MMP-9ASODN对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响及其机制初步探讨

目的 探讨基质金属蛋白酶-9反义寡核苷酸(MMP-9ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响,并初步探讨其机制.方法 MTT法检测MMP-9ASODN转染对A549细胞生长增殖的影响;流式细胞术检测MMP-9ASODN转染对A549细胞周期和凋亡比率的影响;RT-PCR法与Western blot法分别检测MMP-9ASODN转染对A549细胞内MMP-9mRNA及蛋白表达的影响.结果 在一定范围内,MMP-9ASODN对A549细胞生长抑制呈浓度和时间依赖性,反叉寡核苷酸浓度为600 nmo/L作用48 h时其抑制作用最明显;MMP-9ASODN转染A549细胞48 h后G1期细胞数明显增多,S期细胞数明显减少,G2期细胞数则无明显变化,其凋亡百分比明显升高;与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);细胞内MMP-9mRNA及其蛋白的相对表达量明显低于对照组(P＜0.01).结论 MMP-9ASODN转染能够有效能够抑制肺腺癌A549细胞的增殖同时诱导其凋亡,其机制可能是通过下调MMP-9mRNA及蛋白的表达.     

PEG化壳聚糖纳米粒介导的hTERT反义寡核苷酸对HepG2细胞的抑制作用

目的以PEG化壳聚糖(PEG-Chitoson)纳米粒作为端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸的载体转染HepG2细胞,研究其对HepG2细胞的增殖影响;方法采用MTT法检测PEG-CSNPs的细胞毒性和细胞增殖情况;以脂质体转染试剂作为对照,倒置荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测FITC标记的ASODN转染细胞后胞内荧光强度,转染效率和ASODN各组转染细胞后细胞周期的变化。结果NPs质量浓度超过3.0μg/mL时细胞毒性较大。转染24h后,ASODN纳米粒组和ASODN脂质体组细胞内荧光明显增强,且ASODN纳米粒组的转染效率要高于ASODN脂质体组。与空白对照组相比,ASODN处理后HepG2细胞生长受到明显抑制(P<0.01),且抑制率随时间延长而增高,72h时达到最高值;细胞周期改变,细胞被阻滞于G1期,S期细胞明显减少(P<0.01);结论PEG-CSNPs介导的hTERT ASODN能有效抑制HepG2细胞增殖、改变细胞周期,对该细胞生长有明显抑制作用。     

反义寡核苷酸抑制MMP7基因表达对肺腺癌A549细胞凋亡敏感性影响的研究

目的观察基质溶解素(matrilysin,MMP7)反义寡核苷酸(antisense ligodeoxynucleotide,ASODN)对肺腺癌A549细胞凋亡敏感性的影响。方法采用硫代磷酸修饰的MMP7ASODN,通过脂质体导入A549细胞后,RT-PCR检测MMP7 ASODN对MMP7 mRNA表达的影响;流式细胞仪检测其对细胞膜Fas抗原表达率的影响;加入重组FasL,诱导凋亡,流式细胞仪检测凋亡率。结果RT-PCR结果表明,MMP7 ASODN转染能显著抑制A549细胞MMP7 mRNA表达。流式细胞仪检测表明,MMP7ASODN转染A549细胞后,与未转染组和错义寡核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide,SCODN)组比较,细胞膜Fas蛋白表达率增高,有显著性差异(P<0.01)。加入重组FasL,诱导细胞凋亡,细胞凋亡率明显增高,与未转染组和SCODN组有显著性差异(P<0.01)。结论MMP7ASODN可以抑制肺腺癌A549细胞株MMP7基因的表达,上调细胞膜Fas抗原表达,增强A549细胞凋亡敏感性。     

MMP-7反义寡核苷酸抑制肺腺癌A549细胞体外增殖活性的实验研究

目的 观察基质溶解素(matrilysin,MMP-7)反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞体外增殖活性的影响. 方法采用硫代磷酸修饰的MMP-7反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN),通过脂质体导入肺腺癌A549细胞后免疫组化法检测A549细胞MMP-7表达,MTT法检测A549细胞增殖,FCM检测A549细胞周期.结果 相差显微镜下观察A549细胞转染ASODN后细胞体积变小,数目减少.MTT法测细胞增殖活性见不同浓度ASODN均能抑制A549细胞的增殖,抑制作用在48 h最强.免疫组化SABC法检测提示转染ASODN后A549细胞MMP-7蛋白表达水平明显降低.FCM检测显示MMP-7 ASODN可以抑制A549由G0/G1期进入S期.结论 MMP-7 ASODN可以特异性地抑制肺腺癌A549细胞株MMP-7蛋白的表达,调控细胞周期,抑制细胞增殖.     

MMP7反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞粘附和侵袭能力的影响

目的:观察基质溶解素(Matrilysin,MMP7)反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide)对肺腺癌A549细胞体外粘附和侵袭能力的影响.方法:采用硫代磷酸修饰的MMP7 ASODN,通过脂质体导入A549细胞,RT-PCR检测MMP7 mRNA表达;平板粘附模型和Boyden chamber模型比较A549细胞的粘附和侵袭能力.结果:MMP7 ASODN转染A549细胞后,与未转染组和脂质体组比较,RT-PCR电泳条带相对光密度值显著降低(P<0.01).粘附于平板和穿过Boyden chamber的细胞数有明显下降(P<0.01).结论:MMP7 ASODN可以有效抑制肺腺癌A549细胞株MMP7基因的表达,降低细胞粘附和侵袭能力.     

MMP-9反义寡核苷酸对肺腺癌细胞及其裸鼠移植瘤治疗的实验研究

目的 探讨基质金属蛋白酶-9反史寡核苷酸(MMP-9ASODN)对人肺腺癌(A549)细胞及其裸鼠移植瘤治疗的实验研究.方法 MTT法检测MMP-9ASODN转染对A549细胞生长的影响;流式细胞术检测MMP-9ASODN对A549细胞增殖和凋亡比率;采用皮下注射法建立移植瘤裸鼠动物模型,以脂质体包裹的MMP-9ASODN直接移植瘤内注射.观察肿瘤生长情况,计算抑瘤率和生长指数,利用光镜观察对重要脏器的形态学改变. 结果 在一定范围内,MMP-9 ASODN对A549细胞存活率抑制呈浓度和时间依赖性(反义寡核苷酸浓度为600 nmol/L作用48 h时抑制作用最明显);与对照组相比转染MMP-9ASODN的A549细胞凋亡百分比明显升高(P<0.01);MMP-9ASODN能使A549细胞周期阻滞在G_1/G_0期,MMP-9ASODN组肿瘤生长指数为(3.20±0.14).明显低于对照组(6.40±0.33)(P<0.01).MMP-9ASODN组的肿瘤重量为(1.25±0.03).明显低于对照组(2.43±0.04)(P<0.01),MMP-9ASODN组的抑瘤率为(33.41±1.18)%,而且心肝肾组织观察,结构均基本正常,未见有明显的组织损伤改变.结论 MMP-9ASODN能够有效地抑制肺癌A549细-胞的增殖和促进其凋亡;在体内可以显著抑制裸鼠移植瘤的生长,且无明显毒副作用.     

Bcl-xl反义寡核苷酸转染对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

目的研究Bcl-xl反义寡核苷酸(ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响。方法将肺腺癌A549细胞分为细胞对照组(无脂质体及核酸)、脂质体(Lip)组(空脂质体,无核酸)、序列对照寡核苷酸(SCODN)组和ASODN组,设计合成特异性靶向Bcl-xl ASODN,用阳离子脂质体介导其转染肺腺癌A549细胞株。采用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测A549细胞增殖抑制率;末端脱氧核苷酰基转移酶介导性d UTP切口末端标记(TUNEL)法检测A549细胞凋亡情况;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测A549细胞中Bcl-xlm RNA和蛋白表达水平。结果 ASODN和SCODN浓度为50 nmol·L~(-1)时,各组A549细胞增殖抑制率比较差异均无统计学意义(P>0.05);浓度为100、200、400 nmol·L~(-1)时,ASODN组A549细胞增殖抑制率均高于SCODN组和Lip组(P<0.05);ASODN对细胞增殖抑制作用随其浓度增加而增高,具有剂量依赖性(P<0.05)。细胞对照组、Lip组、SCODN组和ASODN组细胞凋亡率分别为(4.01±0.18)%、(5.23±0.22)%、(8.01±0.32)%和(41.50±1.91)%,ASODN组细胞凋亡率高于SCODN组、Lip组和细胞对照组(P<0.05)。ASODN和SCODN浓度为50 nmol·L~(-1)时,各组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05);浓度为100、200、400 nmol·L~(-1)时,ASODN组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量均低于SCODN组、Lip组和细胞对照组(P<0.05);ASODN组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量随浓度增加相应地下降(P<0.05);SCODN组和Lip组Bcl-xl mRNA表达量较细胞对照组下降,但差异均无统计学意义(P>0.05)。细胞对照组、Lip组、SCODN组和ASODN组A549细胞中Bcl-xl蛋白表达量分别为0.62±0.17、0.67±0.27、0.62±0.21和0.23±0.10,ASODN组A549细胞中Bcl-xl蛋白表达量低于细胞对照组、Lip组和SCODN组(P<0.05)。结论转染Bcl-xl ASODN可下调Bcl-xl基因表达,能有效抑制A549细胞增殖,并显著促进A549细胞凋亡;Bcl-xl基因有望成为肺腺癌基因治疗的新靶点。     

Livin反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的：探讨Livin基因反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides,ASODN）对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法：用阳离子脂质体介导Livin ASODN转染至A549细胞,反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Livin基因mRNA的表达;MTT法检测转染细胞的生长抑制情况。结果：转染ASODN后A549细胞的Livin基因mRNA的表达明显减少,Livin基因ASODN显著抑制A549细胞增殖,并呈剂量依赖性,与对照的错义寡核苷酸（missense oligodeoxynucleotides,MSODN）比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：Livin反义寡核苷酸能明显抑制A549细胞Livin基因mRNA的表达,抑制细胞增殖,Livin基因有望成为肺癌基因治疗的新靶点。     

5-ALA治疗和hTERT mRNA的反义寡核苷酸联合应用对人卵巢癌细胞的杀伤作用及其机制

目的：观察5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）光动力治疗（PDT）和人端粒酶催化亚单位 (hTERT) mRNA的反义寡核苷酸（ASODN)联合应用对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制及促凋亡作用,探讨两种方法联合应用协同促进对人卵巢癌3AO细胞的杀伤作用机制。方法：采用MTT法筛选不同浓度5-ALA 和激光能量照射对人卵巢癌3AO细胞增殖抑制作用的最佳组合参数; RT-PCR法检测hTERT ASODN和SODN转染后hTERT mRNA表达水平的变化。将人卵巢癌3AO细胞分为空白
对照组、hTERT ASODN转染组、hTERT SODN转染组、5-ALA PDT组、hTERT ASODN转染+5-ALA PDT组和hTERT SODN转染+5-ALA PDT组,应用MTT法检测各组人卵巢癌3AO细胞增殖抑制率;应用膜联蛋白V-硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(PI)双染色结合流式细胞术检测
各组人卵巢癌3AO细胞凋亡率。结果：5-ALA PDT对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制作用随着光敏剂浓度的增加和激光能量的增大而增加(P<0.05);不同浓度hTERT ASODN转染人卵巢癌3AO细胞24 h后,hTERT mRNA表达水平呈浓度依赖性下调(P<0.05),而hTERT-SODN对人卵巢癌3AO细胞hTERT mRNA表达无显著影响(P>0.05)。hTERT ASODN转染+5-ALA PDT (5-ALA浓度为0.5 mmol•L-1,激光能量密度为2.50 J•cm-2)组人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制率高于5-ALA PDT组和hTERT ASODN组(P<0.05)。hTERT ASODN转染+5-ALA PDT组人卵巢癌3AO细胞的凋亡率为29.28％,显著高于hTERT ASODN 转染组（12.79％）和5-ALA PDT组（21.19％)(P<0.05）。结论：hTERT ASODN转染与5-ALA PDT联合治疗可协同增强对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制作用,其机制可能与联合作用促进细胞凋亡有关联。     

生存素反义寡核苷酸对肝细胞癌细胞中生存素基因表达的影响

目的检测生存素(survivin)反义寡核苷酸对肝细胞癌细胞中生存素基因及蛋白表达的影响。方法将生存素反义寡核苷酸(ASODN)分为150、500和1000nmol/L3个不同浓度的亚组对SMMC-7721细胞进行转染,并设正义寡核苷酸(SODN)组、空脂质体组及空白组作为对照组。采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组中生存素mRNA的表达,采用流式细胞术(FCM)检测各组中生存素蛋白的表达。结果各ASODN亚组生存素mRNA及生存素蛋白的表达量均低于各对照组(P<0.05或P<0.01)。各ASODN亚组间比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),并呈现剂量依赖性。SODN组、空脂质体组及空白组组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论利用生存素反义寡核苷酸转染SMMC-7721细胞,可以下调生存素mRNA及其蛋白的表达。     

hOGG1低表达肿瘤细胞对阿霉素的敏感性研究

目的 研究8-羟基鸟嘌呤DNA 糖苷酶1基因(hOGG1)低表达细胞对阿霉素的敏感性,为化疗增敏提供实验依据.方法 用不同剂量的阿霉素处理肺腺癌A549细胞和通过稳定转染hOGG1核酶而获得的hOGG1低表达的A549-R细胞,用MTT法测定两种细胞的存活率;体外微核试验及单细胞凝胶电泳检测两种细胞微核率及DNA损伤与修复的差异;流式细胞术检测周期分布、凋亡率和细胞增殖指数.结果 A549-R细胞阿霉素半数抑制浓度(IC50)低于A549细胞 (P＜0.05);阿霉素可诱导两种细胞的微核率增高,而在相同阿霉素剂量作用下A549-R细胞微核率较A549细胞更高(P＜0.05);单细胞凝胶电泳结果显示阿霉素作用下两种细胞均有不同程度DNA损伤,A549-R细胞的拖尾率和DNA迁移长度大于A549细胞(P＜0.05);与A549细胞比较,A549-R细胞更不易修复.流式细胞术检测显示:阿霉素处理使两种细胞都表现为G0/G1期细胞阻滞,细胞凋亡随阿霉素浓度增加而增加,细胞增殖指数随阿霉素浓度增加而降低,这些变化均以A549-R细胞更为明显.结论 hOGG1低表达使细胞DNA修复能力降低,从而使细胞对阿霉素的敏感性增强.     

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞株中Survivin和SMAC/DIABLO基因表达的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3中survivin、Smac/DIABLO表达的影响,探讨survivin、Smac/DIABLO在ASODN诱导卵巢癌细胞凋亡和细胞周期改变中的作用和分子机制.方法 用脂质体(LipofectamineTM 2000)介导survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,用MTT比色法检测细胞生长活性,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数、细胞周期分布及survivin、Smac蛋白表达改变,逆转录酶链反应检测survivin、Smac/DIABLO基因表达改变.结果 同对照组比较,不同浓度ASODN作用后细胞生长明显减慢,转染后48 h IC50在600 nmol/1左右.用600 nmol/LASODN转染48h后,细胞凋亡指数(AI)明显增加,(t=6.3671,P＜0.05);更多的细胞停留在G0/G1期(t=10.3832,P＜0.01).Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.5031,P＜0.05,t=7.8146,P＜0.01),SmacmRNA和蛋白表达上调(t=2.8011,P＜0.05,t=11.3917,P＜0.01).结论 ASODN诱导细胞凋亡,使更多的细胞停留在G0/G1期,减少进入有丝分裂细胞数的作用,是通过下调survivin基因,上调Smac基因表达来共同完成的,survivin、Smac/DIABLO基因在调节SKOV3细胞周期、凋亡的功能上密切相关,二者的相互作用是卵巢癌发生、发展的重要分子机制之一.     

人端粒酶反转录酶反义寡核苷酸对胰腺癌细胞吉西他滨敏感性的影响

目的 通过体外实验探讨人端粒酶反转录酶(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)能否增强胰腺癌细胞对吉西他滨(健择)的敏感性.方法 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测hTERT mRNA表达情况;端粒重复序列扩增法(TRAP)、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测端粒酶活性;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖能力;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双染色法检测早期凋亡.结果 瞬时转染hTERT ASODN呈浓度依赖性下调细胞hTERT mRNA表达.0.2 μmol/L hTERT ASODN可显著下调端粒酶活性至0.47.健择在ASODN转染组中的IC50值为(0.8±0.2)μmol/L,而其在单纯脂质体转染对照组中为(7.3±0.9)μmol/L,差异具有统计学意义.ASODN可显著增加健择对肿瘤细胞的凋亡诱导作用,健择诱导的早期凋亡率在ASODN转染组中为60.28%,而其在脂质体对照组中为17.34%.结论 hTERTASODN可增强胰腺癌细胞对健择的敏感性,其机制可能与hTERT mRNA和端粒酶活性下调相关.     

Survivin反义寡核苷酸治疗耐顺铂人肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的实验研究

目的:探讨以存活素基因(survivin)为靶点反义基因治疗耐顺铂(CDDP)人肺腺癌移植瘤的可行性。方法:常规体外培养A549/CDDP细胞,采用皮下注射法建立移植瘤裸鼠动物模型。以脂质体包裹的survivin反义寡核苷酸(ASODN)直接移植瘤内注射,观察肿瘤生长情况,计算抑瘤率和肿瘤生长指数。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学分别检测survivinmRNA和蛋白的表达。结果:单用ASODN组的抑瘤率和肿瘤生长指数分别为35.4%和4.230±0.886,和空白对照组比较,抑瘤率较高,肿瘤生长减缓(P<0.05)。而ASODN联合CDDP组的抑瘤率和肿瘤生长指数则分别为63.7%和1.700±0.436,与CDDP组、Lip与CDDP联用组及单用ASODN组比较均有统计学差异(P<0.05)。RT-PCR半定量和免疫组织化学显示,ASODN组和ASODN联合CDDP组肿瘤组织中survivinmRNA及其蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论:Survivin反义寡核苷酸可以抑制耐顺铂人肺腺癌移植瘤的生长,可能主要与其特异性下调survivin基因表达有关。特异性靶向survivin反义寡核苷酸可用于肺癌顺铂耐药的辅助治疗,其临床实际应用有待进一步研究。