EGCG对前列腺癌细胞端粒酶的抑制作用及可能的机制

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人雄激素非依赖性前列腺癌细胞端粒酶的抑制作用及可能的作用机制。方法:用不同浓度的EGCG处理体外生长的人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞,MTT法检测EGCG对PC-3细胞的抑制作用,TRAP-PCR银染法检测端粒酶活性以及荧光定量PCR法检测人端粒酶逆转录酶mRNA的表达。结果:与对照组相比,EGCG处理组可使存活率明显降低,并随药物剂量的增加呈下降趋势(P<0.01);TRAP-PCR银染法显示,EGCG能明显抑制人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞端粒酶的活性,并呈剂量依赖性(P<0.05);荧光定量PCR法显示,被EGCG作用的人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞端粒酶逆转录酶mRNA的表达呈下降趋势,并呈剂量依赖性。结论:EGCG可能通过抑制癌细胞的端粒酶的活性来抑制前列腺癌细胞的生长,对癌细胞端粒酶的抑制作用可能是通过抑制端粒酶的关键调节酶-端粒酶逆转录酶来实现的。     

艾恒与传统化疗药物在不同分化程度胃癌细胞株中敏感性的研究

目的:探讨不同分化程度胃癌细胞对艾恒、5-FU、MMC和VP-16的敏感性。方法:将不同浓度的化疗药物与两株不同分化程度的胃癌细胞株共同温育,采用MTT方法检测化疗各药物对胃癌细胞增殖的影响。结果:四种化疗药物对两株胃癌细胞的增殖均具有显著的抑制作用,MKN45细胞株对各化疗药物敏感性顺序为:MMC>VP-16>艾恒>5-FU,而SGC7901细胞株对各化疗药物敏感性顺序为:MMC>艾恒>VP-16>5-FU。中分化的SGC7901对艾恒、MMC、VP-16的敏感性均显著高于低分化的MKN45,而MKN45对5-FU的敏感性高于SGC7901。结论:不同分化程度的胃癌细胞对药物的敏感性不同。     

Inhibitory effects of selenium on telomerase activity and hTERT expression in cadmium-transformed 16HBE cells

Objective To investigate the effects of sodium selenite on telomerase activity and expression of hTERT mRNA in cadmium-transformed 16HBE cells.Methods Telomerase activity and expression of genes were measured after cultured cadmium-transformed 16HBE cells were exposed to sodium selenite at different doses(0.625,1.25,2.50,5.00 μmol/L)for 24 hours.Results Selenium decreased telomerase activity in cadmium-transformed 16HBE cells.There existed an obvious dose-effect relationship between the selenium concentration and these changes.The expression of hTERT and c-myc mRNA also decreased but the expression of mad1 mRNA increased after exposure to selenium for 24 hours.No difference was found in expression of hTRF1 and hTRF2 mRNA after incubated with sodium selenite for 24 hours,compared with control group.Conclusion Selenium inhibits telomerase activity by decreasing hTERT and c-myc mRNA expression and increasing mad1 mRNA expression in cadmium-transformed 16HBE cells and selenium concentration is significantly correlated with these changes.     

三氧化二砷诱导人卵巢癌细胞凋亡对端粒酶活性的影响

目的 探讨As2O3诱导细胞凋亡时对其端粒酶活性的影响及其作用机制.方法 采用光镜、电镜,PCRELISA,RT-PCR等技术,检测细胞凋亡,端粒酶活性及其催化亚单位的表达.结果 As2O3可诱导卵巢癌细胞凋亡,但存在作用浓度,细胞株类型差异性;端粒酶活性随药物作用时间和浓度的增加而明显减弱,同时伴随hTERT mRNA表达水平的下降.结论 端粒酶活性和hTERT mRNA表达在As2O3诱导SKOV3、3AO细胞凋亡过程中共同发挥作用,两者有密切关系,是诱导细胞凋亡的分子机制之一.     

反义核酸对胃癌细胞端粒酶活性与细胞生长的抑制

目的：阐述反义核酸对端粒酶活性抑制作用的浓度依赖性和序列特异性，表明端粒酶活性表达对胃癌细胞分化的不依赖性。方法运用改良的端粒酶活性定量检测法，测定三种胃癌细胞(MKN-28、SGC-7901、MKN-45)的端粒酶活性；用台盼蓝染色法，观察胃癌细胞的活力。结果：三种不同分化程度的胃癌细胞均有端粒酶活性的表达，但其活性的高低与其分化程度没有显著关系。在指定的浓度下，端粒酶反义核酸作用于胃癌细胞后，MKN-45和SGC-7901胃癌细胞出现明显的端粒酶活性和细胞生长的抑制，但在同样浓度条件下，MKN-28胃癌细胞只出现端粒酶活性的抑制。错义序列对照组则无明显变化。结论：端粒酶活性与胃癌细胞的分化没有显著相关性。端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能抑制胃癌细胞的生长和端粒酶活性，其抑制作用有浓度依赖性和序列特异性，其作用机制是通过抑制端粒酶活性，端粒酶活性的抑制并不总是同细胞生长的抑制平行的。     

联合RNA干扰TR及TERT对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖的影响

目的 探索联合RNA干扰TR及TERT[小型干扰RNA(siRNA)、人端粒酶RNA(hTR)及人端粒酶逆转录酶(hTERT)]基因对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响.方法 根据hTRmRNA和hTERTmRNA的序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA并筛选出最高效抑制序列(pRNAT-TR-Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ),构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰装置pRNAT-TR-Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ(脂质体法)并将其转染BIU-87细胞株,采用荧光定量PCR分析hTR及hTERT mRNA表达,TRAP-ELISA检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖.结果 分别及联合RNA干扰hTR及hTERT基因后,pRNAT-TERT-Ⅲ,pRNAT-TR-Ⅲ及pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ的联合干扰可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达(分别减少pRNAT-TERT-Ⅲ TERTmRNA:67%、pRNAT-TR-Ⅲ TRmRNA:41%、pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ TRmRNA:57%、pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ TERTmRNA:70%.P＜0.05).且膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87的生长和端粒酶活性均明显受到抑制,以联合RNA干扰尤为明显(pRNAT-TERT-Ⅲ:1.80±0.014,pRNAT-TR-Ⅲ:1.95±0.016,pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ:1.25±0.012,P＜0.05).结论 联合RNA干扰hTERT及hTR基因能更明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长,为其临床应用奠定了基础.     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。     

胃泌素及丙谷胺对胃癌细胞株MKN45增殖及EGF表达的影响

目的:观察五肽胃泌素(PG)及其受体拮抗剂丙谷胺(PGL)对人胃癌细胞株MKN45增殖及表皮生长因子(EGF)表达的影响。方法:MTT法检测人胃癌细胞株MKN45增殖;放射免疫法(RIA)测定表皮生长因子(EGF)的表达。结果:PG(10-6mol/L)明显促进人胃癌细胞株MKN45增殖,24、48h的促细胞增殖率分别为11.24%、17.63%,丙谷胺(2.0～10.0mmol/L)能阻断这一促增殖作用,并可剂量依赖性地抑制胃癌细胞的生长,且随作用时间延长而增强。同时,在胃癌细胞株MKN45培养液中可检测到EGF,且随培养时间延长EGF含量增加;PG(10-6mol/L)可显著增加MKN45培养液中EGF的含量,丙谷胺(6.0mmol/L)不仅明显阻断PG诱导的EGF增加,并且能够减少胃癌细胞MKN45培养液EGF的含量。结论:五肽胃泌素能促进胃癌细胞株MKN45增殖及EGF表达,而其受体拮抗剂丙谷胺不仅能阻断这一的促进作用,并可抑制胃癌细胞株MKN45增殖及EGF的表达。提示PG的促胃癌细胞增殖作用可能与促进EGF表达有关。     

人端粒酶反转录酶反义寡核苷酸对胰腺癌细胞吉西他滨敏感性的影响

目的 通过体外实验探讨人端粒酶反转录酶(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)能否增强胰腺癌细胞对吉西他滨(健择)的敏感性.方法 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测hTERT mRNA表达情况;端粒重复序列扩增法(TRAP)、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测端粒酶活性;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖能力;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)双染色法检测早期凋亡.结果 瞬时转染hTERT ASODN呈浓度依赖性下调细胞hTERT mRNA表达.0.2 μmol/L hTERT ASODN可显著下调端粒酶活性至0.47.健择在ASODN转染组中的IC50值为(0.8±0.2)μmol/L,而其在单纯脂质体转染对照组中为(7.3±0.9)μmol/L,差异具有统计学意义.ASODN可显著增加健择对肿瘤细胞的凋亡诱导作用,健择诱导的早期凋亡率在ASODN转染组中为60.28%,而其在脂质体对照组中为17.34%.结论 hTERTASODN可增强胰腺癌细胞对健择的敏感性,其机制可能与hTERT mRNA和端粒酶活性下调相关.     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,丙氧鸟苷（HSV—tk／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方法：利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率：利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad—hTERT-HSV／TK以及Ad—CMV—HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率。结果：重组腺病毒Ad—hTERT—EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0．01）,MOI为1时转染率为8．3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad—CMV—HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad—hTERTp—HSV／TK只杀伤LNCaP（P〈0．001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0．01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95．4％。MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6．1％,并有旁观者效应。结论：重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

阳离子卟啉对膀胱肿瘤细胞端粒酶活性抑制作用的研究

目的探讨阳离子卟啉TMPyP4[四-（N-甲基-4-吡啶基）]对膀胱肿瘤细胞株T24和BIU87的端粒酶活性的影响.方法 MTT法测定细胞抑制率;流式细胞仪测定细胞凋亡率;PCR-ELISA法测定肿瘤细胞的端粒酶活性;RT-PCR法测定hTERT和c-myc的mRNA表达量.结果 TMPyP4和阿霉素均表现为剂量和时间依赖的细胞抑制作用.低细胞毒浓度的TMPyP4和阿霉素作用于肿瘤细胞后均能使肿瘤细胞的凋亡率增加,端粒酶活性降低,以及hTERT和c-myc mRNA表达量降低;TMPyP4作用时间较长后,上述作用优于阿霉素.结论低细胞毒浓度的TMPyP4在药物作用时间较长后诱导细胞凋亡的作用优于阿霉素,其作用机制可能与降低hTERT活性和c-mycmRNA表达量有关.     

hTERT基因反义cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响

目的: 研究反义hTERT基因对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响.方法: 构建反义hTERT基因的真核表达载体,采用LIPOFCTAMINETM Reagent转染卵巢癌细胞系SKOV3,通过RT-PCR、Trap-ELASA、生长曲线、裸鼠体内致瘤能力等方法比较转染前后细胞hTERT基因表达、端粒酶活性、细胞生长、致瘤性等方面的变化.结果:转化细胞系细胞hTERT基因的表达受到抑制,端粒酶活性下调,肿瘤细胞的增殖与生长速度明显降低,细胞的克隆形成能力及裸鼠体内的成瘤能力下降,肿瘤的恶性表型部分逆转.结论:应用反义技术下调hTERT基因表达可有效降低端粒酶活性并部分逆转卵巢癌细胞的恶性表型,hTERT基因可望成为卵巢癌基因治疗的新靶点.     

榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响

目的：观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶（hTERT）表达及其启动子的影响，以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法：以榄香烯乳处理胃癌细胞，分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中，2h后加入不同浓度的榄香烯乳，孵育48h后，分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果：榄香烯乳处理后，胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降，且呈浓度依赖性。结论：榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性，抑制hTERT表达，从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。     

反义hTERT体外抑制白血病细胞增殖的研究

目的研究反义hTERT基因对白血病细胞体外增殖的抑制作用。方法体外通过SuperFect将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HL60白血病细胞,再经过G418及PCR筛选鉴定分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HL60-s和HL60-as。随后运用实时荧光定量RT-PCR技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERT mRNA的表达情况及端粒酶的活性进行检测。同时还采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析反义hTERT对白血病细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡。结果与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低HL60细胞内源性hTERT mRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。当各组细胞传至第25代后,与HL60、HL60-s比较,HL60-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加。结论反义hTERT在体外能抑制白血病细胞的生长增殖能力,其潜在、广谱的抗肿瘤作用的分子生物学机制可能是首先通过抑制和下调hTERT表达(端粒酶活性)而最终引发瘤细胞衰亡的途径来实现的。     

Stat3在人胃癌细胞株和组织中的组成性激活及其临床意义

目的探讨信号传导及转录活化因子Stat3在不同类型的人胃癌细胞株和组织中的激活情况及其与胃癌临床病理因素的关系。方法分别采用Western印迹法和凝胶阻滞电泳(EMSA)法检测人正常胃黏膜上皮细胞3T3和5种不同分化类型的人胃癌细胞株(MKN28、SGC7901、MKN45、AGS和NCI-SNU-1)中Stat3蛋白的表达和Stat3 DNA的结合活性;免疫细胞化学染色确定磷酸化Stat3(P-Stat3)蛋白在胃癌细胞内的定位;免疫组织化学法检测50例胃癌组织及正常胃黏膜中P-Stat3蛋白的表达。结果与正常胃黏膜上皮细胞3T3相比,Stat3在5种不同分化类型的人胃癌细胞株中有较高的活性。中分化和低分化胃腺癌细胞株(SGC7901、MKN45和AGS)中Stat3的激活水平高于其他类型的细胞株(MKN28和NCI-SNU-1)。P-Stat3的染色定位于AGS细胞的细胞核。胃癌组织中P-Stat3蛋白的表达水平较正常胃黏膜高,特别是中分化和低分化胃癌组织尤为显著(P＜0．05)。Ⅱ、Ⅲ期胃癌组织中P—Stat3蛋白表达水平显著高于Ⅰ期胃癌(P＜0．05),Ⅳ期胃癌组织中P-Stat3的蛋白表达水平与Ⅰ期胃癌之间差异无显著意义(P＞0．05)。P—Stat3蛋白的表达水平与胃癌的分化程度相关。结论Stat3在各种类型的人胃癌细胞和胃癌组织中都有较高的活性;JAK／STAT信号传导途径可能在胃癌的发生、发展中起重要的作用。     

miRNA-101在胃癌组织和细胞中的表达及对胃癌生物学行为的影响

目的:探讨miRNA-101在胃癌组织和细胞中的表达情况及对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:应用实时荧光定量PCR法分析31例胃癌组织和癌旁组织样本以及人胃癌细胞系SGC-7901、MKN45、人正常胃黏膜上皮细胞系GES1中miRNA-101的表达水平;建立miRNA-101重组腺病毒载体感染胃癌细胞系SGC-7901、MKN45,对照组为感染阴性对照病毒的胃癌细胞系SGC-7901、MKN45,MTT法检测miRNA-101对胃癌细胞增殖能力的影响;Transwell小室法检测胃癌细胞的迁移和侵袭能力.结果:胃癌组织中miR-101表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01);miR-101在细胞系SGC-7901和MKN45中的表达量明显低于人正常胃黏膜上皮细胞系GES1(P<0.01).孵育48 h后MKN45细胞miRNA-101组的细胞增殖能力低于其对照组(P<0.05);而孵育72 h后SGC-7901细胞和MKN45细胞的miRNA-101组细胞增殖能力均亦低于相应对照组(P<0.05).迁移试验结果显示,miRNA-101组迁移的胃癌细胞SGC-7901和MKN45的平均细胞数明显低于相应对照组(P<0.01);侵袭实验结果显示,miRNA-101组侵袭的胃癌细胞SGC-7901和MKN45的平均细胞数亦明显低于其对照组(P<0.01).结论:miRNA-101在胃癌组织和胃癌细胞系中表达下调,转染miRNA-101可明显降低SGC-7901和MKN45细胞的增殖、迁移、侵袭能力,miRNA-101可能参与了胃癌疾病的发生及发展.     

不同肿瘤细胞株人端粒酶逆转录酶及端粒酶活性的检测及其意义

目的：检测5种肿瘤细胞株人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达及端粒酶活性状态，为端粒酶抑制剂在肿瘤治疗学方面的应用研究提供理论基础。方法：分别用免疫细胞化学S-P法和TRAP-ELISA方法检测人宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株SMMC7721、人前列腺癌细胞株PC-3m和人骨肉瘤细胞株U2OS hTERT表达及端粒酶活性状态。 结果：HeLa细胞hTERT表达阳性率最高，为 (93.75±3.10) %；而U2OS阳性表达率最低,仅为(2.75±0.96) %，近于不表达；其他3种细胞MCF-7、SMMC7721和PC-3m的hTERT表达阳性率分别为(92.50±2.65)%、(53.75%±2.22)%和(23.50±2.89)%。与hTERT表达阳性率相似，HeLa细胞端粒酶活性最强，为(94.58±3.49)%；而U2OS 端粒酶活性近于阴性，为(3.02±0.43)%；其他3种细胞MCF-7、SMMC7721和PC-3m的端粒酶活性分别为 (73.90±4.50) %、(66.67±3.35) %和(50.62±1.96) %。结论：5种细胞系中hTERT表达及端粒酶活性状态差别很大，提示端粒酶抑制剂可适用于多数但并非所有恶性肿瘤的治疗学研究。