6-OHDA诱导PD大鼠黑质神经细胞凋亡的观察

目的 探讨帕金森病发病过程中黑质神经元的缺失形式。方法 将6-OHDA立体定向微量注射于右侧内侧前脑柬(MFB)制备PD大鼠模型，观察大鼠的行为改变，并运用特殊染色，DNA原位末端标记技术检测黑质内多巴胺(DA)神经元凋亡的发生及其变化规律。结果 成功复制出符合临床特点的PD大鼠模型，且旋转行为与黑质区神经元数目呈反变关系。损伤侧黑质DA神经元存在着细胞凋亡。以术后两周最明显。结论 6-OHDA诱导的PD大鼠SNc中存在以凋亡为主的死亡方式。细胞凋亡在PD发病中可能起关键作用。     

"双固一通"针法对帕金森病模型大鼠黑质多巴胺能神经元保护作用的实验研究

目的探询“双固一通”针法对帕金森病模型大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用。方法将Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组、假手术对照组、模型组、双固一通组等4组,每组10只。采用6-OHDA单侧纹状体立体定向微量注射法制备大鼠旋转帕金森病模型。双固一通组在造模成功后取关元、足三里、风府、太冲四穴行电针治疗2周。然后,取各组动物中脑,采用流式细胞技术检测各组大鼠黑质多巴胺能神经元教量和细胞凋亡率。结果双固一通组毁损侧黑质TH阳性细胞百分比显著高于模型组（P〈0．01）,黑质细胞凋亡率显著低于模型组（P〈0．01）。结论双固一通针法能提高帕金森病模型大鼠黑质多巴胺能神经元教量,降低凋亡率。对多巴胺能神经元具有明显保护作用。     

淫羊藿苷对6- 羟基多巴胺诱导的PC12 细胞损伤的保护机制

目的：探讨淫羊藿苷（icariin,ICA）是否通过Nrf2 通路对6- 羟基多巴胺（6-hydroxydopamin,6-OHDA）诱导的PC12 细胞损伤的保护作用,从而为ICA 用于抗帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的应用研究提供基础药理学依据。方法：细胞实验：选用PC12 细胞制备神经元损伤模型,实验随机分为空白组、ICA（0.5 μmol·L-1）组、6-OHDA+ICA（0.005 μmol·L-1）组、6-OHDA+ICA（0.05 μmol·L-1）组、6-OHDA+ICA（0.5 μmol·L-1）组。细胞按分组剂量给予ICA 处理12 小时后再加入6-OHDA（100 μmol·L-1）,采用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测细胞胞核中Nrf2 的表达,及Keap1,HO-1,Gclc,Nqo1,Caspase 3,Bax,Bcl-2,Cytochrome C 的表达,采用脂质体转染,沉默Nrf2,再次观察以上蛋白的表达,从而进一步证实ICA 有可能通过Nrf2 通路进行保护。结果：Western Blot 结果提示：与空白组相比,模型组的Nrf2,Keap1,Gclc,Nqo1 的表达明显升高,相对的凋亡基因Caspase 3,Bax,Bcl-2,Cytochrome C 也随之升高,随着ICA 浓度的升高,核蛋白Nrf2 的表达升高,且HO-1,NQO1,Keap1,GCLC 的表达也随之升高,而对应的凋亡基因蛋白表达降低。结论：ICA 可能通过Nrf2 通路对6-OHDA 诱导的PC12 细胞损伤的保护作用,后期通过沉默Nrf2基因,进一步探讨ICA 是否通过Nrf2 通路对6-OHDA 诱导的PC12 细胞损伤的保护作用。     

noggin对帕金森病大鼠黑质神经元的保护作用

目的  观察noggin对6-羟基多巴胺(6-OHDA)致帕金森病模型大鼠神经行为的影响及其对黑质神经元的保护作用。方法  随机将60只雄性SD大鼠,分为正常对照组、模型组和模型治疗组。采用脑立体定位右侧纹状体内注射6-OHDA构建帕金森病(PD)模型,模型治疗组纹状体内注射noggin,正常对照组与模型组同时给予等量生理盐水,术后7d于行为检测完毕后行尼氏染色、TH、TUNEL与GFAP免疫组化染色,光镜下观察3组大鼠黑质多巴胺能神经元、凋亡神经元与星形胶质细胞的形态变化并进行计量分析,电镜下观察黑质神经元超微结构变化。结果    模型治疗组大鼠的旋转次数较模型组明显改善(P<0.05),TH阳性神经元较模型组增多,凋亡神经元显著减少(P<0.05),GFAP阳性神经元较模型组减少,胞浆内GFAP阳性产物的平均光密度值亦明显降低(P<0.05);TH、TUNEL与GFAP阳性神经元主要位于黑质致密部;电镜下对照组黑质神经元结构清晰,胞核形态规则,核膜光滑、完整,染色质分布均匀;胞浆电子密度中等,细胞器丰富;模型组黑质神经元胞核皱缩,核膜凸凹不整、异染色质减少,胞浆内大量线粒体嵴断裂消失,粗面内质网扩张;模型治疗组黑质神经元细胞核形态规则,部分线粒体肿胀,细胞器丰富。结论  noggin可改善PD模型大鼠的行为能力、使凋亡神经元及反应性星形胶质细胞数目减少,这些变化可能与noggin能促进黑质内部分神经元再生有关。     

自噬参与6-羟基多巴胺诱导多巴胺能神经元死亡的实验观察

目的 观察自噬在6-9基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的大鼠多巴胺能神经元中的激活,初步探讨自噬在多巴胺能神经元死亡中的作用.方法 用脑立体定位黑质致密部给药法建立6-OHDA介导帕金森病大鼠模型,用透射电镜法观察多巴胺能神经元中自噬激活,免疫荧光法检测6-OHDA对多巴胺能神经元中LC3表达的影响.结果 透射电镜显示,6-OHDA注射后6h至24h,被损伤大鼠黑质致密部神经元内溶酶体被激活,自噬小体形成.免疫荧光法显示模型大鼠与对照组相比,黑质多巴胺能神经元受损,TH阳性细胞明显减少,LC3表达量显著增加.结论 自噬参与6-OHDA介导的多巴胺能神经元死亡过程.     

Survivin在帕金森病大鼠中对神经元凋亡的调控作用

目的：研究生存素（Survivin）在大鼠帕金森病（Parkinson’s disease,PD）模型中对黑质神经元凋亡的调控作用。方法：成年健康雄性SD大鼠,随机分为4组,对照组（n=8）;PD模型组（n=8）;PD模型+腺病毒空载体组（n=8）;PD模型+Survivin治疗组（n=8）。造模成功1周后,对照组和PD模型组不予以处理,PD模型+腺病毒空载体组在大鼠纹状体的同一坐标点注射腺病毒空载体,PD模型+Survivin治疗组在大鼠纹状体的同一坐标点注射携带Survivin基因腺病毒,治疗结束后每周对大鼠颈部皮下注射阿扑吗啡（Apomorphine,APO）进行行为学评价,行为学上出现差异后收集各组大鼠脑组织标本。分别运用TUNEL法观察黑质神经元凋亡情况,qRT-PCR检测Caspase 3和Caspase 9的mRNA表达情况水平,Western blot检测Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 9的蛋白水平,评价Survivin对神经元凋亡的调控作用。结果：治疗结束后第3周,PD模型+Survivin治疗组与同期PD模型组及PD模型+腺病毒空载体组比较,大鼠旋转圈数减少（F=22.315,P=0.000,P=0.000）;TUNEL结果显示,与对照组比较,PD模型组及PD模型+腺病毒空载体组大鼠脑黑质神经元细胞凋亡明显;与PD模型组及PD模型+腺病毒空载体组比较,PD模型+Survivin治疗组黑质神经元细胞凋亡程度明显减轻（F=38.912,P=0.000,P=0.000）;此外,qRT-PCR和Western blot的结果显示,与PD模型组及PD模型+腺病毒空载体组比较,Survivin能够显著抑制神经元细胞中Caspase 3/9在mRNA水平（F=338.429,P=0.000,P=0.000;F=283.352,P=0.000,P=0.000）和Cleaved-Caspase 3/9在蛋白水平（F=640.262,P=0.000,P=0.000;F=354.210,P=0.000,P=0.000）的表达。结论：Survivin能够通过抑制PD大鼠脑组织中Caspase 3和Caspase 9的表达,减少脑内黑质神经元的凋亡,进而达到对脑黑质退行性病变的治疗作用,减轻PD相关症状     

JNK通路可能介导MPTP诱导的黑质神经元凋亡

目的 探讨氧化应激激活的c-jun NH2-terminal kinase(JNK)细胞凋亡通路在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)诱导帕金森病(PD)小鼠黑质神经元凋亡中的可能作用。方法 采用MPTP制备PD小鼠模型，应用生化技术检测黑质区域谷胱甘肽(GSH)浓度及超氧化物歧化酶(SOD)活力，尼氏体染色和酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色观察黑质神经元的损害情况，原位缺口末端标记(TUNEL)染色和活化型Caspase 3免疫组织化学染色观察黑质神经元的凋亡情况，同时采用蛋白兔疫印迹法检测磷酸化JNK及磷酸化c-jun蛋白表达水平。结果 MPTP诱导的PD小鼠黑质区域GSH浓度明显降低，SOD活力明显升高，黑质致密带尼氏体阳性神经元和TH阳性神经元显著脱失，磷酸化JNK及磷酸化c-jun蛋白表达水平上升，同时活化型Caspase 3表达阳性细胞增多，黑质神经元TUNEL染色的阳性率增高。结论 MPTP可诱导小鼠黑质神经元凋亡，机制与增强氧化应激并激活JNK细胞凋亡通路有关。     

缺血性脑卒中与神经元凋亡

缺血性脑卒中导致的脑神经元死亡可以分为坏死和凋亡两种.神经元坏死是不可逆的,而凋亡过程由于存在着大量正性和负性的可调控信号,因而可以作为脑缺血治疗的潜在靶点.大量研究证实,缺血性脑损伤中神经细胞凋亡是主要由Caspase参与的级联反应,包括死亡受体通路和线粒体通路两类.Caspase介导的细胞凋亡一般发生在缺血核心周边的阴影区域.Caspase的激活主要受Bcl-2家族蛋白以及由Bcl-2蛋白调控的线粒体释放的蛋白内容物所调节.由线粒体释放的与凋亡相关的蛋白包括细胞色素C、procaspase-9和凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1);虽然凋亡诱导因子(AIF)也是由线粒体释放,但其参与非Caspase介导的神经元凋亡.非Caspase介导的凋亡也发生在脑缺血的病理过程中,但不发挥主要作用.在从脑缺血发生到脑细胞凋亡过程中,能量代谢障碍是最先发生的机能改变,胞内钙稳态失调被认为是最为关键的一环,其它改变还包括自由基和兴奋性氨基酸的增加等.对神经元凋亡的深入理解是治疗缺血性脑卒中和寻找抗脑缺血药物的重要理论基础.     

高压氧结合抗震颗粒对帕金森病大鼠黑质细胞凋亡表达的影响

目的 研究高压氧(HBO)结合抗震颗粒对实验性帕金森病(PD)大鼠黑质细胞凋亡表达的影响.方法 通过右侧中脑黑质腹侧被盖区注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)的方法建立PD模型.免疫组化法测定治疗后假手术组、模型组及HBO结合抗震颗粒组PD大鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元、胶原纤维酸性蛋白(GFAP)及Bcl-2、...     

依达拉奉、神经节苷酯对帕金森病模型大鼠的神经保护作用

目的 探讨依达拉奉(edaravone,Ed)、神经节苷酯(GW1)对帕金森病(PD)大鼠模型的神经保护作用.方法 采用立体定向一侧黑质致密部(SNC)、中脑腹侧被盖部(VTA)两点注射6-OHDA的方法 ,建立单侧PD大鼠动物模型.将老年大鼠分为正常组、生理盐水组(NS)、帕金森病模型组(PD)、PD+GM1组、PD+Ed组、PD+GM1+Ed组.14d后观察大鼠阿朴吗啡(APO)诱导的行为学改变及黑质多巴胺能神经元凋亡的情况.结果 正常组、NS组APO未诱导出大鼠旋行为,SNC未见细胞凋亡.PD各组APO诱导的旋转实验＞7 r/min,旋转次数(次)PD+GM1+Ed组(8.0±0.3)＜PD+Ed组(12.0±0.6)＜PD+GM1组(17.0±1.0)＜PD组(23.0±1.3)(P＜0.01);6-OHDA可诱导细胞凋亡,毁损侧SNC细胞凋亡数(个)PD+GM1+Ed组(27.63±2.38)＜PD+Ed组(38.42±3.54)＜PD+GM1组(49.36±3.12)＜PD组(62.61±4.03)(P＜0.01).结论 6-OHDA可导致大鼠行为改变,诱导SNC神经细胞凋亡,GM1、依达拉奉降低了这种损害,依达拉奉作用强于GM1,联合治疗作用最佳.     

选择性毁损帕金森病大鼠模型的建立

目的探讨提高 6 -羟基多巴胺 (6 -OHDA)帕金森病 (PD)大鼠模型成功率的方法 ,并对模型进行评价。方法 :取SD大鼠 90只 ,将 6 -OHDA立体定向微量注射于左侧黑质区及黑质纹状体通路 ,观察大鼠行为及黑质细胞形态学变化。结果 :90只大鼠中经阿朴吗啡诱导后有 6 4只 (占 71.1% )恒定转向右侧且结果稳定 ,旋转圈数 >2 10r/ 30min ,被视为成功PD大鼠模型 ;免疫组化观察发现注射侧黑质区多巴能神经元 (NDN)较对侧明显减少 ,电镜观察发现其普遍存在凋亡及坏死样改变。结论 :用 6 -OHDA选择性损毁NDN可较快建立稳定的类似于人类中晚期PD行为病理的大鼠模型 ,但在病理和行为学等方面同自然PD病人仍有较多差异     

多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析

目的 研究帕金森病（PD）多巴胺能神经元的死亡机制,方法在免疫组织化学基础上,采用流式细胞仪,电泳及电镜技术观察不同浓度多巴胺（DA）诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的超微结构及生化改变。结果 适当浓度DA可诱导PC12细胞凋亡,早期表现为线粒体结构及功能的改变并有抗凋亡蛋白bcl-2的达,后期电镜下可见亡特征性核结构改变及典型的DNA阶梯状电泳带,结论 细胞凋亡参与了PD的病变过程,线粒体在早期细胞凋亡中起着重要的调节作用。     

脑缺血后神经元凋亡信号通路的研究进展

细胞凋亡是受细胞内活性基因、酶和信号转导途径调控的一个“瀑布式”过程。凋亡的发生也是一个复杂的过程，有多条通路可以分别独立地引发细胞凋亡。根据关键性效应蛋白酶的不同，凋亡可分为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）依赖性和凋亡诱导因子（apoptosisinducingfactor，AIF）依赖性两种途径。目前至少有3种caspase依赖和1条AIF依赖的神经元凋亡信号通路：①细胞表面死亡受体介导的caspase-8依赖的外源性激活途径；②线粒体介导的caspase-9依赖的内源性激活途径；③内质网介导的caspase-12依赖的内源性激活途径。④线粒体介导的AIF依赖的内源性激活途径。现就脑缺血后神经元凋亡信号通路的研究进展进行综述。     

FK506对癫痫大鼠凋亡细胞数及MMP和AIF表达的影响

目的 观察免疫抑制剂他克莫司（FK506）对癫痫大鼠海马凋亡神经元、线粒体膜电位、凋亡诱导因子(AIF)表达的影响。方法 随机将108只成年健康雄性Wistar大鼠分为对照组、癫痫组和脑保护组,每组36只,建立氯化锂-匹鲁卡品癫痫模型。脑保护组在注射匹鲁卡品之前24、1h分别腹腔注射FK506,对照组注射等体积生理盐水。应用TUNEL技术检测凋亡细胞,流式细胞仪测定线粒体内罗丹明123的荧光强度和线粒体的大小,免疫组化法检测AIF的表达。结果 与对照组相比,癫痫组海马神经元凋亡阳性百分比、AIF的表达量显著增高(P＜0.05）,线粒体膜电位显著降低(P＜0.05）,应用FK506后,神经元凋亡阳性百分比、AIF的表达量明显降低,线粒体膜电位显著升高(P＞0.05)。结论 FK506可逆转线粒体膜电位的改变,稳定细胞膜电位,抑制神经元的凋亡,具有脑保护作用。     

疏筋解毒方对PD大鼠黑质纹状体Bcl－2／BaxmRNA表达的影响

目的观察疏筋解毒方对帕金森病（PD）大鼠中脑黑质Bcl-2mRNA／BaxmRNA表达的影响,研究其对PD治疗作用的可能机制。方法采用6-羟多巴胺（6-OHDA）建立PD大鼠模型,应用原位杂交分子生物学技术,检测PD大鼠黑质纹状体Bcl－2mRNA／BaxmRNA分布及表达。结果疏筋解毒方有提高PD大鼠中脑Bcl-2mRNA／BaxmRNA分布及表达的趋势。结论疏筋解毒方可能在基因调控层面。通过提高Bcl-2mRNA／BaxmRNA比率,达到抑制PD大鼠中脑多巴胺能神经元凋亡。     

6－羟基多巴胺作用于PC12细胞中的信号转导通路

以6-羟基多巴胺（6-OHDA）作用于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PCI2细胞）是目前公认的帕金森病体外细胞模型。最近又发现在人体内存在内源性的6-OHDA，且与帕金森病的发病有关。6-OHDA可致PC12细胞凋亡，在此过程中有多种信号转导通路参与。弄清6-OHDA致PC12细胞凋亡中的信号转导通路将有助于弄清帕金森病的发病机制及指导临床上帕金森病的治疗。     

高压氧结合抗震颗粒影响帕金森病大鼠黑质细胞凋亡表达

目的 研究高压氧(HBO)结合抗震颗粒对实验性帕金森病(PD)大鼠黑质细胞凋亡表达的影响。方法 通过右侧中脑腹侧被盖区注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)的方法建立PD模型。免疫组化法测定治疗后假手术组、模型组及HBO结合抗震颗粒组PD大鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）及Bc1-2、Bax蛋白的表达。结果 PD模型组进行HBO结合抗震颗粒治疗后TH阳性细胞数量及Bcl-2蛋白表达均明显升高（P< 0.05)、GFAP平均光密度及Bax蛋白的表达明显降低（P< 0.05)。 结论 HBO结合抗震颗粒能明显抑制黑质神经元细胞凋亡的表达,对PD大鼠有保护性治疗作用。     

Nesfatin-1对帕金森病模型多巴胺能神经元的保护作用及其机制研究

【立论依据】 帕金森病(PD)是一种严重危害中老年人健康的神经退行性疾病,但至今尚无有效的药物或方法能阻止或逆转PD的病情发展。Nesfatin-1是2006年发现的,由82个氨基酸组成的能够抑制摄食的脑肠肽。研究发现nesfatin-1可通过抗凋亡及抗炎机制发挥神经保护作用,但是nesfatin-1能否对多巴胺(DA)能神经元发挥保护作用尚不清楚。本室前期研究证实nesfatin-1能够改变DA能神经元的放电频率,因此,本研究拟在鱼藤酮制备的PD模型上,观察nesfatin-1对DA能神经元的保护作用,并探讨其机制。 【设计思路】 鱼藤酮是一种制备PD模型的环境毒素,是线粒体复合物I的特异性抑制剂,通过损伤线粒体途径导致细胞凋亡。因此本实验拟在鱼藤酮诱导的PD细胞和大鼠模型上,观察nesfatin-1对鱼藤酮诱导的线粒体功能损伤及其介导的细胞凋亡的影响,并进一步研究其分子机制,阐明nesfatin-1可能通过Gs-cAMP-PKA通路影响Bad蛋白的磷酸化水平从而发挥其保护线粒体及抗凋亡的作用。 【实验内容】 在鱼藤酮制备的PD细胞模型上,应用MTT法、流式细胞仪技术、激光共聚焦显微镜等方法,检测nesfatin-1对鱼藤酮所致的细胞存活率、线粒体复合物I的活性、线粒体跨膜电位差、活性氧、PKA蛋白水平、Bad蛋白磷酸化、线粒体细胞色素C的释放、caspase-3活性及细胞凋亡形态学变化的影响。此外,在鱼藤酮制备的PD大鼠模型上,应用免疫组织化学,蛋白质印迹、TUNEL染色等方法进一步研究nesfatin-1对黑质DA能神经元的保护作用。 【材料】 MTT、罗丹明123、H2DCFDA、PKA抗体、磷酸化Bad蛋白抗体、TH抗体(Sigma公司),细胞色素C单克隆抗体(Clontech公司),Caspase-3抗体凋亡试剂盒(BD公司),Hoechst33258(Beyotime公司),TUNEL试剂盒(Roche公司)。 【可行性】 前期研究已证实500 nmol/L鱼藤酮处理MES23.5细胞24 h后,细胞存活率降低,线粒体跨膜电位差降低,nesfatin-1预孵育能拮抗鱼藤酮诱发的改变。实验所在学科为国家生理学重点(培育)学科,具备完成实验所需实验技术和设备。 【创新性】 证实nesfatin-1对DA能神经元的损伤具有保护作用,并阐明了介导的细胞信号转导通路和分子机制,为研制新的预防和治疗PD的药物提供一定的实验依据。     

帕金森病模型大鼠黑质磁共振ESWAN序列R2*值与酪氨酸羟化酶表达相关性的研究

目的应用ESWAN序列测量正常大鼠和帕金森病（PD）模型大鼠脑黑质R2*值,探讨R2*值与多巴胺能神经元标志酶酪氨酸羟化酶（TH）阳性面积的相关性。方法将60只雄性SD大鼠,随机抽取20只为对照组,剩余40只大鼠通过向左侧黑质输注6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导PD模型,于造模后第15天进行旋转实验以验证模型,最终造模成功23只,作为模型组;期间每隔10d对两组大鼠的一般情况进行观察,第45天对两组大鼠进行旋转实验、MRI测量黑质R2*值及TH免疫组化染色。结果模型组大鼠损伤侧黑质R2*值较对照组显著升高（P＜0.05）;模型组大鼠损伤侧多巴胺能神经元TH的表达较对照组减低,差异有统计学意义（P＜0.01）;模型组、对照组大鼠黑质R2*值与TH阳性面积之间呈负相关。结论ESWAN序列可以成功测量PD大鼠黑质R2*值,对早期评价PD黑质多巴胺能神经元损伤情况有指导作用。     

帕金森病模型黑质Caspase 3的表达

目的研究帕金森病(PD)动物模型黑质Caspase 3的表达,以探讨帕金森病的凋亡机制。方法40只SD大鼠随机分为两组,PD组:立体定向注入6-羟多巴,术后1周腹腔注入阿朴吗啡观察30 min大鼠旋转的次数,连续至第四周每分钟大于6次者为成功的帕金森氏病模型;正常对照组:立体定向注入黑质抗坏血酸生理盐水。处死后制作快速冰冻切片用免疫组化检测Caspase 3阳性细胞数,用原位杂交法检测Caspase 3 mRNA的阳性细胞数。结果免疫组化显示PD组术侧黑质Caspase 3阳性神经元数量较正常对照组明显升高,原位杂交显示PD组术侧黑质Caspase 3 mRNA阳性神经元数量较正常对照组明显升高。结论PD动物模型Caspase 3的表达显著提高,提示Caspase 3参与PD的发病机制。