雷帕霉素抑制人神经母细胞瘤细胞株生长及诱导凋亡的机制研究

目的研究雷帕霉素对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的生长抑制和诱导凋亡作用,以及对靶向信号通路磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（P13K／AkCmTOR）的影响。方敞用不同浓度的雷帕霉素（10、15、20μmol／L）处理SH-SY5Y细胞（雷帕霉素干预组）,以加入相同体积二甲基亚砜（DMSO）的SH-SY5Y细胞作为阴性对照组,设立空白对照组。CCK．8法测定细胞生长率;采用流式细胞仪检测细胞周期,通过AnnexinV-FITC／PI双染法检测细胞凋亡率;Westernblotting检测easpase-3剪切体及P13K／Akt/mTOR信号通路上下游分子PDKp85、Akt、mTOR、4E-BPl表达及其磷酸化水平的变化。结果与阴性对照组和空白对照组比较,雷帕霉素干预组细胞生长率显著降低（P〈0．05或P〈0．01）;G。／G,期细胞百分比显著增高（P〈0．05）;细胞凋亡率显著升高（P〈0．01）。Westernblotting检测结果显示：与阴性对照组和空白对照组比较,雷帕霉素干预组easpase-3剪切体表达水平较高;P13K／Akt/mTOR信号通路上下游分子的活性均被抑制,P13Kp85、Akt、mTOR、4E-BP1的磷酸化水平均明显降低。结论雷帕霉素对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y具有抑制生长和诱导凋亡的作用,其机制可能与抑制P13K／Akt/mTOR信号通路有关。     

基于PI3K/Akt/mTOR通路探讨排石冲剂对草酸钙肾结石大鼠的作用机制

目的 探讨磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路在草酸钙结石形成中的作用机制及其在排石冲剂防治草酸钙肾结石中的影响.方法 将40只雄性SPF级Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、排石冲剂组和枸橼酸钾组,每组各10只.除正常组外,其他各组建立草酸钙结石模型.排石冲剂组...     

银杏叶提取物可抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠气道及肺血管重塑

目的 探讨银杏叶提取物（GBE）对COPD大鼠气道及肺血管重塑的干预作用。方法 Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组（A组）、造模不干预组（B组）、造模GBE早期干预组（C组）和造模GBE后期干预组（D组）。B、C和D三组采用慢性烟熏＋脂多糖气管内注射建立COPD模型,C和D组分别在1～14d和29～42d腹腔内注射GBE（0.40mL/kg）,43d后对各组大鼠肺脏行病理学检测。结果 B、C和D三组均有COPD特征性改变,但程度不同。A、B、C和D各组间肺泡平均面积、标准肺泡数比较均有显著差异（P均〈0.01）。C和D组管壁结构轻度改变,支气管平滑肌厚度/支气管壁厚度比值、支气管壁面积/支气管面积比值与A、B两组比较均有显著差异（P均〈0.01）。C和D组血管平滑肌细胞轻度增生,管壁轻度增厚,血管平滑肌细胞厚度/血管壁厚度比值、血管壁面积/血管面积比值与A、B两组比较均有显著差异（P均〈0.01）。结论 GBE对COPD大鼠模型气道重塑及肺血管重塑有抑制作用。     

膀胱癌PI3K/Akt/mTOR信号通路与免疫抑制性细胞的相关分子机制研究

目的探讨膀胱癌磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路与CD4~+CD25~+Treg细胞及其免疫功能的相关分子机制。方法通过N-甲基亚硝基脲(MNU)经尿道膀胱灌注法建立SD大鼠膀胱癌模型。PI3K抑制剂Wortmannin处理膀胱癌大鼠。Western-blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达;流式细胞仪检测大鼠组胸腺、脾脏CD4~+CD25~+Treg细胞占CD4~+T细胞百分比分;Real time-PCR检测大鼠血浆中白细胞介素-2(IL-2)和IL-10 mRNA表达。结果相对于生理盐水对照组,Wortmannin组中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和转化生长因子-β(TGF-β)的表达明显降低(P均0.05),而且CD4~+CD25~+Treg细胞数量显著降低(P0.05),同时IL-10 mRNA表达水平明显下降(P0.05),而IL-2表达水平明显上升(P0.05)。结论膀胱癌中PI3K/Akt/mTOR信号通路调控CD4~+CD25~+Treg细胞的增殖和分泌功能。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路研究小青龙汤方对小青龙汤证大鼠模型PI3K、Akt、mTOR mRNA表达的影响

目的:观察小青龙汤对小青龙汤证模型大鼠肺组织中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA表达的影响。方法:将24只雄性Wistar大鼠按照完全随机分组分成空白组、模型组、小青龙汤高剂量组、小青龙汤低剂量组共4组。建立外寒里饮(小青龙汤证)大鼠模型,予小青龙汤灌胃治疗15 d后,记录各组大鼠的体质量变化并加以分析,运用实时荧光定量(RT-qPCR)技术检测各组大鼠肺组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达的差异。结果:与空白组比较,模型组与小青龙汤高、低剂量组大鼠体质量在造模后增加不明显,甚至出现负增长(P0.01);经过药物干预治疗后,与空白组比较,模型组大鼠体质量增长仍不明显;与模型组比较,小青龙汤高、低剂量组大鼠体质量明显增加(P0.01)。RT-qPCR结果显示,与空白组比较,模型组PI3K、Akt、mTOR mRNA表达升高(P0.05);与模型组比较,小青龙汤高剂量组PI3K、Akt、mTOR mRNA表达降低(P0.05,P0.01),小青龙汤低剂量组PI3K、Akt、mTOR mRNA表达有降低趋势,但差异无统计学意义。结论:小青龙汤证的发生发展与PI3K、Akt、mTOR mRNA表达量的上调相关,小青龙汤高剂量治疗效果明显,其作用机制与其能够下调PI3K、Akt、mTOR mRNA的相对表达量有关。     

甲状腺素致心肌细胞肥大的机制探讨

目的:探讨甲状腺素致心肌细胞肥大的相关机制。方法:取分离培养的乳鼠心肌细胞,用L-甲状腺素(T3)诱导心肌细胞肥大,然后再加入磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)抑制剂LY294002和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)特异性抑制剂雷帕霉素进行干预;采用测量心肌细胞表面积及3H-亮氨酸掺入、Western blot等检测方法。结果:甲状腺素诱导的心肌细胞肥大能被LY294002或雷帕霉素抑制,LY294002能抑制甲状腺素激活丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和mTOR,雷帕霉素能特异性阻断mTOR的活化。结论:甲状腺素能通过PI3-K/Akt-mTOR信号通路促进心肌细胞肥大。     

PI3K/Akt/mTOR信号通路在肾细胞癌中的研究进展

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一,在多种恶性肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用。近年来,随着肿瘤分子生物学的发展,恶性肿瘤靶向生物治疗逐渐成为研究的热点。由于肾细胞癌发病率较高,并且对放化疗具有明显的耐受性,PI3K/Akt/mTOR信号通路与肾细胞癌的关系成为研究热点之一。研究表明,PI3K/Akt/mTOR信号通路与肾细胞癌发生、发展关系密切,采用多种抑制剂联合治疗及新一代的信号通路抑制剂治疗效果比较显著。PI3K、mTOR双重抑制剂正处于临床试验阶段,并且双重抑制剂在肾癌治疗的研究中表现出高度活跃性。     

PI3K/mTOR双重抑制剂的研究进展

磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphoinosmde-3-kinase/the mammalian target of rapamycin,PI3K/mTOR）双重抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的热点之一。本文介绍芳基脲类和3-吡啶基杂环类等PI3K/mTOR双重抑制剂的化学结构,根据其结构特点及其与PI3Kγ共结晶模式,剖析了两类抑制剂药效团的基本结构。     

阿伐他汀通过PI3K/Akt/mTOR途径调节白血病细胞自噬的作用及机制

目的:研究阿伐他汀对白血病细胞K562自噬的影响及相关信号机制。方法:取对数生长期的K562细胞,分为阴性对照组、阿伐他汀组、阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组、阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组。共培养24h后,采用吖啶橙染色观察细胞自噬体的变化,Western Blot检测Ⅱ型自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅱ)和自噬血管基因Beclin-1的表达,RT-PCR和Western Blot检测磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达。结果:与阴性对照组相比,阿伐他汀抑制白血病细胞K562自噬体的形成(P<0.05),下调LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达(P<0.05)。与阿伐他汀组相比,阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达增加(P<0.05);阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达增加(P<0.05)。与阿伐他汀组相比,阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组p-Akt和p-mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05);阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组p-Akt和p-mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05)。结论:阿伐他汀可以抑制白血病细胞K562自噬,推测其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

雷帕霉素脑靶向制剂对大鼠癫痫的治疗作用

目的: 比较雷帕霉素靶向制剂与雷帕霉素普通制剂治疗癫痫的差异。方法: 制备脑靶向的雷帕霉素纳米粒。采用毛果芸香碱诱发大鼠癫痫发作。脑电描记术监测自发性癫痫的发作;蛋白质印迹法检测不同剂型雷帕霉素对mTOR信号通路的影响;Fluoro-Jade B染色观察海马区神经元活性;Timm染色观察海马区苔藓纤维出芽情况。结果: 脑靶向制剂可降低大鼠自发性癫痫发作频率,作用效果较普通制剂明显（P < 0.05）;以磷酸化S6K和S6为指征,脑靶向制剂比普通制剂雷帕霉素对mTOR信号通路异常激活的抑制作用更强（均P < 0.05）;脑靶向制剂可显著改善神经元凋亡,但与普通制剂无差异（P > 0.05）;脑靶向制剂可减少海马区苔藓纤维出芽,作用效果较普通制剂明显（P < 0.05）;脑靶向制剂对大鼠体质量增长的抑制作用较普通制剂减弱（P < 0.05）。结论: 雷帕霉素脑靶向制剂对癫痫的治疗作用优于普通制剂,且其不良反应小于普通制剂。     

LC/MS/MS法测定兔血浆中的盐酸伪麻黄碱及美敏伪麻溶液的药动学研究

目的建立兔灌胃美敏伪麻溶液后血浆中的盐酸伪麻黄碱的LC/MS/MS测定方法,并研究该制剂的药动学。方法兔灌胃给药后采集各时点血样,经甲醇沉淀蛋白法处理,应用HPLC-ESI-三级四极杆串联质谱测定盐酸伪麻黄碱的浓度,采用统计矩分析方法计算药动学参数。结果盐酸伪麻黄碱的线性范围为1～300 ng.mL-1（r=0.995 5）,回收率为97.5%～108.5%,RSD均小于10%;药动学参数：t1/2为（1.8&#177;0.4）h,Cm ax为（26.6&#177;9.6）μg.L-1,Tm ax为（0.6&#177;0.3）h,AUC0-t为（82.8&#177;24.6）μg.h.L-1。结论建立的方法灵敏、准确、快速、特异性强,适用于盐酸伪麻黄碱的血药浓度测定和药动学研究。     

A/California/7/2009与A/California/4/2009病毒感染力比较

目的甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009与A/California/4/2009病毒序列比较同源性在99%以上,本实验旨在比较两株病毒感染BALB/c小鼠研究感染力强弱。方法分别将A/California/7/2009(CA7)与A/California/4/2009(CA4)两株病毒分别连续10倍稀释后,对4~6周龄雌性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种10只实验小鼠,测定CA7 MLD50为101.24/0.05 mL,检测小鼠感染、致病的多项指标,观察期为14 d。结果相同TCID50的CA7和CA4病毒感染小鼠,CA4感染小鼠后14 d内死亡率为20%,而CA7感染小鼠后8 d内死亡率为100%。CA7 106TCID50感染的小鼠病理表现为重度弥漫性间质性肺炎,CA4 106TCID50感染的小鼠病理表现为中度-重度间质性肺炎。结论在相同条件下,CA7感染力明显强于CA4。     

Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与自噬调控作用的研究进展

自噬是机体保守的自我防御机制,是将细胞内变形坏死的细胞器和多余蛋白降解为小分子,以供循环利用。自噬在生理和病理状态下均发挥重要作用,可通过多条信号通路影响胞内物质的表达。目前已知Ras/Raf/MEK/ERK信号通路不仅广泛参与调控细胞生长、增殖、分化、凋亡等多个生理病理过程,并且参与调控自噬,并具有促进肿瘤细胞发生自噬性死亡的作用,但是其具体参与调控自噬的作用机制尚未完全阐明。本文就Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与调控自噬的作用的研究进展进行详细阐述,以期为研究Ras/Raf/MEK/ERK信号通路调控自噬的作用机制提供参考。     

重庆地区C/adrq+亚型 HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC标准参照序列的初步建立

目的：建立重庆地区基因型C／血清型adrq HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC基因标准参照序列，为HBV变异的研究奠定基础。方法：测定18例无症状携带者HBV的PreS/S、EnhII/CP/PreC序列，应用同源性分析和对齐比较等方法确定HBV亚型，并拟定基因型C／血清型adrq HBV的PreS/S、EnhII/CP/PreCC标准参照序列。结果：9株基因型B／血清型adw2、6株基因型C／血清型adrq ，3株基因型B／血清型aywl；建立的重庆地区HBV基因型C／血清型adrq HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC标准参照序列与东北华南地区同亚型的标准序列比较分别用13个、2个核苷酸差异，可引起4个、1个氨基酸差异。结论：初步建立了重庆地区基因型C／血清型adrq HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC基因标准照参照序列。     

重庆地区HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC 基因标准参照序列的初步建立

目的：建立重庆地区HBV流行株PreS／S、EnhⅡ/CP／PreC基因标准参照序列，为HBV变异的研究莫定基础：方法：测定15例无症状携带HBV的PreS／S、EnhⅡ/CP／PreC序列，应用同源性分析和对齐比较等方法确定基因型／血清型，并拟定标准参照序列。结果：9株基因型B／血清型adw2、3株基因型B／血清型aywl、3株基因型C／血清型adrq ；建立的重庆地区HBV流行株(基因型B／血清型adw2)PreS／S、EnhⅡ/CP／PreC标准参照序列与华东华南地区同亚型的标准参照序列比较分别有6个、1个核苷酸差异。结论：初步建立了重庆地区HBV流行株PreS／S、EnhⅡCP／PreC基因标准参照序列。     

任意尿香草扁桃酸和高香草酸的肌酐比值测定诊断神经母细胞瘤

目的：探讨任意尿香草扁桃酸／肌肝（VMA／Cr)和高香草酸／肌杆（HVA／Cr）测定对神经母细胞瘤的诊断价值。方法：50例1－5岁正常儿童和11例2－5岁神经母细胞瘤患儿的任意尿标本，用高效液相色谱法测定VMA、HVA浓度，Beckmann自动生化分析仪测定肌酐（Cr)浓度，计算VMA／Cr、HVA／Cr。结果：1－5岁儿童的99％的正常值范围为VMA／Cr＜14．9mmol/mol，HVA／Cr＜23．8mmol/mol。11例神经母细胞瘤患儿中有10例VMA／Cr和HVA／Cr均超过正常值范围，诊断符合率90．9％。结论：任意尿VMA／Cr和HVA／Cr测定采样方便，诊断符合率高，可取代24h尿VMA、HVA总量测定法用于神经母细胞瘤术前诊断和术后随访。     

HL60/VCR耐药细胞荷瘤鼠模型的建立

目的建立白血病HL60/VCR耐药细胞株移植动物模型方法。方法将生长状态良好的耐药细胞株HL60/VCR1.0×107/0.2ml接种到BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下,定期观察裸鼠生长状况,测量移植瘤大小,留取标本检测不同脏器肿瘤负荷及多药耐药基因MDR1表达情况。结果 2.0×106HL60/VCR细胞皮下接种BALB/c-nu/nu裸小鼠,成瘤率为67.7%,免疫组化检测荷瘤裸鼠肝脏和脾脏均可见巢状分布白血病细胞,PCR检测成瘤组织表达MDR1基因。结论皮下移植可成功建立耐药细胞株荷瘤鼠模型,为研究多药耐药细胞株动物体内生物学行为及逆转多药耐药提供了动物模型。     

AKT／FOXOs／Atrogin-1／MuRF1信号通路在慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌萎缩中的作用

目的探讨AKT／FOXOs／Atrogin-1／MuRFl信号通路在慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠骨骼肌萎缩中的作用。方法采用单纯熏香烟法复制COPD大鼠动物模型。采用逆转录．聚合酶链式反应（RT-PCR）和Westernblot技术检测COPD大鼠伸趾长肌内E3连接酶的两个肌肉萎缩特异性指标Atrogin-1和MuRF1,以及其上游FOXOs转录因子的基因与蛋白表达的变化;对伸趾长肌中磷酸化AKT（p-AKT）的蛋白表达及其与总AKT（t-AKT）的蛋白表达比率进行测定。结果RT-PCR分析结果显示,COPD大鼠伸趾长肌组织中的Atrogin-1的mRNA表达明显上调（P〈0．01）;MuRF1和FOXO-1的mRNA表达与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。Westernblot分析结果显示,伸趾长肌组织中Atrogin一1的蛋白相对表达量COPD组较对照组明显增加（P〈0．01）;MuRFl的蛋白表达COPD组较对照组增加（P〈0．05）;FOXO-1的蛋白表达两组比较无明显差异（P〉0．05）。COPD组大鼠伸趾长肌中P-AKT的蛋白表达较对照组增加（P〈0．05）,p-AKT／t-AKTCOPD组明显高于对照组（P〈0．01）。结论AKT／FOXOs／Atrogin-1／MuRF1信号通路参与COPD骨骼肌萎缩机制并发挥重要作用。     

消旋聚乳酸/羟基磷灰石/脱钙骨基质材料支架的体外细胞相容性实验研究

目的研究一种新的骨替代材料——消旋聚乳酸／羟基磷灰石／脱钙骨基质(PDLLA/HA／DBM)骨细胞界面形态，评价其生物相容性。方法采用体外细胞培养技术，选用培养的人成骨细胞，通过光镜和扫描电镜等观察，了解细胞在材料中的生长情况和相互关系，并与消旋聚乳酸(PDLLA)及脱钙骨(DBM)相比较。结果随着培养时间的延长，细胞在PDLLA／DBM材料表面的密度增加，未见细胞死亡。细胞以锚状结构牢固地附着于材料表面，并分泌细胞外基质，覆盖并完全包裹材料颗粒。结论PDLLA／HA／DBM与人成骨细胞能早期形成骨性结合界面，具有良好的牛物相容性，可望成为一种新的具有前景的骨替代材料。     

Th1/Th2/Th17/Treg细胞因子在变应性鼻炎发病中的免疫机制研究

变应性鼻炎(AR)是免疫球蛋白E(IgE)介导的鼻黏膜的Ⅰ型变态反应性疾病,既往认为AR是由Th1/Th2型细胞因子的不平衡引发的。然而,目前研究发现还有其他多种免疫细胞和细胞因子参与了AR的发生、发展,因而Th1/Th2的细胞模式现已经扩展为Th1/Th2/Th17/Treg细胞模式。该文复习既往研究文献,锁定与AR密切相关的Th1/Th2/Th17/Treg细胞因子系统,对该系统在AR发生、发展的免疫学机制进行综述。扩展后的Th1/Th2/Th17/Treg细胞模式更有助于对疾病的理解,将推动AR的发病原因探讨、药物的干扰机制阐释以及相关靶点新药开发等研究工作,为基础理论研究和临床治疗提供可借鉴的思路。