犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞 诱导分化的研究

 【目的】 探讨犬骨髓基质干细胞的提取。分离和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能。【方法】 从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子-B1(TGF-B1)对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。【结果】 原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6 ~ 9 d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-B1)诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性。阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。【结论】 犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-B1)作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

犬骨髓基质千细胞向软骨样细胞诱导分化的条件研究

目的研究犬骨髓基质干细胞在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的最佳条件。方法从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF．B1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。结果原代培养的基质干细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF．131）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。结论犬骨髓基质干细胞在体外培养在碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF—β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

全骨髓贴壁法分离培养rBMSCs及成骨诱导探讨

[摘要]　目的 通过研究在体外培养大鼠骨髓基质干细胞(rBMSCs)及其成骨生物学特性,探讨构建骨组织工程种子细胞的方法。方法 通过全骨髓贴壁培养法分离大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、维生素C、β2甘油磷酸钠的诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测碱性磷酸酶活性及钙结节茜素红染色反应,进行成骨细胞鉴定。结果 全骨髓贴壁培养下,骨髓基质干细胞增殖能力强,生长迅速,呈成纤维细胞样生长。诱导条件下细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,并且钙结节茜素红染色反应阳性。结论 采用全骨髓贴壁培养法,骨髓基质干细胞分离培养及体外扩增更为简便迅速,诱导条件下成骨能力肯定,可为骨组织工程构建提供大量种子细胞。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的:研究大鼠骨髓基质干细胞体外培养的生长特点和诱导条件下的成骨能力.方法:通过密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用.结果:骨髓基质干细胞呈成纤维细胞样生长,增殖能力强,生长迅速.诱导条件下细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节.结论:骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞.     

成人骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛β细胞的初步研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化成为胰岛β细胞的可能性。方法采用Percoll分离液和差异贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞，在纤维连接蛋白包被。含有表皮生长因子和血小板源性生长因子BB的低浓度血清（2％FBS）培养液中培养，传代后用碱性成纤维细胞生长因子、B27添加剂、尼克酰胺诱导。放免法检测培养液中胰岛素．双硫腙和免疫细胞化学进行鉴定。并进行体外细胞功能测定。结果细胞诱导第二周逐渐聚集成胰岛样细胞团．开始分泌胰岛素，双硫腙染色成猩红色，免疫荧光显示细胞表达胰岛素，体外葡萄糖刺激胰岛素释放试验阳性。结论成人骨髓间充质干细胞可以在体外一定条件下实现向β细胞转分化。     

骨髓间充质干细胞构建组织工程半月板软骨种子细胞

目的使用特定细胞因子刺激诱导分离扩增后的兔骨髓间充质干细胞（Mesenchynml stem cells,MSCs）,在体外试验中使其分化为软骨细胞,为后续构建工程化半月板研究提供种子细胞,探讨兔MSCs重建半月板组织的可行性和有效性。方法用碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和转化生长因子β1（Transforming growth factor-βl,TGF-β1）协同刺激已分离并经体外传代培养扩增的兔MSCs,通过倒置细胞显微镜观察及免疫组化检测,证明其已经向软骨细胞系分化。结果用bFGF和TGF-β1协同刺激已分离并经体外扩增的兔MSCs后,细胞生长速度增快,免疫组织化学检测提示向软骨细胞系分化。结论兔MSCs可向软骨细胞分化;bFGF和TGF-β1能加快MSCs的体外增殖并促使其向软骨细胞系分化,可为构建工程化半月板提供理想的自体来源种子细胞。     

滑膜间充质干细胞软骨分化能力的实验研究

目的 探讨滑膜间充质干细胞软骨分化能力.方法 无菌状态下获取兔颞下颌关节滑膜组织,酶消化法进行滑膜间充质干细胞原代培养,并进行传代扩增.第3代细胞消化后离心成为细胞团块,用软骨诱导液培养,并以鸡尾酒法添加生长因子人重组转化生长因子β1(recombined human transforming growth factorβ1,rhTGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),即前3天2种生长因子共同使用,之后只用rhTGF-β1继续培养18d.细胞团块培养21 d后,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达.细胞团块培养在普通培养基中不添加rhTGF-β1和bFGF作为对照组.结果 滑膜间充质干细胞经过传代培养后,成为形态一致的梭形细胞;细胞团块经软骨诱导液、rhTGF-β1和bFGF培养后,免疫组织化学染色可见Ⅱ型胶原在细胞之间的细胞外基质中明显显色,并且细胞团块的周边要比中央浓染;原本二维培养状态下的梭形滑膜间充质干细胞变为球形的软骨样细胞形态.结论 滑膜间充质干细胞具有很强的成软骨能力,可以作为髁突软骨组织工程的种子细胞.     

bFGF对骨髓基质干细胞体外培养及诱导分化时生物学特性的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化时生物学特性的影响。方法 将兔骨髓基质细胞(BMSC)经淋巴细胞分离液分离培养、传代扩增后，进行定向诱导分化，其中1组的培养液及矿化诱导液中始终含有bFGF。以MTT法描绘细胞生长曲线。结果 MTT法测定结果表明，BMSC加外源bFGF组细胞增殖较BMSC组细胞生长活跃。结论 骨髓基质细胞是一种良好的骨源细胞，具有定向分化能力，bFGF对其定向诱导分化具有良好的促进作用。     

全反式维甲酸联合细胞因子诱导无血清培养的骨髓基质干细胞向神经细胞分化

目的研究全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子等细胞因子联合诱导体外无血清培养的骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经细胞分化的作用。方法用含2%Utroser G的UltraCULTURE无血清培养体系体外扩增大鼠BMSCs，免疫细胞化学染色鉴定其表面标志，用以全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子为主要成分的复合诱导液诱导BMSCs向神经细胞方向分化，镜下观察细胞形态学变化，用抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体和抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体进行免疫细胞化学染色鉴定诱导后的神经细胞。结果经全反式维甲酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合诱导后的BMSCs表现为神经细胞形态特征，诱导后的细胞可存活14 d以上，免疫细胞化学染色显示NSE和GFAP均有阳性表达，前者阳性率为65.6%，后者阳性率为12.5%。结论全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合应用可在体外高效、稳定地诱导无血清培养的BMSCs分化为神经细胞。     

细胞因子对软骨细胞分化形成的作用和影响

目的研究和评价转化生长因子-β1(TGF-β1)和胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在BMG三维支架中对骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的影响和作用。方法分离骨髓基质干细胞,将无血清M c5A培养液分为ABCD四组,先进行单层细胞培养,再置于松质骨基质明胶支架中继续培养,然后进行甲苯胺蓝染色、蛋白多糖含量的测定。结果各组单层细胞培养的细胞个数均有显著性差异,即A组(B组(C组(D组;第20天后各组的BMG支架蛋白多糖含量,即A组(C组(B组(D组(P(0.05)。结论TGF-β1可提高骨髓基质干细胞的软骨分化能力,而IGF-Ⅰ可提高TGF-β1对骨髓基质干细胞软骨分化作用。     

间充质干细胞在构建组织工程软骨中的实验研究

目的探索利用几丁质支架和间充质干细胞(MSC)构建组织工程软骨。方法抽取兔股骨骨髓,密度梯度离心分离骨髓MSC,用转化生长因子β(1TGF-β1)诱导第3代的骨髓MSC向软骨方向分化,2周后用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。将分化后的软骨样细胞传代,接种在几丁质支架上,用含TGF-β1的培养基继续培养2周,再用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况,并在电镜下观察软骨细胞的生长情况。结果骨髓MSC经TGF-β1诱导后,具有软骨细胞特点,接种在几丁质支架上继续培养2周,这些细胞在支架上生长良好,并仍能很好表达Ⅱ型胶原。结论MSC经TGF-β1诱导,分化成的软骨样细胞在几丁质支架上表型稳定,生长良好。     

骨髓基质细胞体外培养的生物学特性和成骨能力初步鉴定

目的体外分离培养狗的骨髓基质细胞（BMSCs），诱导其向成骨细胞分化，初步鉴定其成骨潜能和生物学特性。方法抽取毕格犬髂骨骨髓体外分离培养获得BMSCs，DMEM、新生牛血清培养基进行原代培养，部分传代细胞以含10mmol／L地塞米松、50μg／ml抗坏血酸和10mmol／L β-甘油磷酸钠的矿化培养液诱导其向成骨细胞增殖分化。倒置相差显微镜进行细胞形态学和细胞生长增殖观察，VonKossa法染色检测体外矿化结节形成，细胞碱性磷酸酶染色检测BMSCs的成骨活性。结果体外分离培养的BMSCs经条件培养基诱导后表现出明显的成骨活性，体外矿化（骨样）结节的Von Kossa染色阳性；传代BMSCs碱性磷酸酶染色阳性。结论体外分离培养的BMSCs中含有骨源性前体细胞．传代细胞具有较强的成骨潜能。     

体外诱导小鼠胚芽干细胞分化为肝细胞的实验研究

目的寻找一种诱导小鼠胚芽干细胞向肝细胞定向分化的最佳诱导剂。方法分离提取孕11 d小鼠胚胎的原始生殖细胞,体外培养扩增后,一部分胚芽干细胞接种到6孔培养板中。向不同孔中分别加入不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、β-神经生长因子（β-NGF）、维甲酸（RA）、肝细胞提取液进行诱导分化。另一部分胚芽干细胞与胎肝组织共培养。将培养12 d的细胞采用靛青绿摄入试验和白蛋白（ALB）免疫细胞化学染色来鉴定原始生殖细胞向肝细胞分化的情况。结果与胎肝组织共培养和添加了β-NGF、肝细胞提取液的胚芽干细胞能够诱导成肝样细胞,这些肝样细胞能够摄取ICG并表达ALB,上述3组细胞ALB阳性细胞数较对照组明显增多（P〈0.05）。bFGF、EGF、RA并无诱导分化作用。结论β-NGF、胎肝组织产生的细胞因子及肝细胞提取液中的细胞因子可诱导小鼠胚芽干细胞向肝细胞分化。     

兔骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的体外诱导兔骨髓基质干细胞（BMSC）向软骨细胞定向分化，并对分化后的细胞进行鉴定。方法选用16周新西兰大白兔，于胫骨或股骨抽取骨髓，经梯度离心、培养、扩增，取第3代BMSC按一定比例种植于6孔板中，并加入含有转化生长因子β1、地塞米松和维生素C的培养液、于不同时间点取材固定，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴别、结果诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性；II型胶原免疫组化阳性。结论在本实验条件下，获取的兔BMSC生长稳定、增殖快，并成功地诱导其向软骨细胞表型转化。     

人骨髓间质干细胞体外培养诱导成为心肌样细胞的实验研究

目的 研究人骨髓间质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 取成人髂骨骨髓，分离出骨髓间质干细胞进行培养、传代。观察在培养液中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)条件下骨髓间质干细胞的生长和分化。结果 成人骨髓间质干细胞贴壁呈集落生长，有成纤维细胞样外观。5-aza诱导人骨髓间质干细胞转化为心肌样细胞。结论 人骨髓间质干细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，是心肌组织工程良好的细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法:以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs,观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松,维生素C和不同剂量转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖,免疫荧光检测II型胶原,阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果:体外培养条件下MSCs生长旺盛。在TGF-β1作用下MSCs向软骨骨细胞分化,TGF-β110μg/L组软骨细胞标志物表达最强。结论:MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化,转化生长因子β1(TGF-β1)是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素,10μg/L是其最佳诱导剂量。     

Muse细胞体外诱导为神经前体细胞的初步研究

【目的】 从成人骨髓中分离出Muse细胞,体外诱导成神经前体细胞,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞。 【方法】 利用密度梯度离心和差速贴壁法从健康成人骨髓中分离、培养骨髓基质干细胞,通过免疫荧光细胞化学技术和流式细胞仪技术对其进行鉴定;体外扩增、传代6次后利用Muse细胞特征性的SSEA-3/CD105分子表型阳性,通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出Muse细胞并进行体外培养,观察其干细胞成球特性;对Muse细胞进行胰蛋白酶孵育,分析其应激耐受能力;利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞的多能干细胞标记物表达情况;通过在培养基中添加成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等对Muse细胞向神经前体细胞方向进行体外诱导,观察神经前体细胞的干细胞成球情况,利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术对其进行表型鉴定并观察神经前体细胞标记物的表达情况。 【结果】 从成人骨髓中分离出骨髓基质干细胞,免疫荧光细胞化学检测和流式细胞仪检测结果显示CD90表达阳性、CD45和CD11b表达阴性;通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出约0.5%的Muse细胞进行培养,细胞聚集成球,悬浮生长,表现为胰蛋白酶耐受;免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示Muse细胞表达多能干细胞标记物Nanog、Oct4、Sox2阳性;体外诱导Muse细胞向神经前体细胞方向分化,观察到细胞成球现象,免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示诱导后细胞表达神经前体细胞标记物nestin、βIII-tubulin。 【结论】 从成人骨髓中成功分离出Muse细胞,具有多能干细胞特性,经体外诱导形成神经前体细胞,为以后组织工程移植修复神经损伤提供新的种子细胞。     

非诱导条件下犬骨髓基质细胞的生物学特性

目的 研究体外培养骨髓基质细胞(BMSC)的生长特点和非诱导条件下的成骨特性。方法 采用犬来源BMSC体外扩增培养，观察非诱导条件下BMSC生长变化和成骨分化。结果 形态学观察表明，BMSC贴壁细胞呈集落生长，有成纤维细胞样外观，未加入成骨诱导剂，细胞形态发生变化，钙沉积出现，碱性磷酸酶(ALP)表达。3代内扩增的BMSC有成骨活性，但原代细胞成骨活性优于传代后细胞。结论 体外培养BMSC能大量扩增，具有自然向成骨细胞分化的能力，是骨组织工程理想的种子细胞。本实验所培养的BMSC具有骨祖细胞特性。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养诱导为心肌样细胞的实验研究

目的 研究大鼠骨髓基质细胞体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 取成年大鼠胫骨干骨髓基质细胞进行培养，保留附壁细胞传代，观察在培养液中添加诱导剂5－氮胞苷条件下骨髓基质细胞的生长和分化。结果 在形态上，大鼠骨基质细胞贴壁呈集落生长，有成纤维细胞样外观。5－氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，在诱导后4周转化率接近30％。结论 骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，是自体心肌细胞一种良好的供体来源。     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。