逆转录病毒介导Fcy::Fur融合基因联合5-FC治疗裸鼠体内胶质瘤实验研究

目的:构建含融合自杀基因Fcy::Fur重组逆转录病毒,用自杀基因治疗系统Fcy::Fur/5-氟胞嘧啶(5-FC)对裸鼠胶质瘤进行体内抑瘤作用的实验研究.方法:扩增Fcy::Fur基因并构建Fcy::Fur基因重组逆转录病毒载体:载体转染包装细胞获得高滴度病毒并转染鼠胶质瘤细胞C6,筛选并鉴定阳性转基因克隆;构建稞鼠荷胶质瘤动物模型,腹腔注射5-FC,观察裸鼠肿瘤重量变化及电镜、流式细胞仪(FCM)检测肿瘤的凋亡.结果:PCR法扩增出全长Fcy::Pur基因,经测序证实序列正确;构建了PLXSN-Fcy::Fur逆转录病毒载体,裁体转染包装细胞PT67,获得滴度为3.5×106 CFU/ml的逆转录病毒:转染C6获转基因阳性克隆C6-Fcy::Fur,检测C6-Fcy::Fur有Fcy::Fur基因的mRNA表达;裸鼠前肢背部接种转基因细胞,成瘤后腹腔注射5-FC,转基因肿瘤的生长较对照组明显抑制.FCM法检测到凋亡峰,电镜观察到转基因肿瘤细胞有凋亡小体.结论:AdE1CMVCD与5-FC联合在体内对胶质瘤有明显的抑制作用,为临床胶质瘤基因治疗提供了可靠的理论及应用依据.     

逆转录病毒介导Fcy∷Fur/5-FC基因治疗对脑胶质瘤杀伤作用的研究

目的:研究融合型自杀基因Fcy∷Fur联合5-FC对胶质瘤细胞株C6的杀伤效果。方法:扩增Fcy∷Fur基因并构建Fcy∷Fur基因重组逆转录病毒载体PLXSN-Fcy∷Fur;载体转染包装细胞PT67获得高滴度病毒再转染鼠胶质瘤细胞C6,筛选并鉴定阳性转基因克隆;以MTT法和FCM法检测5-FC对Fcy∷Fur转基因细胞的杀伤效应。结果:PCR法扩增出全长Fcy∷Fur基因,经测序证实序列正确;PLXSN-Fcy∷Fur滴度为3×106CFU/ml;RT-PCR检测显示Fcy∷Fur转基因阳性克隆的C6细胞有效表达目的基因的mRNA;应用5-FC后FCM法检测到显著的凋亡峰,MTT法检测细胞有明显的杀伤效应。结论:融合型自杀基因Fcy∷Fur联合5-FC可对胶质瘤细胞C6产生明显的杀伤作用。     

脑源性神经营养因子受体trkB基因扩增和真核表达载体的构建

目的 构建大鼠脑源性神经营养因子受体trkB基因真核表达载体。方法 根据trkB基因已知序列，设计合成一对引物，上、下游引物分别引入EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点，用反转录PCR(RT-PCR)方法从大鼠脑组织总RNA中扩增编码trkB的基因片断，插入克隆载体pMD18-T，构建pMD18-trkB载体。经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切出trkB基因片断．再克隆至载体pEGFP-C2中构建pEGFP-C2-trkB真核表达载体。结果 trkB基因RT-PCR扩增产物大小约1461bp，真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 成功扩增出完整trkB基因，构建了真核表达载体pEGFP-C2-trkB。     

脑源性神经营养因子受体trkB基因扩增和真核表达载体的构建

目的构建大鼠脑源性神经营养因子受体trkB基因真核表达载体。方法根据trkB基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点,用反转录PCR(RT-PCR)方法从大鼠脑组织总RNA中扩增编码trkB的基因片断,插入克隆载体pMD 18-T,构建pMD 18-trkB载体。经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切出trkB基因片断,再克隆至载体pEGFP-C2中构建pEGFP-C2-trkB真核表达载体。结果trkB基因RT-PCR扩增产物大小约1 461 bp,真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子,基因测序结果与已知序列基本吻合。结论成功扩增出完整trkB基因,构建了真核表达载体pEGFP-C2-trkB。     

pEGFP-N1-Fcy::Fur重组质粒的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的:构建携带融合型自杀基因Fcy::Fur的荧光真核表达质粒pEGFP-N1-Fcy::Fur,并观察其在卵巢癌细胞中的表达.方法:应用基因重组技术,将pORF-Fcy::Fur中的Fcy::Fur目的基因亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-N1,以酶切1和测序鉴定重组质粒的正确性.应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入SKOV3细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)瞬时表达情况,用Western blot方法检测Fcy::Fur表达.结果:酶切和测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,荧光显微镜下观察到GFP表达.60%转染细胞发出绿色荧光.Western-blot检测到Fcy::Fur表达.结论:成功构建pEGFP-N1-Fcy::Fur荧光真核表达质粒,并可在卵巢癌细胞中有效表达,为卵巢癌基因治疗提供实验基础.     

靶向克隆法构建NY-ESO-1基因的原核表达载体

目的:利用PCR产物靶向克隆法构建人癌-睾丸抗原NY-ESO-1的原核表达载体。方法:从人新鲜的食管癌组织中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增NY-ES0-1基因3′端的340bp片段,采用靶向克隆法将目的基因插入到原核表达载体pET-15b中,得到重组表达质粒pET-15b-NY-ESO-1,经过筛选,挑选出阳性克隆进行XhoⅠ和BamHⅠ双酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物核苷酸序列分析等,鉴定所构建的原核表达载体。结果:扩增得到NY-ESO-1基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR,酶切鉴定获得了一个大小为340bp的特征性片段,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因NY-ESO-1。结论:靶向克隆法可快速、高效地构建人NY-ESO-1基因的原核表达载体,为制备pET-15b-NY-ESO-1融合蛋白奠定了基础。     

人胃蛋白酶原A基因原核表达载体构建及鉴定

目的构建人胃蛋白酶原A(Pepsinogen A)原核表达载体,用于下一步人胃蛋白酶的表达。方法以Pepsinogen A CDNA为模板,利用PCR技术扩增Pepsinogen A基因,与pMD18-T载体相连构建载体pMD18-T/Pepsinogen A,提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并测序鉴定,插入原核表达载体pET30a的相应位点,构建原核表达载体pET30a-Pepsinogen A,经菌落PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切分析鉴定重组质粒。结果 PCR扩增出约1 000bp的Pepsinogen A基因片段,经酶切和测序验证Pepsinogen A基因正确;克隆至表达载体后,菌落PCR及双酶切证明pET30a-Pepsinogen A原核表达载体构建成功。结论成功构建了pET30a-Pepsinogen A原核表达载体,为进一步分析研究人胃蛋白酶提供了实验基础。     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。     

BALB/c小鼠MHCⅠ类基因的克隆与逆转录病毒载体的构建

目的：构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子的逆转录病毒表达载体。研究：用RT－PCR从BALB/c小鼠脾细胞基因组中扩增BALB/c小鼠MHCⅠ类分子H－2Dd的编码基因，克隆于载体pGEM-T中。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，亚克隆于逆转录病毒载体pMSCV，构建pMSCV-H2Dd4重组逆转录病毒表达质粒，并进行酶切和序列测定鉴定。结果：用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定证实，H－2Dd基因正确插入载体pMSCV,H-2Dd的编码基因经序列测定证实，与文献报道完全一致，阅读框架与设计相符。结论：成功构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子编码基因的逆转录病毒载体，为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用奠定了基础。     

hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF-α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1.34 kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386 bp、954;bp两个片段,分别以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α 386、pBSKS-HGF-α 954中切出的386 bp、954 bp两个片段以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF-α cDNA插入到载体pBV220的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS-PAGE显示一分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论设计制备了hHGF-α链cDNA,克隆建立了hHGF-α链原核表达质粒。