四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅱ.转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测

目的 获得转基因菘蓝的分子生物学证据。方法 对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式反应(PCR)，Southern杂交和RT—PCR检测。结果 PCR和Southern杂交检测结果表明，外源半夏凝集素基因已经整合到转基因菘蓝的基因组中，RT—PCR结果表明其DNA可以正常转录成mRNA。结论 可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。     

黄丝郁金的化学成分

从黄丝郁金［姜黄(Curcuma longa)的块根］中分离鉴定了8个化合物,分别为姜黄素(1)、单去甲氧基姜黄素(2)、双去甲氧基姜黄素(3)、对羟基苯甲醛(4)、香草醛(5)、覆盆子酮(6)、杜鹃醇(7)、(2R,4R)-6-(4′-羟苯基)-2,4-己二醇(8)。其中化合物4~7均为首次从该植物中分离得到,化合物8为一个新化合物。     

海口市白纹伊蚊对菊酯类杀虫剂的抗药性及击倒抗性基因突变分析

目的 了解海口市白纹伊蚊对溴氰菊酯和氯菊酯的抗药性,并检测其击倒抗性(kdr)基因突变型,阐明抗性表型与kdr基因突变的关系。 方法 在海口新埠岛、龙塘镇、石山镇、白沙门和花卉市场采集白纹伊蚊幼虫,应用浸渍法测定其对溴氰菊酯和氯菊酯杀虫剂的敏感性,以抗性倍数确定抗性级别。对应生物测定的样品扩增和分析白纹伊蚊的kdr基因部分片段,采用χ²检验比较抗性表型与kdr突变基因型的差异性。 结果 海口白纹伊蚊花卉市场和白沙门群体对溴氰菊酯和氯菊酯均产生抗性,花卉市场群体对溴氰菊酯的抗性倍数高达436.36,为高度抗性。龙塘镇和石山镇群体对氯菊酯均为敏感,对溴氰菊酯的抗性为低度(9.09)或中度(18.18)。新埠岛群体对溴氰菊酯和氯菊酯均为敏感。在对应检测的317只白纹伊蚊的kdr基因中,发现1 534位点存在点突变,检测到2种突变等位基因(TGC/C、TCC/S)。5种基因型和频率分别为野生型TTC/TTC(62.15%)、野生/突变型杂合子TTC/TGC(0.63%)和TTC/TCC(16.09%)、突变型纯合子TCC/TCC(20.82%)以及突变型杂合子TGC/TCC(0.32%)。χ²检验结果显示,接触菊酯类杀虫剂后敏感表型与抗性表型个体中,kdr基因型间的差异有统计学意义(P <0.05),在抗性表型群体中的kdr突变型基因型的频率(42.94%)大于敏感表型个体(31.97%)。 结论 海口市白纹伊蚊多个群体对溴氰菊酯和氯菊酯同时存在抗性,抗性表型与kdr突变基因型密切相关。本研究首次记录了kdr新的等位基因TCC/S。     

盐酸小檗碱对甲状腺素性豚鼠心肌病心肌细胞中I Kr ， IKs和IK1的抑制作用

目的： 研究盐酸小檗碱(berberine,Ber)对甲状腺素性豚鼠心肌病中延迟整流外向钾电流中快激活成分(I _Kr )和慢激活成分(I _Ks )及内向整流电流(I _K1)的抑制作用。方法： 豚鼠腹腔注射L-甲状腺素造成心肌病后,分离单个心肌细胞,用全细胞膜片钳技术记录钾电流。结果： 在心肌病细胞的I _Kr ,I _Ks 和IK1电流密度均明显增大,Ber 30 mmol/L分别抑制心肌病细胞I _Kr 22.8%（+10 mV）和I _Ks 29.5%（+80 mV）,其对I _Ks 的阻断作用大于I _kr 。Ber 30 mmol/L也能阻断心肌病细胞I _K129.1%（+120 mV）,但不影响其反转电位。Ber(1~300 mmol/L）浓度依赖性地阻断心肌病细胞I _Kr 及I _Ks ,其IC₅₀分别为76 mmol/L和55.37 mmol/L。结论： 甲状腺素性心肌病中出现异常增大的I _Ks ,I _Kr 及I _{K1离子流,Ber有明显阻断作用。}     

三七茎叶皂苷酸水解产物中一个新化合物的分离和鉴定

目的 研究三七Panax notoginseng茎叶皂苷水解转化产物的化学成分,以期发现新的苷元。方法 三七茎叶皂苷酸水解产物通过硅胶、凝胶及液相色谱进行分离,分离得到的化合物结构经谱学方法鉴定。结果 从三七茎叶皂苷水解产物中分离得到7个单体化合物,分别鉴定为20(S)-3-甲氧基-人参二醇（1）、20(E)-达玛烷-20 (22)-烯-3β, 12β, 25-三醇（2）、20(R)-达玛烷-3β, 6α, 12β, 20, 25-五醇（3）、20(R)-达玛烷-3β, 12β, 20, 25-四醇（4）、拟人参皂苷-F₁₁苷元（5）、20(S)-人参二醇（6）、20(S)-原人参二醇（7）。结论 化合物1为一新化合物,命名为三七皂苷元MPD。     

PRKAG2基因G100S新突变对小鼠心肌细胞单磷酸腺苷活化蛋白激酶活性的影响

目的 探讨位于非胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase,CBS）区域的PRKAG2基因G100S突变对小鼠心肌细胞单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）活性的影响。方法 建立人源PRKAG2（G100S）转基因小鼠模型,分别随机选取N4代4周龄、12周龄的转基因小鼠和同窝野生型小鼠各6只,用磷酸化检测试剂盒检测小鼠心肌细胞中AMPK活性,比较转基因小鼠与同窝野生型小鼠AMPK活性的差异,并观察随着周龄的增长转基因小鼠AMPK活性的变化。结果 4周龄和12周龄的转基因小鼠心肌细胞中AMPK活性均低于同窝野生型小鼠（0.042±0.013 vs 0.063±0.013,0.032±0.008 vs 0.062±0.018）,差异均有统计学意义（P=0.019,P=0.004）。12周龄和4周龄的转基因小鼠心肌细胞中AMPK活性差异无统计学意义（P=0.135）。结论 PRKAG2基因G100S突变可导致转基因小鼠心肌细胞AMPK活性下降,而且AMPK活性并不随着转基因小鼠周龄的增长而变化。     

外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道乳杆菌的功能变化

目的 分离、纯化、鉴定外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者阴道乳杆菌菌种;绘制VVC患者阴道内分离的卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、发酵乳杆菌的生长曲线,检测其产酸能力、产H₂O₂能力,分析VVC患者阴道乳杆菌的功能变化及临床意义,为VVC的病因及治疗提供理论基础。方法 体外培养VVC患者阴道分泌物中的乳杆菌,分离、纯化,并用分子生物学技术鉴定;测定24h菌液浊度法绘制VVC患者及健康女性阴道内分离的4种乳杆菌的生长曲线;检测24h菌液pH值对比VVC患者与健康女性阴道内分离的卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、发酵乳杆菌的产酸能力;绘制H₂O₂浓度标准曲线,定量检测摇菌3h菌液的产H₂O₂的量,对比VVC患者与健康女性阴道内分离的卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、发酵乳杆菌的产H₂O₂能力。结果 共分离培养了34株VVC患者阴道乳杆菌,经鉴定,分属于乳杆菌的4个种。VVC患者与健康妇女相比,阴道内卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、发酵乳杆菌的增殖速度差异无统计学意义(P<0.05)。健康女性加氏乳杆菌与卷曲乳杆菌的产酸能力比VVC患者强(P<0.05);詹氏乳杆菌的产酸能力两组差异无统计学意义(P>0.05);而VVC患者发酵乳杆菌的产酸能力比健康女性强(P<0.05)。VVC患者阴道内分离的卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、发酵乳杆菌的产H₂O₂量均明显少于健康妇女(P<0.05)。结论 本研究为进一步构建中国女性阴道来源的乳杆菌菌种库、进行阴道来源的乳杆菌的相关研究提供菌种。VVC状态下,念珠菌的增多,阴道微环境的改变,并未影响阴道内定植的乳杆菌的生长速度。阴道内乳杆菌的产酸功能并不是抑制VVC的关键。阴道内乳杆菌产H₂O₂能力可能为抑制VVC的关键。     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ.根癌农杆菌介导的转基因菘蓝

目的：将外源半夏凝集素基因（PTA）转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性。方法：构建了以CaMV 35S为启动子，新霉素磷酸转移酶（Npt-Ⅱ）为选择标记，带有半夏凝集素基因PTA的pCAMB I A2200植物双元表达载体，应用根癌农杆菌EHA 105遗传转化四倍体菘蓝。结果：菘 外植体植株再生率达到95％以上，转化率有10％。结论：建立了以6－BA和NAA为主要激素组合的四倍体菘蓝离体分化再生系统和农杆菌介导的转化系统。     

棕背鼠平性别的快速鉴定

目的 野生棕背鼠平因其活动敏捷?性情凶猛?不易抓取,很难从外表对其性别做出准确判断,影响分笼及后期的实验室繁育,拟建立一种快速?准确?简便的性别鉴定方法?方法 以棕背鼠平的新鲜被毛为材料,Chelex?100 提取毛囊DNA,利用PCR 技术分别扩增锌指结构基因(ZFY/ZFY)片段和Y 染色体性别决定区基因(SRY)片段,并建立双重PCR 扩增方法?结果 雄性棕背鼠平扩增出ZFY/ZFY和SRY 两个基因片段,而雌性棕背鼠平只扩增出ZFY/ZFY基因片段?利用这种方法对23 只棕背鼠平?10 只Wistar 大鼠和8 只BALB/ c 小鼠进行性别鉴定,扩增结果与表型判断和解剖结果一致?结论 以被毛为实验材料,减少了对棕背鼠平的惊吓和损伤;建立的双重PCR 扩增方法准确?快速,可应用于鼠的性别鉴定?     

(E)-1,2-二芳基取代乙烯类化合物的合成及抗血小板聚集活性

在2-溴苄基膦酸二乙酯结构基础上,合成两个系列(E)-1,2-二芳基取代乙烯类化合物Ⅴ₁～Ⅴ₉ ,Ⅵ₁～Ⅵ₄),并对所合成的化合物进行抗血小板聚集活性实验。合成了13个未见文献报道的目标化合物,结构经元素分析、红外光谱、核磁共振氢谱、质谱确证。初步生物活性测试表明,多数化合物具有不同程度的抗血小板聚集活性,其中化合物Ⅴ₄、Ⅴ₉的活性较好。结果表明,(E)-1,2-二芳基取代乙烯类化合物是一类新型的具有潜在价值的抗血小板聚集活性的化合物。     

青枯菌诱导广藿香防御相关酶同工酶分析

目的 研究青枯菌诱导广藿香的致病过程及防御相关酶同工酶的动态变化。方法 利用青枯菌粗毒素诱导广藿香试管苗,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对诱导植株中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）同工酶谱带的变化进行分析。结果 青枯菌诱导1～7 d后的广藿香植株,表现渐进的发病过程,开始时,植株失绿、少数叶片萎垂;逐渐植株茎杆弯曲、整株叶片萎蔫。同工酶电泳分析表明,SOD同工酶在第1、3天时分别出现了新谱带,与对照共有的谱带,强度先增后减;CAT同工酶在第3、5天时分别出现新谱带,第6天时强度达到最大;POD同工酶在第1、4天时分别出现了新谱带,强度先增后减,第7天时所有谱带消失。结论 青枯病的发生呈现渐进的过程。青枯菌诱导1～7 d,广藿香SOD、CAT和POD同工酶谱带在数目和强度上均有所不同,呈动态变化,表明SOD、CAT和POD在广藿香抵抗青枯菌入侵时可能起到较为重要的作用。     

氮铬耦合下铬在泽泻中的动态积累规律及其对泽泻生长的影响

目的 通过监测在不同氮铬耦合浓度下,铬在泽泻不同部位的动态积累规律及其对泽泻生长的影响,探讨施氮量对在不同土壤铬背景值下泽泻生长的影响及其与铬积累的相关性。方法 对不同处理组采用动态监测法,测定不同生长时期泽泻不同部位的铬积累量及生物量的变化情况,同时利用统计学方法探讨铬积累量与氮肥施用量及土壤铬背景值的相关性。结果 铬对于泽泻生长的影响呈现出浓度依赖性及部位差异性。总体上低铬水平下泽泻的生长得到一定程度的促进,而高铬水平下泽泻的生长受到抑制。氮肥的施加能够缓解铬的生物毒性,使泽泻生长正常,但同时氮肥的施加也使泽泻对于铬的积累增加。偏相关分析的结果也表明氮的施用量与铬元素在泽泻块茎的积累呈正相关性。结论 泽泻规范化种植中应在保证其铬积累量不超标的情况下,尽量选择含低铬的土壤,同时氮肥的施用量应以泽泻药材安全性为前提。     

大鼠灌服炙甘草汤后甘草次酸药动学研究

目的 建立大鼠ig炙甘草汤后体内甘草次酸的LC-MS/MS测定方法。方法 采用醋酸乙酯沉淀蛋白处理血浆样品,选用白藜芦醇为内标,采用LC-MS/MS法测定,色谱条件为ORBAX SB-C₁₈反相色谱柱（Agilent,50 mm×2.1 mm,1.8 μm）,乙腈-水（80∶20,含0.2%甲酸）为流动相,体积流量0.2 mL/min,柱温30 ℃。样品经电喷雾离子（ESI）源负离子化后,通过Agilent 6410三重四级杆串联质谱仪,采用多反应监测（MRM）对甘草次酸进行测定,分别选用m/z 469.4→425.4和227.1→143.0作为甘草次酸和内标物白藜芦醇的检测离子对。结果 甘草次酸在33.4～8 560.0 ng/mL线性关系良好（R²＝0.997 1）,日内（n＝6）、日间（n＝6）精密度、稳定性RSD均小于10%。甘草次酸高、中、低3个质量浓度平均提取回收率分别为75.3%、78.2%、78.5%。在此方法下得到大鼠ig炙甘草汤后血浆中甘草次酸的药动学参数分别为t_max＝（8.00±1.13）h,C_max＝（811.02±300.25）ng/mL,AUC_0～24＝（11 439.21±3 367.36）ng/mL·h。结论 该方法灵敏、准确、快速、选择性高,可用于甘草次酸血药浓度监测和药动学研究。     

土茯苓内生芒果球座菌的次级代谢产物及其抗肿瘤活性研究

目的 研究土茯苓内生芒果球座菌Guignardia mangiferae的次级代谢产物及其抗肿瘤活性。方法 采用硅胶柱、反相硅胶柱、凝胶柱和制备薄层色谱等色谱技术进行分离纯化,通过现代波谱技术进行结构鉴定;以神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、大细胞肺癌细胞NCI-H460为供试细胞株,采用SRB法对化合物进行体外抗肿瘤活性研究。结果 从土茯苓内生芒果球座菌的100 L液体发酵提取物中分离得到12个化合物,经波谱数据分析鉴定其中10个化合物,分别为15-hydroxyl tricycloalternarene 5b（1）、guignardiaene D（2）、guignardiaene C（3）、guignardone A（4）、guignardone B（5）、3-(4-甲苯氧基)-丙酸（6）、2, 4-壬二醇（7）、麦角甾酮（8）、酪醇（9）、对羟基苯甲醛（10）。杂合萜类化合物1～5对SF-268细胞具有选择性的抑制作用,化合物6、7对MCF-7细胞具有选择性的抑制作用。结论 化合物6～10均为首次从该属真菌中得到,其中化合物6、7为新的天然产物。     

红外光谱法结合系统聚类和SIMCA模式识别法快速鉴别羌活种子

目的 采用傅里叶变换红外光谱法鉴别羌活种子。方法 在4 000～400 cm^?1内测定羌活种子光谱吸收峰,应用系统聚类和SIMCA模式识别法鉴别羌活和宽叶羌活的种子。结果 运用系统聚类法,当聚类距离为15时,两种羌活可明显分为2类;运用SIMCA模式识别法,所建模型对羌活和宽叶羌活的种子识别率分别达96%和97%,拒绝率均为100%,两者盲样检测准确率也在90%以上,所建模型可用于样品检测。结论 应用红外光谱法结合系统聚类和SIMCA模式识别法,可以简单、快速、准确地鉴别羌活种子,该方法为鉴别羌活种子的来源及真伪提供了一种新的技术手段。     

绵羊李斯特菌载体结核疫苗株inlB1基因缺失减毒株的构建及评价

目的 对以绵羊李斯特菌（Listeriaivanovii,LI）为载体的结核疫苗候选株LI-Ag85C进行基因减毒,初步评价其体内外生物学特性。方法 构建含有inlB1基因上、下游同源序列的打靶质粒,电转原始菌LI-Ag85C感受态细胞,同源重组敲除inlB1基因;测定减毒株LIΔinlB1-Ag85C和原始株LI-Ag85C的体外生长曲线;测定两株菌对于肝癌细胞系HepG2细胞的黏附、侵袭能力的影响,比较两株菌溶血能力的差异,两株菌对于小鼠的半数致死量（median lethal dose,LD50）差异。结果 敲除inlB1基因的重组结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C的基因序列符合预期结果。减毒株与原始株的体外生长情况基本一致;对于HepG2细胞的黏附率分别为6.66%和7.46%,侵袭率分别为0.031%和0.042%,减毒株的黏附、侵袭能力均低于原始株,但差异无统计学意义;减毒株的溶血活性较原始株无明显变化;对小鼠的LD50值分别为3.2×108 CFU/只和6.7×107 CFU/只,减毒株LD50相较于原始株明显提高。结论 成功构建inlB1基因缺失的新型结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C,其毒力较原始株降低。     

地榆总皂苷促造血细胞增殖效应研究

目的 观察地榆总皂苷对3种造血细胞Baf3/Mpl、UT-7和NSF-60的促增殖效应。方法 分别培养依赖血小板生成素（TPO）、红细胞生成素（EPO）和粒细胞集落生长因子（G-CSF）生长的Baf3/Mpl、UT-7和NSF-60细胞,在加或不加细胞因子条件下,用不同质量浓度地榆总皂苷处理细胞72 h后,采用MTT法检测3种细胞的增殖;采用RT-PCR法检测3种细胞因子受体表达水平的变化。结果 地榆总皂苷单独处理细胞72 h,明显促进Baf3/Mpl细胞和NSF-60细胞增殖,但不影响UT-7细胞生长;在TPO和G-CSF存在条件下,地榆总皂苷能分别增强两种细胞因子的促细胞增殖作用。此外,地榆总皂苷能明显增强Baf3/Mpl细胞TPO受体表达,对NSF-60细胞G-CSF受体表达没有影响。结论 地榆总皂苷具有单独或协同细胞因子的促造血细胞增殖作用,其促增殖作用与上调TPO受体的表达有关。     

单叶蔓荆种子休眠特性研究

目的 研究单叶蔓荆种子休眠的原因及解除休眠的方法。方法 以单叶蔓荆的果实（蔓荆子）为材料,用石蜡切片法研究单叶蔓荆种子形态解剖学特点,通过种子吸胀和抑制物测试研究其休眠原因,采用浓硫酸和赤霉素（GA₃）处理打破种子休眠。结果 打破单叶蔓荆种子休眠的方法为GA₃处理,解除休眠的最佳方法为浓硫酸处理15 min,1.0 mg/mL GA₃浸种18 h,蛭石培养床30 ℃恒温培养能够达到发芽率78.7%。结论 蔓荆具有坚硬厚实的果皮,机械束缚是休眠的主要原因;果皮中含有萌发抑制物质,GA₃处理可有效解除单叶蔓荆种子的生理休眠。     

成都地区幽门螺杆菌感染现状及相关影响因素分析

目的 了解成都地区人群幽门螺杆菌 （Helicobacler pylori, Hp）感染现状及相关影响因素,为制定本地区Hp防治方案提供依据。方法 以在四川大学华西医院健康体检中心行常规体检的成都籍常住居民为研究对象,通过¹⁴C尿素呼气试验 （¹⁴C-urea breath test,¹⁴C-UBT）检测Hp感染状况;随机抽取部分个体进行问卷调查,了解Hp感染的相关影响因素。结果 共纳入体检者8 365例,500份问卷中共收集合格问卷497份。受检人群的Hp总感染率为53.1%,男性高于女性〔54.1% （2 673/4 941）vs. 51.7%（1 771/3 424）, P<0.05〕;30岁及30岁以上各年龄段的Hp感染率均达到或超过50%。藏族人群的Hp感染率高于汉族〔74.2% (23/31) vs. 48.6%(216/444),P<0.05〕;生吃大蒜者Hp感染率低于不食用者〔52.6% (231/439) vs. 67.9%(38/56),P<0.05〕;有呕吐症状者的Hp感染率高于无症状者〔63.4%(59/93) vs. 52.2%(211/404), P<0.05〕。男性〔标准偏回归系数(β)=0.155 9〕、藏族(β=0.148 9)、有呕吐症状(β=0.146 9)是Hp感染的危险因素,生吃大蒜(β=-0.149 0)是防止Hp感染的保护因素。结论 成都地区人群具有较高的Hp感染率。男性、藏族、有呕吐症状是Hp感染的独立危险因素;而经常生吃大蒜则对Hp感染有一定的保护作用。     

百蕊草种子适宜萌发条件的研究

目的 研究百蕊草种子萌发的适宜条件。方法 用光照培养箱人工培养的方法研究百蕊草种子萌发适宜条件。结果20～25 ℃的黑暗环境中百蕊草种子萌发率达72.5%～75%,且幼苗生长健壮;其寄主白茅根系分泌物可促进百蕊草种子萌发,萌发率可达76.67%。结论 百蕊草种子萌发的适宜条件为20～25 ℃的黑暗环境,寄主白茅根系分泌物可促进百蕊草种子萌发,提高发芽率。