对大鼠软骨细胞体外增殖的影响。方法：采用二次酶消化法获得大鼠关节软骨细胞进行传代培养,并对第四代细胞进行药物干预,利用MTT比色、免疫组化检测增殖细胞核抗原（PCNA）、流式细胞术检测细胞周期等方法检测各代次大鼠软骨细胞和药物干预后第四代软骨细胞的增殖情况。结果：大鼠软骨细胞随传代培养,MTT比色显示增殖呈下降趋势,免疫细胞化学检测PCNA表达减少,流式细胞术显示细胞增殖指数下降;硫酸氨基葡萄糖可以抑制这一趋势,促进传代培养的细胞增殖能力。结论：GS对传代培养的大鼠软骨细胞的增殖能力有明显促进作用。     

透骨消痛胶囊含药血清对退变关节软骨细胞表达TNF-α、IL-1β的影响

目的观察透骨消痛胶囊含药血清对体外培养的大鼠退变软骨细胞表达肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）的影响,探讨透骨消痛胶囊防治骨性关节炎的作用机制。方法 4周龄SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,采用Ⅱ型胶原原位杂交法对第3代软骨细胞进行鉴定。用10 ng.mL-1IL-1β干预第3代软骨细胞复制退变软骨细胞模型。模型复制成功后,随机分为模型组和透骨消痛胶囊含药血清组,分别在培养24、48、72 h后用TaqMan real-time PCR法检测各组mRNA表达。结果透骨消痛胶囊含药血清组TNF-αmRNA、IL-1βmRNA相对表达量随着干预时间的延长逐渐下降,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论透骨消痛胶囊治疗骨性关节炎的部分作用机制是有效抑制退变软骨细胞TNF-α、IL-1β的表达。     

不同年龄大鼠VSMCs培养及衰老相关β-半乳糖苷酶的表达

目的：培养出不同年龄组SD大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）,探讨VSMCs复制衰老过程。方法：取出主动脉,0．2％Ⅱ型胶原酶溶液消化分离细胞,培养,按比例1：3传代。免疫细胞化学鉴定平滑肌细胞β-actin。制备老年组、年轻组的第2．6、11代细胞爬片,用SA-β-gal工作液染色,显微镜下计数蓝染细胞阳性,计算衰老细胞率。结果：免疫细胞化学染色显示细胞纯度在95％以上。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色显示随代龄增加,衰老细胞数量增加（P〈0．05）;第6、11代龄,老年组衰老细胞率较年轻组高。结论：1．单纯Ⅱ型胶原酶消化法可以成功培养出不同年龄组大鼠主动脉VSMCs。2．培养的SD大鼠VSMCs表现出复制衰老过程,这可能为探讨细胞衰老及其与年龄相关的疾病机制提供新的视角。     

黄芪甲苷对人成纤维细胞光老化的抑制作用

目的：观察黄芪甲苷对长波紫外线（ultraviolet A,UVA）辐射导致的人成纤维细胞衰老的抑制作用,以及对基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1,MMP-1）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）等老化相关基因表达的影响。方法：分离培养人原代成纤维细胞,将亚融合状态的培养细胞分为空白对照组、黄芪甲苷组、UVA组和UVA＋黄芪甲苷组,以10J/cm2UVA进行照射,并加入20μg/mL黄芪甲苷干预处理。采用组织化学染色法检测衰老相关β半乳糖苷酶表达,以酶联免疫吸附法检测上清液中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的含量,实时聚合酶链反应法检测MMP-1和TIMP-1的mRNA表达水平变化。结果：空白对照组及黄芪甲苷组β半乳糖苷酶阳性细胞均较低,UVA组β半乳糖苷酶阳性细胞数则显著升高,加入黄芪甲苷处理可使β半乳糖苷酶阳性细胞比率明显降低（P〈0.05）。黄芪甲苷处理可以促进成纤维细胞分泌TGF-β1;UVA照射成纤维细胞后TGF-β1分泌量明显降低,UVA照射前加入黄芪甲苷可增加TGF-β1分泌量（P〈0.05）。此外,UVA能够诱导MMP-1和TIMP-1的mRNA表达水平升高,而黄芪甲苷可在一定程度上抑制MMP-1mRNA表达,并诱导TIMP-1mRNA表达（P〈0.05）。结论：黄芪甲苷可有效延缓人成纤维细胞光老化进程,其机制可能与促进TGF分泌和抑制胶原降解相关。     

氟浓度对体外培养大鼠软骨细胞糖胺多糖和Ⅱ型胶原分泌的影响

目的 探讨氟浓度对体外培养软骨细胞糖胺多糖（GAG）和Ⅱ型胶原分泌的影响.方法 取2月龄雌性SD大鼠下肢髋关节及膝关节软骨,分离、培养出软骨细胞后,接种于细胞培养瓶,经鉴定后,分为空白对照组和NaF受试组（6.25 μmol/ml、12.50μmol/ml、25.00 tmol/ml、50.00 μmol/ml和100.00 μmol/ml）,孵育6d后,分别进行GAG含量测定、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果 NaF受试6d后,大鼠软骨细胞培养液GAG含量各组无显著性差异（P＞0.05）;阿利新蓝染色显示,大鼠软骨细胞内的糖原异染颗粒亦无明显差异;Ⅱ型胶原免疫组化染色则显示,不同剂量NaF可引起对软骨细胞外Ⅱ型胶原染色积分随剂量的升高逐渐上升（P＜0.05）.结论 NaF对大鼠软骨细胞GAG分泌可能无影响,但可能影响Ⅱ型胶原的分泌.     

bFGF、IGF-Ⅰ对兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insuline-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）单独及联合应用对体外培养多次传代的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。探讨传代多次的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法：第3、5、7代体外培养的兔关节软骨细胞，以常规培养组作为对照组，bFGF（5ns／m1）或和IGF-Ⅰ（100ng/ml）单独刺激及联合刺激作为实验组，免疫组化法测定Ⅱ型胶原的定性表达，并通过图像分析作半定量分析。结果：对照组细胞第5代以后无阳性表达。第3、5、7代细胞在bFGF或IGF-Ⅰ刺激下。Ⅱ型胶原表达强度显著高于对照组（P〈0．01）；bFGF和IGF-Ⅰ联合作用下，Ⅱ型胶原表达强度均显著高于单独以bFGF或IGF-Ⅰ刺激组（P〈0．05）。结论：bFGF、IGF-Ⅰ能促进多次传代软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，且联合应用时促进作用更为明显。多次传代软骨细胞在生长因子刺激下，仍有再分化的能力。而有成为软骨组织工程种子细胞的可能。     

骨髓间充质干细胞二维培养条件下向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨二维培养条件下转化生长因子-β1(TGF-β1)体外诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为软骨细胞的方法.方法 取SD大鼠的股骨及胫骨,采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSC,取第4代BMSC行流式细胞术检测鉴定其表面抗原,分别以含1、5、10、15和20ng/mL的TGF-β1的诱导培养基在二维培养条件下对第4代BMSC诱导培养,2周后采用免疫组化法对Ⅱ型胶原进行定性检测,采用二甲基亚甲蓝(DMB)比色法定量检测诱导后细胞外基质糖胺多糖(GAG)的表达情况.结果 贴壁培养法可分离并纯化sD大鼠的BMSC,所得第4代BMSC细胞表面抗原CD44阳性,CD34、CD45阴性.经诱导培养2周后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组化染色显示TGF-β15、10、15和20ng/mL组阳性,二甲基亚甲蓝(DMB)比色法检测显示实验组细胞外基质糖胺多糖(GAG)含量均明显增加(P<0.00),其中TGF-β110 ng/mL组细胞分泌的GAG显著多于其他剂量组(P<0.00).细胞分泌GAG的能力与细胞密度呈正相关(r=0.822,P<0.01).结论 贴壁培养法可以获得较纯的BMSC,该实验所用的诱导体系可成功将BMSC诱导为软骨细胞;TGF-β110ng/mL组诱导后细胞合成糖胺多糖(GAG)的能力强于其他剂量组,在该实验的细胞密度范围内其诱导后细胞合成糖胺多糖(GAG)的能力与细胞密度呈正相关.     

转化人关节软骨细胞的Ⅱ型胶原表型诱导

目的 用离心管聚集体培养（Aggregate culture)诱导转化人关节细胞的Ⅱ型胶原。方法 将体外长期培养的第30，40，50代转化软骨细胞消化后进行离心管培养，比较细胞在单层培养，离心管聚集体培养，以及在普通培养基，RAI诱导培养基下[2型骨形态发生蛋白（BMP－2）＋抗坏血酸盐（Ascorbate) 胰岛素（insulin)]，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原的表达和胞外基质发生情况。结果 在单层培养条件下，转化软骨细胞只表达Ⅰ型胶原，而在BAI诱导培养基及离心管聚集体培养下转化软有细胞表达的Ⅱ型胶原和大量胞外基质。结论 离心管聚集体培养是诱导转化软骨细胞Ⅱ型胶原的有效方式。     

重组人转化生长因子-β1荧光质粒的构建及转染软骨细胞的基因表达

目的：探讨重组人转化生长因子（TGF）-β1荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况.方法：体外酶消化分离法培养兔关节软骨细胞并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞染色进行鉴定.双酶切法切取TGF-β1的cDNA片段,通过T4 DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上构建pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒.用构建的pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒经脂质体转染软骨细胞,在12、24 h、2、4、6 d通过荧光显微镜观察细胞内TGF-β1基因的表达,应用荧光定量PCR检测表达水平.结果：成功分离培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞染色显示细胞胞质染成棕黄色,胞核基本不着色.pEGFP-C1-TGF-β1真核表达载体质粒成功构建,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确.荧光显微镜观察转染后的软骨细胞有绿色荧光蛋白表达,软骨细胞的转染率分别为12 h：（8.22±2.02）%,24 h：（16.54 4±2.91）%,2 d：（14.06±3.67）%,4 d：（14.24±2.62）%,6 d：（12.36±2.28）%.荧光定量PCR检测转染软骨细胞TGF-β1基因拷贝数为16 277±1779,高于未转染软骨细胞的3095±205（P〈0.05）.结论：构建的TGF-β1荧光质粒可以转染软骨细胞并获得表达,为基因治疗骨性关节炎的研究提供基础.     

氨基葡萄糖及硫酸软骨素对豚鼠软骨组织结构及组织中糖胺多糖含量的影响

目的观察氨基葡萄糖（GS）及硫酸软骨素（CS）对原发性骨关节炎（OA）模型雌性豚鼠膝关节软骨组织结构和组织中糖胺多糖（GAG）含量的影响。方法取120只2周龄雌性豚鼠随机分为3个试验组和1个空白对照组。空白对照组给予蒸馏水（对照组）,试验组分别给0．5％GS（GS组）,0．25％CS（CS组）,0．5％GS＋0．25％CS（联合使用组）,分别于给药前,给药1个月、2个月、3个月、4个月和5个月后,每组各取5只动物膝关节进行组织病理学（HE染色）和组织化学（PAS、Alcian Blue、和Mallory染色）检查以及组织中GAG含量的检测。结果病理及组化检查：对照组在实验开始1个月后软骨组织病理积分即不断增高：GS组在给药3个月后才开始上升;CS组在给药的5个月中病理积分增高缓慢,仅第4个月上升较明显;联合使用组在给药的5个月中病理积分一直没有增高,并且给药5个月后期的病理积分显著低于同组给药前期的积分。组织中GAG含量：随着豚鼠月龄的增大,各试验组软骨组织GAG含量均有下降,但与同期对照组相比,下降减缓;从第3个月起,各实验组的软骨组织GAG含量开始回升。与同期对照组相比,给药的前2个月,各试验组软骨组织中GAG含量均有显著性差异（P〈0．05）;第3个月开始,GS组与联合使用组软骨中GAG含量差异显著（P〈0．01）,而CS组软骨GAG含量差异不如GS组与联合使用组显著（P〈0．05）。给药4个月后,各试验组软骨组织GAG含量开始回升,与各自同期对照组相比均有显著性差异（P〈0．01）。结论GS、CS无论单独使用,还是联合使用,都能促进软骨组织生长并延缓软骨组织的退行性变,特别是联合使用的作用最强。     

体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化的实验观察

目的：探讨骨髓基质干细胞（MSCs）与软骨细胞体外非接触性共培养成软骨的可行性。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞，MSCs以1×10^5个/ml接种于共培养板内孔，第1代软骨细胞以1×10^4个/ml接种于共培养板外空板。48h后将内孔插如外孔中，补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。以相同密度MSC单独培养为空白对照，观察共培养7d和14d流式细胞仪观察MSC的Ⅱ型胶原蛋白变化情况。结果：实验空白组在7d和14d，Ⅱ型胶原蛋白均阴性表达，符合MSC特性。非接触共培养1周后，Ⅱ型胶原蛋白阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，具有统计学意义；非接触共培养2周后，Ⅱ型胶原蛋白也阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，同样具有统计学意义；实验14d组与实验7d组比较，P〈0.01，具有非常显著性差异。结论：软骨微环境在MSCs成软骨分化及体内软骨形成中具有重要作用，软骨细胞能有效地诱导MSCs向软骨细胞分化并促进MSCs体内软骨形成。     

蛇床子素对大鼠原代软骨细胞增殖的抑制作用

目的：观察蛇床子素对大鼠软骨细胞增殖的影响。方法：分离出生24h内大鼠的软骨细胞,进行原代培养。细胞扩增至第2代时观察1周内细胞增殖情况,并用细胞免疫荧光法鉴定Ⅱ型前胶原基因（type Ⅱ procollagen gene,Col2a1）的表达。将第2代软骨细胞分为对照组和不同浓度蛇床子素（6．25、12．5、25和50μmol／L）组。药物作用24和48h后,观察细胞增殖情况,蛋白质印迹法和聚合酶链反应法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）和细胞周期素D1（cyclinD1）的表达。结果：第2代原代软骨细胞活力正常,Col2al表达明显。蛇床子素可以抑制软骨细胞的增殖,并随浓度的增加,抑制作用愈明显。蛋白质印迹法和聚合酶链反应法检测发现,随着蛇床子素浓度的增加,软骨细胞中PCNA和cyclinD1的表达下降。结论：蛇床子素可能通过抑制PCNA和cyclinD1的表达发挥抑制软骨细胞增殖的作用。     

黄芪多糖对体外培养大鼠软骨细胞内糖胺多糖合成的影响及其机制

目的:研究黄芪多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖(GAG)合成的影响。方法:分离大鼠关节软骨细胞传代培养并加入IL-1β造模,分别将100,10,1,0.1 mg/L的黄芪多糖作用于该软骨细胞,以4.5 mg/L的硫酸氨基葡萄糖作为阳性对照。其后检测细胞增殖、细胞内GAG含量、细胞内葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ(GlcAT-1)mRNA含量和透射电镜观察细胞形态学改变。结果:各浓度的黄芪多糖均对大鼠软骨细胞增殖率无影响。100 mg/L的黄芪多糖可以增加软骨细胞内GAG的合成(P<0.01);1,10,100 mg/L的黄芪多糖能够增加GlcAT-1 mRNA的表达。结论:黄芪多糖能逆转IL-1β对体外培养的大鼠软骨细胞GAG合成的抑制作用,其主要机制可能与促进GlcAT-1的表达有关。     

圆偏振光与线偏振光对心肌细胞外基质组织学分析的一致性研究：Bland-Altman分析

【目的】研究圆偏振光和线偏振光结合苦味酸天狼猩红染色，对心肌细胞外基质组织学分析结果的一致性。【方法】对心肌梗死大鼠的心脏组织进行苦味酸天狼猩红染色后，固定其它光学参数，在同一视野分别使用圆偏振光和线偏振光获取图像（共随机获取40个视野）并进行图像分析，计算红色、绿色胶原纤维的面积、胶原容积分数以及胶原平均灰度等反映梗死心脏组织修复过程的组织学指标；采用Bland—Altman分析以及Pearson相关分析，对两种光学体系下测得的上述指标的一致性进行分析。【结果】通过Pearson相关分析显示两种光学系统中测得的红色纤维面积（r^2=0．9684，P〈0．01）、绿色纤维面积（r^2=0．8183，P〈0．01）、胶原容积分数（r^2=0．9595，P〈0．01）和胶原平均灰度（r^2=0．6188，P〈0．01）均有很高的相关性。然而Bland—Altman分析显示，至少30％以上的红色胶原纤维、50％绿色胶原纤维成分和30％的总细胞外基质成分在线偏振光中无法显示，并且线偏振光系统检测的偏倚随着均数的增加而增大。【结论】线偏振光结合天狼猩红染色在检测细胞外基质的沉积量、平均灰度方面，敏感性显著低于圆偏振光。在细胞外基质的相关研究中，应该尽量避免使用线偏振光。     

经阑尾残端逆行置管减压治疗粘连性肠梗阻

目的：探讨经阑尾残端逆行置管减压治疗粘连性肠梗阻的临床效果。方法：收集我院1999～2007年住院治疗的粘连性肠梗阻78例，对其进行回顾性分析，并根据治疗方式分为置管组和对照组，比较置管减压治疗粘连性肠梗阻的临床效果。结果：置管组术后肛门排气时间为（22．9±9．4）h，明显低于对照组术后肛门排气时间（57．3±15．5）h，P〈0．01；置管组住院时间为（12．0±2．2）d，明显低于对照组住院时间（18．2±4．5）d，P〈0．01；置管组切口感染或裂开率为5．0％，明显低于对照组切口感染或裂开率23．7％，P〈0．05；置管组再次梗阻率为0，明显低于对照组再次梗阻率23．7％．P〈0．05。结论：经阑尾残端逆行置管减压治疗粘连性肠梗阻优于常规手术治疗。     

基质金属蛋白酶13和转化生长因子β1 mRNA及蛋白在骨性关节炎中的表达

目的：探讨骨性关节炎（OA）中金属蛋白酶-13（MMP-13）,转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA和蛋白表达的意义.方法：采用免疫组织化学技术,对60例OA病例及20例正常对照组进行了MMP-13及TGF-β1蛋白表达的检测;通过原位杂交技术,对30例OA及10例正常对照进行了MMP-13及TGF-β1在mRNA水平表达的检测.结果：MMP-13mRNA和蛋白在OA组阳性表达的积分光密度（IOD）值均显著高于正常对照组（P〈0.01）,OA中两者的表达有显著正相关性（P〈0.01）;TGF-β1mRNA和蛋白在OA组阳性表达的IOD值均显著高于正常对照组（P〈0.01）,OA中两者的表达亦有显著正相关性（P〈0.01）;MMP-13mRNA,TGF-β1mRNA及相应蛋白在OA中的表达均呈负相关（P〈0.05或P〈0.01）.结论：OA中TGF-β1高表达通过下调关节软骨与滑膜细胞中MMP-13的表达,对OA关节软骨起保护作用.     

丹参酮ⅡA对大鼠原代软骨细胞增殖的影响

目的：研究丹参酮ⅡA对体外培养的原代大鼠软骨细胞增殖的影响。方弦：取24h新生sD大鼠肱骨头处软骨,用Ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞,取P1代细胞进行实验。对照组软骨细胞用含10％FBS的H—DMEM的培养基培养;实验组分4个浓度组,在培养基内分别加入终浓度为6．25μmol／L、12．5μmol／L、25μmol／L、50μmol／L的丹参酮ⅡA。培养24h后,MTT法检测各组细胞的增殖情况,WesternBlot法检测增殖细胞核抗原（PCNA）的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期。结果：丹参酮ⅡA可明显抑制软骨细胞的增殖,且抑制程度与丹参酮ⅡA的浓度呈正相关;丹参酮IIA可抑制软骨细胞PCNA的表达;随着丹参酮HA浓度的增加,G0／G1期的软骨细胞比例明显增高,而S期的比例明显降低。结论：丹参酮HA可诱导软骨细胞发生G0／G1期阻滞,抑制软骨细胞增殖。     

黄芪对自然衰老小鼠皮肤组织结构及线粒体T-ATP酶活性的影响

目的：通过观察黄芪对自然衰老小鼠皮肤组织结构及线粒体T-ATP酶活性的影响,探讨黄芪延缓自然衰老小鼠皮肤衰老的可能机制。方法：选用健康昆明种小鼠分青年对照组（A）、老龄空白对照组（B）、黄芪低剂量组（C）、黄芪中剂量组（D）、黄芪高剂量组（E）和维生素EC组（F）,采用电镜观察小鼠皮肤组织超微结构的改变,以生化分析方法测定皮肤组织中线粒体总ATP酶活性。结果：自然衰老小鼠皮肤组织细胞氧化损伤,线粒体肿胀,出现空泡化。与青年对照组相比较,老龄空白对照组（P〈0.01）、黄芪低剂量组（P〈0.01）、黄芪中剂量组（P〈0.01）、黄芪高剂量组（P〈0.01）、维生素EC组（P〈0.01）线粒体ATP酶活性均明显降低。黄芪低剂量组（P〈0.01）、黄芪中剂量组（P〈0.01）、黄芪高剂量组（P〈0.01）、维生素EC组（P〈0.01）均可提高皮肤组织中线粒体ATP酶活性。结论：自然衰老小鼠的皮肤组织中有明显的氧化损伤,胶原蛋白减少,线粒体ATP酶活性明显降低。黄芪对皮肤组织成纤维细胞的细胞核、内质网、线粒体等损伤具有保护作用。其发挥延缓皮肤衰老的作用机制可能是通过清除自由基,提高皮肤中线粒体ATP酶活性,提高线粒体呼吸功能,促进成纤维细胞合成胶原,提高机体抗氧化能力密切相关。