转粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因瘤苗治疗T细胞淋巴瘤的实验研究

目的:探讨转粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophge colong stimulating factor,GM-CSF)基因瘤苗治疗小鼠T淋巴细胞瘤的方法。方法:将小鼠GM-CSF真核表达质粒用电穿孔法导入小鼠淋巴瘤细胞系RMA,有限稀释法制备单个细胞克隆,经RT-PCR、骨髓祖细胞增殖实验和集落形成实验筛选相对高表达GM-CSF的RMA克隆,该克隆细胞经丝裂霉素灭活后免疫小鼠以诱导其产生抵抗RMA肿瘤细胞再攻击的能力。结果:获得了高表达GM-CSF的RMA克隆,将其用丝裂霉素灭活后免疫小鼠使小鼠使小鼠产生了抗肿瘤免疫保护力。结论:转GM-CSF基因瘤苗可作为有效的抗肿瘤瘤苗。     

C57小鼠淋巴细胞瘤电转染GM-CSF基因研究

目的:制备高表达GM-CSF的C57小鼠T淋巴瘤细胞系。方法:将小鼠GM-CSF真核表达质粒用电穿孔方法导入C57小鼠T淋巴瘤细胞中,倍比稀释法制备单个细胞克隆,经RT-PCR、骨髓干细胞增殖实验和集落形成实验筛选相对高表达GM-CSF的RMA-GM克隆。结果:获得了高表达GM-CSF的RMA细胞系RMA-GM,其出瘤时间延长。结论:C57小鼠RMA-GM克隆细胞出瘤时间延长,肿瘤细胞免疫原性增强。     

B7基因转染对小鼠肝癌细胞致瘤性的影响

目的：研究小鼠Ｂ７基因转染对小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ６细胞株细胞形态、生长速度及致瘤性的影响。方法：用逆转录病毒载体，将小鼠Ｂ７基因导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ６细胞株中，经Ｇ４１８筛选，获得高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆，采用ＣＴＬＡ４Ｉｇ的间接免疫荧光法检测Ｂ７分子的表达情况，并观察了Ｂ７基因转染对细胞形态、生长速度及致瘤性的影响。结果：①亲本小鼠肝癌细胞株Ｈｅｐａｌ６不表达Ｂ７分子，转染Ｂ７基因的Ｈｅｐａｌ６细胞高表达Ｂ７分子；②转染Ｂ７基因的Ｈｅｐａｌ６细胞与亲本Ｈｅｐａｌ６细胞相比，体外生长速度和细胞形态无明显改变，但免疫原性大大增强，致瘤性消失。结论：Ｂ７基因转染使得小鼠肝癌细胞株Ｈｅｐａｌ６免疫原性大大增强，致瘤性消失     

人脑胶质瘤细胞系CHG-5的建立及其生物学特性的分析

目的：建立一人脑胶质瘤细胞系并探讨其生物学特性。方法：取胶质瘤新鲜手术标本,经组织块法培养并克隆、建株,采用光镜、电镜、免疫组化、流式细胞术、染色体分析及异种移植瘤实验对细胞株生物学特性进行观察。结果：原位肿瘤、细胞株及移植瘤标本经电镜证实为星形细胞源性,免疫组化呈ＧＦＡＰ、Ｖｉｍ ｅｎｔｉｎ及ＶＥＧＦ阳性,异种移植成瘤率高。与ＳＨＧ－４４细胞比较,ＧＦＡＰ表达强,Ｖｉｍ ｅｎｔｉｎ 表达弱。结论：ＣＨＧ－５为一恶性胶质瘤细胞系,且其生物学特性可能与ＳＨＧ－４４细胞有所不同。该细胞高表达血管生成因子     

人GM-CSF基因的克隆及其稳定表达细胞系的建立

目的研究和建立人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（gramulocyte／macrophase colony-stimulating factor,GM—CSF）造血生长因子的高效表达细胞系,以降低生产成本。方法GM—CSF cDNA基因的扩增采用RT—PCR方法;基因转移采用电转移方法;细胞系采用小鼠B淋巴细胞系（L1／2）;表达产物鉴定采用Western blotting、ELISA及其生物活性测定方法。结果将扩增出的GM-CSF cDNA克隆到pcDNA3．1A载体上,构建成GM—CSF基因的重组表达载体（pcDNA—GMCSF）;经电转移将GM—CSF cDNA转移L1／2细胞中,通过G418的筛选,得到稳定表达重组人GM—CSF的细胞系。经过分析证明表达的重组人GM-CSF具有生物学活性,平均表达水平可达850ng／10^6细胞。结论本文建吐的细胞系能够高效表达具有生物学活性的重组人GM—CSF。     

腺病毒载体转导GM—CSF基因制备肿瘤疫苗对小鼠肿瘤模型预防及治疗的实验性研究

目的：评价重组腺病毒载体转导粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）、γ－干扰素（IFN－γ）、单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）基因所制备的肿瘤疫苗对同源性小鼠肿瘤模型的预防和治疗功效。方法：巨细胞病毒（CMV）起动子、特定的细胞因子cDNA片段和SV40多聚腺苷信号组成细胞因子基因表达载体，通过基因重组产生重组腺病毒（Adv/GM-CSF、Adv/IFN-γ、Adv/MCP-1）。重组腺病毒直接人肾胚胎细胞系293细胞，选择最佳感染滴度，以不同的效靶比转染不同的肿瘤细胞系CT26、RENCA和BALB／3T3纤维母细胞，经照射灭活后制备不同的肿瘤疫苗，用于各种肿瘤模型。结果：表明经基因转导后的肿瘤细胞以及照射灭活经基因转导后的肿瘤细胞可以分泌转导的细胞因子。接种经照射灭活的转导GM－CSF结肠癌细胞系CT26后，90％的同源性小鼠对原代CT26细胞的攻击起到了保护作用，而接种转导IFN-γ和MCP－1基因制备的肿瘤疫苗对小鼠经原代CT26细胞的攻击未有保护作用。同源性小鼠接种分泌GM－CSF的肿瘤疫苗后，对CT26原代细胞的多次 攻击在整个观察期间未见肿瘤生长。接种分泌GM－CSF的肿瘤疫勒后机体长期、特异性的抗肿瘤免疫的建立需要GM－CSF及肿瘤抗原在接种部位的同时存在，CD8T细胞亚群的缺失，明显阻断了分泌GM－CSF肿瘤疫苗的功效。皮下注射分泌的GM－CSF肿瘤疫苗能够有效地阻止预先植入小鼠体内小负荷肿瘤细胞的生长，同时也可以有效的阻止接种前7天或后3天静脉内注射原代CT26瘤细胞在肺内转移灶的生长。结论：在本研究实验性肿瘤模型中，皮下注射重组病毒载体转导GM－CSF基因制备的肿瘤疫苗不仅能够有效地预防皮下接种原代CT26肿瘤细胞的生长而且也可消除原有的肿瘤病灶及转移瘤灶，使机体建立了长期、特异性的抗肿瘤免疫反应。     

GM-CSF对膀胱癌EJ细胞株CD44v6表达的影响

目的：明确GM－CSF对EJ细胞增殖及对CD44v6表达的影响。方法：MTT法检测GM－CSF和IFN对EJ细胞增殖的影响，免疫细胞化学法观察GM－CSF对CD44v6表达的影响。结果：GM－CSF以不同浓度作用EJ细胞对其增殖无影响，但GM－CSF联用IFN可抑制J细胞增殖，GM－CSF连用IF可降低CD44v6表达。结果：GM－CSF＋IFN可降低CD44v6在EJ细胞中的表达。     

B7—1基因转染小鼠EL—4淋巴瘤细胞的致瘤性研究

目的研究Ｂ７１基因转染小鼠ＥＬ４淋巴瘤细胞的致瘤性，为制备基因转染瘤苗提供实验依据。方法将Ｂ７１基因转染小鼠ＥＬ４淋巴瘤细胞后，用Ｇ４１８选择和克隆的方法获得高表达Ｂ７１分子的ＥＬ４Ｂ７１＋细胞，然后进行小鼠的体内致瘤试验。结果ＥＬ４Ｂ７１＋细胞接种小鼠后，与野生型ＥＬ４（ＥＬ４Ｗｔ）相比，肿瘤结节形成时间和荷瘤小鼠存活时间明显延长，ＥＬ４Ｂ７１＋细胞协同ＩＬ２接种小鼠后，效果更加显著。结论Ｂ７１基因转染小鼠ＥＬ４淋巴瘤细胞的致瘤性比野生型ＥＬ４（ＥＬ４Ｗｔ）低。     

共刺激信号B7—1表达对小鼠肿瘤细胞生长和转移的影响

为Ｂ７１分子基因在肿瘤免疫基因治疗中的应用提供实验依据。方法通过逆转录病毒介导的基因转移技术，将Ｂ７１ｃＤＮＡ导入具有不同免疫原性的小鼠肿瘤细胞获得表达，并观察转基因细胞在纯系小鼠体内生长和转移的改变。结果由于Ｂ７－１基因的转导表达，使具有免疫原性的ＥＬ４Ｔ淋巴瘤细胞致瘤性丧失；使非免疫原性的Ｂ１６黑色素瘤、Ｐ８１５肥大细胞瘤和ＭＡ８９１乳腺癌细胞的致瘤性减弱；使Ｂ１６细胞的实验性转移和ＭＡ８９１细胞的自发肺转移能力降低。通过转导Ｂ７－１基因的Ｂ１６细胞的免疫接种，可使再次接种的亲本Ｂ１６细胞的致瘤性减弱：但对已生长的亲本Ｂ１６细胞影响不明显。结论Ｂ７１基因导入不同的肿瘤细胞后，可引起机体产生不同程度抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞在体内的生长和转移能力丧失或减弱，这种反应的强弱与肿瘤细胞本身的特性有关。     

利用CHO（dhfr^—）细胞高效表达GM—CSF／Feγ2^—融合蛋白

目的 利用二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO（dhfr-)高效表达融合蛋白GM－CSF／Feγ2^-。方法 利用脂质体基因转染技术,把含有融合基因GM－CSF／Feγ2^-的真核表达质粒pRc/CMV2/GM-CSF/Feγ2^-和含有二氢叶酸还原酶基因的真核表达质粒pSV2-dhfr共转洒二氢叶酸还原酶缺陷型细胞CHO（dhfr-)中。用G418和撤除H、T（次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷)双筛选,获得dhfr neo 双表型阳性的细胞克隆。取表达产量最高的克隆进行亚克隆,并行MTX加压筛选,以提高表达量。用RT－PCR、ELISA和Western blot对表达产物进行鉴定并行MTT法检测表达蛋白的生物学活性。结果 成功地表达出了具有GM－CSF生物学活性的融合蛋白GM－CSF／Feγ2^-。结论 该方法可行,表达量达到15μg/ml。     

趋化素样因子（CKLF1）对骨髓细胞增殖活性的研究

目的 研究趋化素样因子1（CKLF1）对造血功能的调节作用。方法 利用MTT法,检测CKLF1真核细胞表达载体转染上清在液体培养基中,对人低密度骨髓细胞和小鼠骨髓细胞的增殖调控作用;并在兰固体培养基中,观察其对人低密度骨髓细胞集落形成的刺激作用。结果 COS－7细胞表达的CKLF1能明显促进人和小鼠骨髓细胞的增殖,并能促进人骨髓细胞的集落形成,与GM－CSF有协同刺激作用。结论 CKLF1能促进人和小鼠骨髓造血干／祖细胞的增殖和分化。     

GM—CSF基因转导的肿瘤疫苗研究

目的：观察ＧＭ－ＣＳＦ基因转导的肿瘤细胞免疫小鼠的抗肿瘤效果。方法：用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的表达质粒导入ＲＭＡ淋巴瘤细胞,经Ｇ４１８筛选后,将ＧＭ－ＣＳＦ高表达克隆（ＲＭＡ－ＧＭ）细胞皮下接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠,观察成瘤性,以及经丝裂霉素－Ｃ处理灭活的ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠,观察抗肿瘤作用。结果：ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠及亲代肿瘤细胞攻击后与对照组相比,肿瘤生长速度减慢,小鼠生存期明显延长     

一株IL—11 cDNA转染的成纤维细胞体外促造血活性的鉴定

目的：为了探讨ＩＬ－１１基因修饰成纤维细胞的体外促造血活性及其在造血系统基因治疗中的应用前景。方法：将含ＩＬ－１１ ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体转染小鼠成纤维细胞系ＮＩＨ－３Ｔ３细胞，获得了高表达ＩＬ－１１的亚克隆１Ｅ７，通过造血祖细胞集落形成实验及细胞增殖实验对１Ｅ７在体外的促造血活性做了初步的鉴定。     

胰十二指肠同源盒基因-1逆转录病毒表达载体的构建及其在肝干细胞中的稳定表达

目的:通过克隆胰十二指肠同源盒基因-1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1),构建表达PDX-1的逆转录病毒表达载体和稳定表达PDX-1的肝原始细胞系(liver epithelial progenitor cells,LEPCs),以研究肝干细胞向胰腺细胞的转分化潜能.方法:通过PCR方法克隆PDX-1基因全长,将其构建到pMSCVpuro逆转录病毒载体中获得pMSCV PDX-1 puro载体.将该载体导入Phoenix包装细胞系,进而采用乒乓转染的方法感染包装细胞PT67,获得高滴度稳定产毒的PT67细胞系.结果:成功构建了pMSCV PDX-1 puro载体,并转染PT67细胞.利用PT67细胞系产生的病毒上清可以高效的感染体外培养的肝干细胞LEPCs,获得稳定表达PDX-1基因的LEPCs(LEPCs PDX-1).结论:PDX-1逆转录病毒表达载体的成功构建和稳定表达PDX-1的肝干细胞系的获得为研究LEPCs向胰腺细胞的转分化奠定了基础.     

小鼠造血干细胞因子基因克隆及在 C H O 细胞中的表达

目的： 克隆造血干细胞因子（ Ｓ Ｃ Ｆ）并在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达。方法： 采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法从ｐ Ｒ Ｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ（含 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ）中钓取 Ｓ Ｃ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 膜外段活性区,克隆入真核表达载体ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３,转染入 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞;用 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 方法检测 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。结果：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 的 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞可表达 Ｓ Ｃ Ｆｍ Ｒ Ｎ Ａ,其细胞培养上清可协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ刺激骨髓细胞形成集落数比 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 单独作用高 ２ 倍,转染外源基因对细胞周期没有明显影响。结论：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达,转染细胞上清协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 刺激骨髓细胞集落的形成,而本身对集落的形成没有影响。     

内皮细胞对小鼠粒系、红系和巨核系造血的调控作用

目的 了解内皮细胞对小鼠粒系、红系和巨核和造血功能的影响。为进一步研究血发生及其调控提供理论依据。方法 取剖腹产术后12小时以内的人脐静脉内皮细胞,按Jaffe法进行培养,建立内皮细胞体外细胞体外培养模型。而后收集原代培养的内皮细胞上清液,应用造血祖细胞体外培养方法进行体外粒-单系祖细胞克隆形成胞克隆形成单位（CFU-MK）单固体培养。结果 在有内皮细胞上清液存在的各培养体系中,集落形成良好,而在同样培养条件下,在无内皮细胞上清液存在的体系中,需加入外源性的GM-CSF、EPO和IL-3才能表现出对粒系、红系和巨核系造血的刺激作用。结论 （1）内皮细胞能够通过分泌造血生长因子,支持各系祖细胞的增殖与分化;（2）内皮细胞上清液可作为标准的生长因子来源,用于体外干细胞的扩增和某些血液病的治疗;（3）内皮细胞和造血干细胞/祖细胞的相互作用在体内的造血调控中也可能起了重要作用;（4）在内皮细胞上清液中可能含有尚未能证明的其他造血生长因子,这些因子单独或协同地发挥作用。支持了各系祖细胞的增殖。     

LacZ基因在哺乳动物细胞中的稳定表达及其检测方法

目的：构建含有LacZ标记基因的真核表达载体和稳定表达LacZ的转基因细胞，并建立简易有效的检测方法。方法：采用脂质体转染法将装有LacZ基因的真核表达载体pcDNA3导入鼠成纤维细胞L929，G418筛选LacZ基因稳定表达细胞株，并应用超声波破碎和贴壁细胞悬浮培养的方法来检测转基因细胞的转染率及目的蛋白的表宕。结果：成功构建了稳定表达LacZ基因的转基因细胞，超声波破碎后其上清与β－半乳糖苷酶（LacZ）的底物X－gal反应显兰色；辅有固体琼脂粉的平皿中细胞培养至第4天开始显兰色，并随时间的延长，比率增加，最终可高达100％。结论：LacZ基因在哺乳动物细胞中可稳定表达，建立的检测方法具有简单及重复性好的特点。