鸡盆血病毒vp3基因的克隆及其体外凋亡诱导效应的研究

用PCR方法扩增了鸡盆血病毒标准株的vp3基因，并将其克隆于真核表达载体pcDNA3上，构建了重组体pcDNA-vp3。经酶切鉴定及测序分析表明，该片段和预测相符。在体外利用LipofectAMINE^TM介导的基因转染，将pcDNA-vp3,pcDNA3分别转入肝癌细胞系HepG2倍体肝细胞系L-02中，转染后的RT－PCR结果证实vp3基因在细胞中得到了表达。同时利用筛选稳定表达细胞株的技术和原位细胞凋亡检测法，证明了鸡盆血病毒是以凋亡的方式诱导细胞死亡，并且只诱导癌细胞的凋亡。而不诱导正常或二倍体细胞死亡。表明鸡贫血病毒vp3基因很可能成为一种极具潜力的抗肿瘤生物制剂。     

重组凋亡素真核表达载体诱导人卵巢癌细胞凋亡

目的 观察凋亡素基因（VP3）在卵巢癌细胞株CoCl中诱导凋亡的情况。方法 用Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ分别双酶切pMD18-CAVP3和pcDNA3．1（＋），分别回收365bp和5．0kb大小的片断，然后常规行连接反应，构建重组凋亡素真核表达栽体pcDNA3．1-VP3。采用Lipofectamine^TM 2000介导的基因转染法，在体外将pcDNA3．1-VP3转染入卵巢癌细胞株CoCl中，RT—PCR检测凋亡素在细胞中的表达，用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 酶切鉴定及测序结果表明重组凋亡素真核表达载体pcDNA3．1-VP3构建成功。RT—PCR证实VP3基因在COCl中存在并在转录水平表达。转染pcDNA3．1-VP3细胞凋亡率明显高于转染空质粒组（P〈0．01）。结论 凋亡素可有效诱导卵巢癌细胞COCl凋亡。     

鸡贫血病毒VP 3基因的克隆及其体外凋亡诱导效应的研究

用PCR方法扩增了鸡贫血病毒标准株的vp3基因,并将其克隆于真核表达载体pcDNA3上,构建了重组体pcDNA-vp3.经酶切鉴定及测序分析表明,该片段和预期相符.在体外利用LipofectAMINETM介导的基因转染,将pc-DNA-vp3、pcDNA3分别转入肝癌细胞系HepG2和二倍体肝细胞系L-02中,转染后的RT-PCR结果证实vp3基因在细胞中得到了表达.同时利用筛选稳定表达细胞株的技术和原位细胞凋亡检测法,证明了鸡贫血病毒是以凋亡的方式诱导细胞死亡,并且只诱导癌细胞的凋亡,而不诱导正常或二倍体细胞死亡.表明鸡贫血病毒vp3基因很可能成为一种极具潜力的抗肿瘤生物制剂.     

Fas基因在卵巢癌细胞凋亡中的作用

目的 :检测Fas基因表达并观察转染Fas基因对卵巢癌细胞凋亡的影响 ,探讨其在卵巢癌发生、发展中的作用。方法 :经流式细胞术、RT PCR方法检测 6种卵巢癌细胞Fas的表达水平。构建pcDNA3 Fas真核表达载体 ,经脂质体转染细胞 ,通过流式细胞仪检测Fas基因表达变化。应用PI染色经流式细胞术检测观察转染Fas基因对3AO细胞凋亡的影响。结果 :6种卵巢癌细胞均表达Fas,均属中低表达。经 pcDNA3 Fas真核表达载体转染的卵巢癌细胞Fas基因表达及对Fas单抗诱导凋亡的敏感性均有不同程度提高。结论 :Fas基因低表达及对Fas介导凋亡的抵抗可能与卵巢癌发生、发展有关 ;转染Fas基因可提高Fas基因表达 ,可促进卵巢癌细胞凋亡     

人金属硫蛋白1H基因对肺腺癌细胞A549耐药性的影响

目的：探讨金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因对人肺腺癌A549细胞耐药性的影响．方法：构建真核表达载体pcDNA3．1（-）-MT1H,利用脂质体介导将其转染肺腺癌A549细胞,G418筛选阳性克隆．分别以RT—PCR和Western方法检测MTIH mRNA和蛋白表达情况,MTT法检测细胞对顺铂的药物敏感性;流式细胞仪（FCM）检测顺铂诱导细胞凋亡率．结果：转染pcDNA3．1（-）-MT1H的细胞,其MT1H mRNA和蛋白表达水平显著高于亲本细胞及转染空载体细胞,细胞对顺铂药物敏感性明显下降,顺铂诱导的凋亡率明显降低．结论：MT1H能促进A549细胞耐药,可能和降低顺铂诱导细胞凋亡有关．     

恢复野生型PTEN基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468体外生物学行为的影响

目的研究野生型PTEN基因转染对人炎性乳腺癌MDA—MB-468细胞体外生物学行为的影响及机制。方法应用基因重组技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN，用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA—MB-468，用RT—PCR、免疫组化及免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达，并用免疫印迹方法检测转染后，在表皮生长因子的诱导下，磷酸化蛋白激酶B（PKB／Akt）的表达，四甲基唑蓝（MTT）法分析细胞增殖。Annexin V—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果RT—PCR、免疫组化及免疫印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达，且显示转染组在表皮生长因子的诱导下，p-Akt蛋白表达下调。MTT检测表明pcDNA3．1-PTEN转染组活细胞数较其它各组均低（P〈0．01），流式细胞分析其凋亡率达21．68％。结论野生型PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导乳腺癌MDA—MB-468细胞凋亡。     

鸡贫血病毒VP3基因体内抑瘤效应的实验研究

目的 观察鸡贫血病毒（chicken anemia virus,CAV)VP3基因的体风抑瘤效应。方法 分别将PCDNA-VP3（含VP3基因的真核表达载体），PCDNA3（空载体）和小鼠腹水型肝癌细胞株H22混合后，接种于BALB/c小鼠皮下，几天后，处死动物，取肿瘤组织称重，比较试验组和对照组瘤重差异，确定VP3基因的抑瘤效应，TUNEL法鉴定VP3在体内诱导肿瘤细胞死亡的方式。结果 注射VP3基因的试验组肿瘤生长率明显低于注射空载体的对照组。TUNEL试验的结果也表明，鸡贫血病毒VP3蛋白在体内调亡方式诱导肿瘤细胞死亡。结论 预示VP3基因可能在抑制肝癌细胞生长方面有一定的疗效。     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染+丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义(F=6 250.510,q=56.992、51.613,P<0.01)。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法　从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果　RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论　该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。     

减毒沙门菌介导的TRAIL和VP3对胃癌细胞的生长抑制作用及其机制

目的:利用沙门菌作为真核质粒携带载体,在体内外观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和鸡贫血病毒VP3基因对胃癌细胞的生长抑制作用.方法:将重组质粒pBud-TRAIL、pBud-VP3、pBud-TRAIL-VP3电转化减毒沙门菌SL7207,经稳定性鉴定后直接转杂胃癌细胞株SGC-7901,24 h后利用荧光显微镜观察有无融合绿色荧光蛋白表达,MTT法检测表达载体对胃癌细胞的生长作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期变化,并用免疫组织化学方法检测该载体对胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9表达的影响.荷瘤小鼠口服携带重组质粒的减毒沙门菌,8周后通过RT-PCR检测肿瘤组织内真核载体的表达状况,并测量荷瘤瘤体大小.结果:重组质粒能够在减毒沙门菌中稳定存在,经减毒沙门菌介导转染胃癌细胞后能够较好的表达,转染48 h后可见到TRAIL和VP3对胃癌细胞生长有抑制作用,流式细胞仪观察到pBud-TRAIL-VP3能使胃癌细胞的凋亡率明显增高,TRAIL和VP3能够协同促进胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9的表达.体内实验提示pBud-TRAIL-VP3沙门菌载体能够在肿瘤组织中表达并能抑制肿瘤生长(P<0.05).结论:减毒沙门菌将外源基因VP3和TRAIL基因导入胃癌细胞后,体内外实验证实该载体对胃癌细胞的生长起明显抑制作用,TRAIL和VP3联合作用机制与促进Caspase-3、Caspase-9的表达有关.     

Cloning of Chicken Anemia Virus vp3 Gene and Apoptosis Inductive Effect of vp3 Gene In Vitro

Chickenanemiavirus (CAV)isaparticulartypeviruswithadiameterofabout 2 3nmandcontainsacircularsinglestrandDNA (minusstrand)of 2 .3kb .ItwasfirstisolatedbyYuasaetalin 1979[1] ,andbelongstotherecentlyestablishedvirusfamilyofCircovirdae[2 ] .ExperimentsperformedbyNotebornetaldemonstratedthatCAVinducesdepletionofcellsviaapoptosisandthecellularbackgroundspeci fiesthesusceptibilitytoCAV[3] .Theinvitroexper imentsdemonstratedthatVP3isthefunctionalpro teinofCAV .AndtheCAVVP3proteincanonlyin du…     

Cloning of chicken anemia virus vp3 gene and apoptosis inductive effect of vp3 gene<Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

Summary Using PCR technique, the vp3 gene of chicken anemia virus (CAV) was cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct a recombinant pcDNA-vp3. Restriction enzyme digestion and sequencing analysis revealed that CAV vp3 gene was correctly inserted into the blank vector pcDNA3. After LipofectAMINE^TM-mediated transfectionin vitro with pcDNA-vp3 and pcDNA3 respectively, the total mRNA was extracted from liver carcinoma cell lines HepG2 and diploid cell line L-02, and RT-PCR was performed afterward. The results of RT-PCR suggested that vp3 gene was expressed in these two cell lines. At the same time, usingin situ apoptotic detection assay, TUNEL kits, the apoptotic cells were found in pcDNA-vp3 transfected HepG2, but not in mock transfected cell lines. VP3 could induce cell death by apoptosis in cancer cell lines, but not in diploid cell lines. All the results indicated that CAV vp3 gene, a potential therapeutic agents, has the potential of being used for cancer treatment. Sun Jun, male, born in 1970, Graduate Student This project was supported by a grant from the Hubei Natural Science Foundation (No. 2002ABA004).     

Experimental Study on the Antitumor Effect of Chicken Anemia Virus vp3 Gene against Liver Carcinoma In Vivo

In order to testify the antitumor effect, especially its effect against liver carcinoma in vivo,of VP3 protein, one kind of protein coded by chicken anemia virus, recombinants pcDNA-vp3 con-taining chicken anemia virus vp3 gene, and control vector pcDNA3 were mixed with murine liver car-cinoma cell lines H22 respectively. The mixture was injected subcutaneously into Balb/C mice. Somedays later, the mice were killed and the solid tumor weighed. The antitumor efficiency was evaluat-ed. The manners of VP3 protein in vivo inducing tumor cell death were identified by using TUNELassay. All the results suggested that the injection of pcDNA-vp3 and H22 mixture resulted in a sig-nificant reduction of tumor growth in mice when compared with the results of control groups.TUNEL assay revealed that VP3 induced apoptosis in vivo. All these indicated that CAV vp3 mightbe a potential new gene in reducing the growth rate of tumor cells in liver carcinoma or in other kindof solid tumors in vivo.     

Experimental study on the antitumor effect of chicken anemia virus vp3 gene against liver carcinomain vivo

Summary In order to testify the antitumor effect, especially its effect against liver carcinomain vivo, of VP3 protein, one kind of protein coded by chicken anemia virus, recombinants pcDNA-vp3 containing chicken anemia virus vp3 gene, and control vector pcDNA3 were mixed with murine liver carcinoma cell lines H22 respectively. The mixture was injected subcutaneously into Balb/C mice. Some days later, the mice were killed and the solid tumor weighed. The antitumor efficiency was evaluated. The manners of VP3 proteinin vivo, inducing tumor cell death were identified by using TUNEL assay. All the results suggested that the injection of pcDNA-vp3 and H22 mixture resulted in a significant reduction of tumor growth in mice when compared with the results of control groups. TUNEL assay revealed that VP3 induced apoptosisin vivo. All these indicated that CAV vp3 might be a potential new gene in reducing the growth rate of tumor cells in liver carcinoma or in other kind of solid tumorsin vivo. SHEN Zhifa, male, born in 1971 Lecturer     

抑癌基因fhit对肝癌细胞HuH-7体内外生长的影响

目的:研究外源性人脆性组氨酸三联体(fhit)的高表达对人肝癌细胞HuH-7体内外生长的影响。方法:构建一个包含人脆性组氨酸三联体基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/fhit,转染fhit阴性的人肝癌细胞HuH-7,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法分别检测目的基因不同水平的表达,通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术检测细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡。通过裸鼠移植瘤实验,观察fhit基因对人肝癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结果:RT-PCR、Western印迹法检测转染pcDNA3.1(+)/fhit后HuH-7细胞的fhit-mRNA(1.1kb)、fhit蛋白(16.8kDa)表达阳性,转染后对HuH-7细胞的生长有抑制作用,早期细胞凋亡增加,与对照组比较差异有统计学意义[(78.51±1.17)vs(47.25±0.61)、(51.25±1.21),P<0.05]。fhit在体内能明显抑制移植瘤的生长,与HuH-7和HuH-7-C比较HuH-7-fhit细胞形成的肿瘤出瘤时间较晚,生长慢,肿瘤体积和瘤重小,差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率分别为85.17%and87.14%。结论:fhit基因通过诱导肿瘤细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞在肿瘤基因治疗方面发挥作用。     

嗜肺军团菌mip基因真核表达重组质粒构建与表达

目的构建嗜肺军团菌m ip基因的真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip,并研究其在细胞中的表达。方法PCR扩增嗜肺军团菌m ip基因,导入载体pcDNA 3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip。用脂质体法将重组质粒pcDNA 3.1-m ip转染N IH 3T 3细胞,采用免疫荧光法和W estern-b lot分别鉴定pcDNA 3.1-m ip的瞬时表达产物和稳定表达产物。结果在细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA 3.1-m ip成功转入N IH 3T 3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA 3.1-m ip稳定转染的N IH 3T 3细胞,在相对分子质量24×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA 3.1-m ip在细胞内表达出M ip蛋白。空质粒pcDNA 3.1( )转染的N IH 3T 3细胞未检测到绿色荧光和杂交信号。结论成功构建m ip基因真核表达重组质粒,并在N IH 3T 3细胞中表达出相对分子质量为24×103的M ip蛋白。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

THY1基因对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 构建THY1真核表达质粒,并探讨THY1基因对上皮性卵巢癌细胞系SKOV3生长的影响.方法 通过RT-PCR方法,从人正常卵巢组织中获得THY1基因,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成重组质粒pcDNA3.1( )-THY1,并转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆,经PCR、酶切及DNA测序鉴定;脂质体介导法转染SKOV3细胞并筛选稳定表达(SKOV3-THY1组),同时设空质粒转染组(SKOV3-Null组)和空白对照组(SKOV3组),RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达情况;MTT法和流式细胞术检测THy1对SKOV3细胞生长和凋亡等生物学行为的影响.结果 经过PCR、酶切及DNA测序证实,外源性THY1基因正确插入到真核表达质粒pcD-NA3.1( )中,RT-PCR和western blotting证实此重组质粒已整合于SKOV3细胞并获稳定表达;MTT法结果提示SKOV3-THYl组的细胞抑制率(第5天的细胞抑制率为56.6%)明显高于SKOV3-Null组(12.5%)(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,SKOV3-THY1组凋亡率(31.8%)明显高于SKOV3-Null组(10.5%)和SKOv3组(9.8%),差异有统计学意义(P＜0.05),SKOV3-Null组和SKOV3组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了THY1真核表达质粒pcDNA3.1( )-THY1,该质粒转染SKOv3细胞可抑制其生长,THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用.