绿茶多酚抑制晚期糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的 本研究观察绿茶多酚对晚期糖基化终产物(AGEs)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。方法 体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较．将不同剂量的绿茶多酚与AGEs共同作用并设立对照组进行比较，采用非放射性的MTS／PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。结果 与对照组相比，晚期糖基化终产物对血管平滑肌细胞增殖具有明显的刺激作用。在晚期糖基化终产物刺激下．绿茶多酚可明显抑制血管平滑肌细胞的生长。AGEs对p44／42MAPK磷酸化蛋白表达有显著的增强作用，此作用可被绿茶多酚抑制。结论 本研究提示绿茶多酚可抑制晚期糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖及p44／p42 MAPK磷酸化蛋白的表达。     

绿茶多酚抑制LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖

观察绿茶多酚对低密度脂蛋白(LDL)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖和p44/42MAPK表达的影响。体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,在LDL(100 μg/ml)刺激时,应用不同剂量的绿茶多酚作用24 h后,采用MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。应用流式细胞术测定细胞周期,p44/42磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印迹法测定MAPK蛋白表达。与未经LDL处理的平滑肌细胞相比,LDL可以明显刺激大鼠血管平滑肌细胞的增殖,绿茶多酚对LDL刺激下的大鼠血管平滑肌细胞增殖具有明显的抑制作用(P<0.05),并呈现剂量依赖性。流式细胞术检测表明,绿茶多酚可以使LDL刺激下的大鼠血管平滑肌细胞大部分处于G0/G1期,与LDL组相比有明显差异(P<0.05)。LDL对磷酸化p44/42MAPK蛋白表达有显著的增强作用,此作用可被绿茶多酚抑制。绿茶多酚可明显抑制LDL刺激下的大鼠血管平滑肌细胞增殖和磷酸化p44/42丝裂素活化蛋白激酶的表达。     

重组平颏海蛇磷脂酶A2抑制晚期糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的观察重组平颏海蛇磷脂酶A2(rPLA2)对晚期糖基化终产物(AGEs)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。方法体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。结果与对照组相比,AGEs对VSM-Cs增殖具有明显的刺激作用(P<0.05)。在AGEs刺激下,rPLA2可明显抑制VSMCs的生长(0.753±0.098 vs. 1.100±0.226, P<0.05)。结论rPLA2可抑制晚期糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖。     

姜黄素对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠平滑肌细胞Syndecan-4蛋白及p44/42丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

观察姜黄素对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的离体大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖和Syndecan-4蛋白及p44/42丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）表达的影响。方法分别用20 ng/ml TNF-α、20 μmol/L姜黄素、20 ng/ml TNF-α联合20 μmol/L姜黄素作用于体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞24 h,并设对照组进行比较。MTS/PMS法检测VSMCs的增殖状态,Westernblot蛋白免疫印迹法测定VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。结果（1）细胞增殖结果经统计分析,与对照组比较,TNF-α能显著刺激大鼠VSMCs的增殖（P<0.01）,而单独应用姜黄素对大鼠VSMCs增殖无明显作用（P>0.05）。TNF-α联合姜黄素组与 TNF-α组比较,大鼠 VSMCs 的增殖受到抑制（P<0.01）;（2）统计分析蛋白表达结果,与对照组比较,TNF-α组能显著上调大鼠 VSMCs 中 Syndecan-4 蛋白及磷酸化 p44/42MAPK 的表达（P<0.01）,而单独应用姜黄素对大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达无明显作用（P>0.05）。与TNF-α组比较,TNF-α联合姜黄素组中大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达显著下调（P<0.01）。结论 一定剂量的姜黄素可显著抑制TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。     

姜黄素对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠平滑肌细胞Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的观察姜黄素对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Syndecan-4蛋白及p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法分别用20 ng/ml TNF-α、20μmol/L姜黄素、20 ng/ml TNF-α联合20μmol/L姜黄素作用于体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞24 h,MTS/PMS法检测VSMCs的增殖状态,Western blot蛋白免疫印迹法分别测定VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。结果(1)统计分析表明,与对照组比较,TNF-α能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.01),单独应用姜黄素对大鼠VSMCs增殖无显著作用(P>0.05)。与TNF-α组比较,姜黄素能显著抑制TNF-α所诱导的大鼠VSMCs的增殖(P<0.01);(2)统计分析表明,与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达(P<0.01),TNF-α的这一作用能被姜黄素所抑制(P<0.01),单独应用姜黄素对大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达无显著作用(P>0.05)。结论一定剂量的姜黄素可显著抑制TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。     

PPARα对糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞的作用

目的:观察氯贝特对糖基化终产物(AGEs)刺激下的离体大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用以及对过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)基因及蛋白表达水平的影响,探讨PPARα在AGEs诱导VSMCs增殖中的作用。方法:体外培养大鼠VSMCs,应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较,采用MTT法观察不同浓度的AGEs对VSMCs增殖的影响及氯贝特与AGEs共孵育对VSMCs增殖的干预作用,并用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测PPARα的mRNA表达,Western blotting分析PPARα的蛋白表达。结果:AGEs增加DNA的合成促进平滑肌细胞的增殖,氯贝特激活PPARα,使PPARα的表达量增加,抑制AGEs诱导的细胞增殖和DNA合成。结论:AGEs诱导平滑肌细胞增殖与平滑肌细胞PPARα表达相关,PPARα表达下调可能是产生糖尿病动脉粥样硬化的重要原因之一。     

阿司匹林对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠平滑肌细胞syndecan-4蛋白及p44/42丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的观察阿司匹林(ASA)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,分别用20 ng/mL TNF-α、1 mmol/L ASA、2 mmol/L ASA、20 ng/mL TNF-α+1 mmol/L ASA、20 ng/mL TNF-α+2 mmol/L ASA作用24 h,并设立相关对照组进行比较。采用MTS/PMS法确定VSMCs的增殖状态,Western blot蛋白免疫印迹法测定VSMCs中syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK表达。结果 (1)与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.01),单独应用ASA对大鼠VSMCs的增殖无明显作用(P>0.05)。TNF-α联合ASA组与TNF-α组比较,联用能明显抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖(P<0.01)。(2)与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs中syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达(P<0.01),单独应用ASA对二者的表达无明显作用(P>0.05)。TNF-α联合ASA组与TNF-α组比较,联用可显著降低这两种蛋白的表达水平(P<0.05)。结论一定剂量的ASA可明显抑制TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK蛋白的表达。     

AGEs-RAGE通路阻断对血管平滑肌细胞迁移能力的影响

研究AGEs-RAGE通路阻断对糖尿病大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移能力的影响并探讨其可能机制。以晚期糖基化终产物受体(RAGE)抗体预孵VSMCs后,再用晚期糖基化终产物(AGEs)刺激VSMCs细胞,Transwell法检测VSMCs迁移能力变化,MTT法及ELISA分别检测VSMCs增殖及p27蛋白表达的变化,DCFH法测定VSMCs细胞内活性氧(ROS)水平,RT-PCR法测定NOX1 mRNA表达水平。结果显示:RAGE抗体可以明显抑制AGEs诱导的VSMCs迁移作用(P<0.01),且抑制迁移作用较其抑制增殖作用强,细胞ROS水平降低(P<0.01),NOX1 mRNA表达量下降但P27蛋白表达变化不大。实验结果表明,用RAGE抗体阻断AGEs-RAGE通路可以抑制VSMCs的迁移,其机制可能与其下调NOX1 mRNA表达从而降低细胞内氧化应激水平有关。     

姜黄素通过抑制ERK1/2磷酸化减弱ET-1诱导的大鼠VSMCs增殖

目的观察姜黄素（curcumin）对内皮素-1（ET-1）诱导培养的离体大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖及p44/42丝裂原活化蛋白激酶（p44/42 MAPK,ERK1/2）表达的影响。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs。分别以ET-110-8 mol/L,ET-110-8 mol/L联合浓度为10-6 mol/L、10-5 mol/L、10-4 mol/L的姜黄素作用于体外培养的VSMCs 24 h,采用细胞计数检测VSMCs的增殖,3H-胸腺密啶掺入（3H-TdR）法测定VSMCs的DNA合成,western bolt法检测VSMCs磷酸化ERK1/2的表达。结果与对照组比较,ET-1能显著刺激VSMCs增殖,姜黄素能显著抑制ET-1诱导的VSMCs增殖,且呈剂量依赖关系;ET-1能显著刺激VSMCs磷酸化ERK1/2的表达,该作用可被姜黄素所抑制。结论姜黄素能抑制ET-1刺激的VSMCs的增殖,其作用可能与抑制磷酸化ERK1/2的表达相关。     

晚期糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞增殖影响的实验研究

目的：研究晚期糖基化终产物（Advanced Glycation end Products,AGEs）对体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs）增殖的影响。方法：组织贴块法培养大鼠VSMCs,给予不同浓度AGE-牛血清白蛋白（AGE-BSA）连续处理VSMCs 168 h（7 d）,每24 h采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,绘制细胞生长曲线,计算细胞增殖促进率。结果：80 mg/L终浓度的AGE-BSA在培养72、961、20 h,10、20、40 mg/L终浓度的AGE-BSA在培养96、120、1441、68 h均可显著促进细胞增殖（P〈0.05） 40 mg/L终浓度的AGE-BSA在培养96 h时细胞增殖促进率最大（72.1%）。结论：AGEs具有促进VSMCs增殖作用,这一作用在一定范围内具有剂量依赖性。     

绿茶多酚抑制LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖

The proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is one of the major mechanisms of intimal thickening in atherosclerosis and post-angioplasty restenosis. Elevated plasma levels of low-density lipoprotein (LDL) have been implicated in the pathogenesis of atherosclerotic vascular diseases. The purpose of this study was to determine the effects of green tea polyphenols on the proliferation and p44/42 mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity in rat VSMCs simulated by native LDL. Rat aortic VSMCs were cultured and treated with LDL (100 microg/ml) in the absence or presence of green tea polyphenols, and the cell proliferation was subsequently quantified by non-radioactive MTS/PES assay and the cell cycle analyzed by flow cytometry. The p44/42 MAPK activity was evaluated by immunoblotting using anti-p44/42 phospho-MAPK antibody. Compared with the cells without polyphenol treatment, the proliferation of the VSMCs induced by LDL was dose-dependently inhibited by green tea polyphenols (P<0.05), with more numerous cells in G(0)G(1) phase (P<0.05) as shown by flow cytometry analysis. LDL significantly enhanced the p44/42 MAPK activity, an effect obviously inhibited by green tea polyphenols (at 100 microg/ml). These results suggest that green tea polyphenols can inhibit high levels of LDL-induced proliferation of phosphorylated p44/42 MAPK expression in rat VSMCs. Green tea polyphenols may, therefore, offer vascular protection by inhibiting VSMC growth in response to hypercholesterolemia.     

晚期糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞分泌炎症性趋化因子的影响及机制

目的 观察晚期糖基化终产物(AGE)对血管平滑肌细胞(VSMC)分泌单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白细胞介素8(IL-8)的影响并初步探讨可能的细胞内信号转导机制.方法 分离、培养原代大鼠VSMC并进行鉴定.采用糖基化血清白蛋白(GSA)模拟AGE,观察不同浓度GSA(10、100和500 μg/ml)对VSMC分泌MCP-1和IL-8的影响和时间曲线;并对其进行细胞增殖率校正以消除VSMC数量增加对测定的影响;p38MAPK抑制剂(SB203580)、ERK1/2抑制剂(PD98059)及NF-κB抑制剂(PDTC)、Proteasome抑制剂(MG132)预处理后观察GSA刺激VSMC分泌MCP-1和IL-8水平的改变.结果 与空白对照组相比,100 μg/ml GSA作用24 h VSMC分泌MCP-1(13.01ng/ml±0.12ng/ml比7.02 ng/ml±0.26 ng/ml,P＜0.05)和IL-8(12.6ng/ml±0.86 ng/ml比3.07 ng/ml±0.35ng/ml,P＜0.05)水平最高.经过细胞增殖校正后,GSA仍然能够促进VSMC表达MCP-1和IL-8.MAPK抑制剂和NF-κB抑制剂预处理后发现PDTC(10 μmol/L)、SB203580(5 μmol/L)以及MG132(10 μmol/L)可以抑制GSA刺激VSMC表达MCP-1和IL-8.结论 GSA可以促进VSMC分泌致炎性趋化因子MCP-1和IL-8,这种作用独立于细胞增殖,可能是通过激活细胞内p38MAPK信号转导通路,促进核因子NF-κB的活化而实现.

Abstract：

Objective To investigate the effects of advanced glycation end products (AGEs) on the secretion of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and interleukin-8 (IL-8) in vascular smooth muscle cells (VSMCs) and explore its possible intracellular signaling mechanism. Methods Primary rat VSMCs were isolated and identified. VSMCs were treated with glycation serum albumin (GSA), an important component of AGEs, in series of concentrations and time. The role of MAPK and NF-κB inhibitors was confirmed. The levels of MCP-1 and IL-8 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results VSMCs were treated with GSA at the doses of 10 μg/ml, 100 μg/ml and 500 μg/ml respectively. In comparison with the control group, the levels of MCP-1 ( 13.01 ng/ml ± 0.12 ng/ml vs 7. 02 ng/ml ±0. 26 ng/ml, P＜0.05) and IL-8 (12. 6 ng/ml ±0. 86 ng/ml vs 3. 07 ng/ml ±0.35 ng/ml,P＜0.05) increased in the GSA-treated group, especially at the concentration of 100 μg/ml. After adjustment for cells proliferation, the levels of MCP-1 and IL-8 were still higher in the GSA-treated group.After a pretreatment of PDTC ( 10 μmol/L), SB203580 (5 μmol/L) and MG132 ( 10 μmol/L), the levels of MCP-1 and IL-8 decreased. However, it had no change when pretreated with PD98059 (20 μmol/L).Conclusion GSA promotes the secretion of MCP-1 and IL-8 in VSMCs. Such an effect is not dependent on cellular proliferation. It may be realized through an activation of NF-κB by p38MAPK-sensitive intracellular signaling pathway.     

粘着斑激酶和丝裂原活化蛋白激酶对纤粘连蛋白诱导平滑肌细胞迁移和增殖的影响

目的　研究粘着斑激酶和丝裂原活化蛋白激酶在细胞外基质成分诱导血管平滑肌细胞迁移和增殖中的作用。方法　通过纤粘连蛋白 (FN)诱导培养的平滑肌细胞迁移和增殖 ,以免疫沉淀和Western印迹法检测粘着斑激酶 (FAK)和丝裂原活化蛋白激酶 (p4 2 / 4 4MAPK)及其磷酸化的表达量。将FAK反义寡核苷酸 (ODN)经脂质体转染细胞 ,观察其对FAK和p4 2 / 4 4MAPK磷酸化、细胞迁移以及增殖的影响。结果　不同浓度FN(5、10、2 0、4 0、6 0 μg/ml)在有效诱导平滑肌细胞迁移和增殖时FAK和p4 2 / 4 4MAPK也呈明显表达 ,2 0 μg/mlFN可使其磷酸化处于较高的表达量。脂质体可有效地介导ODN转染 ,转染效率为 86 7%± 4 5 %。转染后FAK以及p4 2 / 4 4MAPK磷酸化表达量明显减少 ,10、2 0、4 0和 6 0 μg/mlFN组迁移细胞数也分别显著减少 (2 3 2 6 %、2 1 6 3%、19 31%、17 88% ,P <0 0 5 ) ,5～ 6 0 μg/ml不同浓度的FN组 ,细胞增殖减少 2 7 6 7%～ 4 6 6 7% (P <0 0 5 )。 结论　活化的FAK和p4 2 / 4 4MAPK是细胞外基质诱导平滑肌细胞迁移和增殖的重要信号分子 ,二者之间存在着密切的联系 ,由其介导的信号转导促进了这一过程 ,反义FAKODN可有效地对此进行抑制     

阿司匹林对血管内皮细胞增殖及磷酸化p44/42MAPK表达的抑制作用

目的 观察阿司匹林对体外培养的血管内皮细胞的增殖和磷酸化p44/42丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法 体外培养血管内皮细胞株ECV304,应用1、2、5、10 mmol/L的阿司匹林分别作用并设立对照进行比较,采用MTS/PES法确定ECV304细胞的增殖状态。利用p44/42磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印迹法测定磷酸化p44/42 MAPK蛋白表达。结果 各组的细胞增殖率分别为对照组1.533±0.286,阿司匹林1 mmol/L组1.253±0.225,2 mmol/L组0.953±0.149,5 mmol/L组0.708±0.125,10 mmol/L组0.459±0.107。统计分析显示低至1 mmol/L的阿司匹林仍能明显抑制ECV304细胞的增殖(P<0.05),并呈现剂量依赖性。阿司匹林对ECV304细胞的磷酸化p44/p42 MAPK表达有显著的抑制作用(P<0.05)。结论 阿司匹林对体外培养的血管内皮细胞的增殖和内皮细胞中磷酸化p44/42 MAPK的表达均有明显的抑制作用。     

尼可地尔在抑制内皮素诱导的血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的：探讨丝裂素活化的蛋白激酶（ＭＡＰＫ）,在ＡＴＰ敏感钾通道开放剂尼可地尔抑制内皮素（ＥＴ－１）诱导的培养大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法：将１０~（－７）～１０~（－５）ｍｏｌ／Ｌ的尼可地尔导于培养血管平滑肌细胞,ＥＴ－１诱导培养大鼠血管平滑肌细胞增殖。用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法测定磷酸化 ＭＡＰＫ蛋白表达。［~３ Ｈ］胸腺嘧啶核苷酸掺入测定平滑肌细胞 ＤＮＡ合成。结果：ＡＴＰ敏感钾通道开放剂尼可地尔抑制ＥＴ－１诱导的培养大鼠血管平滑肌细胞［~３Ｈ］胸腺嘧啶核苷酸掺入并同时剂量依赖性下调 ＭＡＰＫ蛋白表达。结论： ＡＴＰ敏感钾通道开放剂尼可地尔可通过下调ＭＡＰＫ的表达从而抑制ＥＴ－１诱导的培养大鼠血管平滑肌细胞增殖。