芳香烃受体(Ahr)蛋白介导类风湿关节炎(RA)骨破坏机制研究的实验设计

【立论依据】 近年发现,芳香烃受体蛋白(Aryl hydrocarbon receptor, Ahr)与RA骨破坏密切相关,可能成为RA的潜在治疗靶点。 【设计思路】 Wnt信号通路是成骨分化成熟的必需信号,干扰Wnt信号通路可显著抑制成骨。我们的前期实验结果显示升高的Ahr抑制了成骨细胞的分化发育和功能。为此,我们推测Ahr的内源性配体可能会拮抗Wnt蛋白与受体的结合;或Ahr作为胞内蛋白可能会促进β-catenin磷酸化降解;以及Ahr入核后可能直接或通过抑制Wnt信号通路而间接抑制成骨的靶基因转录,最终导致RA骨破坏。 【实验内容】 本实验将通过测定关节炎小鼠Ahr活化后成骨细胞分化成熟中各期标志性分子表达量的变化,明确Ahr活化对关节炎小鼠成骨细胞分化、发育和功能的抑制作用;通过测定Ahr活化后各期成骨细胞相关转录因子表达量的变化,明确Ahr活化对关节炎小鼠各期成骨细胞转录因子的抑制作用;通过测定Ahr活化后各期成骨细胞Wnt信号通路相关分子表达量的变化,探讨Ahr抑制Wnt信号通路分子降低成骨的机制;最后通过体内实验评估Ahr对关节炎骨破坏的影响。 【材料】 胶原诱导关节炎小鼠,分离的小鼠骨髓间充质干细胞,Ahr激动剂(TCDD)和抑制剂(DIM),real-time PCR、蛋白质印迹、免疫化学染色、流式细胞术、MTT、CHIP等实验方法中需要的各种试剂及设备。 【可行性】 相关文献显示Ahr激动剂可抑制成骨细胞分化发育,拮抗Ahr可改善关节炎症状,这为深入研究提供了理论依据;我们的前期结果显示RA模型鼠关节成骨细胞高表达Ahr;Ahr表达量与骨密度负相关,原代培养关节炎小鼠成骨细胞的成熟度下降,这为本实验设计提供了数据支持。 【创新性】 本实验的设计理念是依据目前对Ahr与自身免疫病的研究进展及RA骨破坏病理改变机制的最新认识,即Ahr与RA骨破坏密切相关;本实验设计的科研假说是通过文献汇总提出的,具有一定原始创新性,即Ahr直接或干扰Wnt信号通路促进骨破坏;本实验设计如能获得预期结果,可能为RA骨破坏新机制的揭示提供实验数据,也可为同时抑制炎症和骨破坏的RA防治理念提供新靶标。     

成红细胞样Ter细胞在胶原诱导性关节炎发病中的作用

目的 通过检测Ter细胞在不同发病阶段胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠脾脏中的数量变化及高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞与关节评分和T、B细胞亚群比例的相关性,探讨Ter细胞在CIA发生和发展中的作用,从而进一步深入理解类风湿关节炎的发病机制。方法 6~8周的DBA/1小鼠进行CIA模型的诱导,二次免疫后开始对CIA小鼠进行关节评分。根据发病时间和关节评分将CIA分为发病早期、高峰期、晚期三个阶段。发病高峰期小鼠根据最终关节评分再分为高评分组(>8分)和低评分组(≤8分),流式细胞术检测na?ve小鼠和各个阶段CIA小鼠脾脏中Ter细胞比例及发病高峰期CIA小鼠脾脏T、B 细胞亚群比例,并进行关联分析。结果 发病高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例较na?ve小鼠明显升高(8.522%±2.645% vs. 1.937%±0.725%,P<0.01), 高评分组小鼠脾脏Ter细胞比例明显低于低评分组(6.217%±0.841% vs. 10.827%±0.917%,P<0.01)。高评分组小鼠脾脏Th1细胞比例明显高于低评分组(1.337%±0.110% vs. 0.727%±0.223%,P<0.05),高评分组小鼠脾脏Th17细胞比例高于低评分组(0.750%±0.171% vs. 0.477%±0.051%,P=0.099),高评分组小鼠脾脏生发中心B(germinal center B,GC-B)细胞比例明显高于低评分组(1.243%±0.057% vs. 1.097%±0.015%,P<0.05)。相关性分析结果显示,发病高峰期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例与CD4 ⁺T、Th1、Th17、GC-B细胞比例均呈强负相关,与B10细胞比例呈强正相关,相关性均有统计学意义,提示这群细胞在CIA中可能具有保护作用。动态变化研究显示,随着疾病进展,发病晚期CIA小鼠脾脏Ter细胞比例较高峰期明显降低(0.917%±0.588% vs. 8.522%±2.645%,P<0.001), 进一步提示这群细胞在关节炎中的保护作用。 结论 Ter细胞在发病高峰期CIA小鼠脾脏中明显增加,与小鼠关节评分及致病性免疫细胞比例呈负相关,与保护性免疫细胞比例呈正相关,发病晚期CIA小鼠Ter细胞比例明显降低,提示Ter细胞可能作为一种保护性细胞参与类风湿关节炎的发生和发展,但其具体作用及机制仍需后续进一步的体内及体外实验验证。     

TSC1基因对调节性T细胞发育分化的免疫调控作用

【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。     

新疆黑蜂胶调节小鼠T细胞亚群及细胞因子作用研究

【立论依据】 蜂胶调节人体免疫细胞功能,具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等功效,应用前景广阔。目前研究蜂胶在疾病中免疫激活和调节作用主要集中在其对固有免疫(如吞噬细胞)的激活作用,对蜂胶调节T细胞亚群的功能及其增强特异性免疫应答的作用机制,目前文献报道甚少,对新疆黑蜂胶免疫调节功能的研究尚无文献报道。 【设计思路】 研究新疆黑蜂胶对小鼠T细胞亚群的转化和功能影响,初步探讨其免疫调节和抗肿瘤功能的机制。 【实验内容】 (1)新疆黑蜂胶体外诱导小鼠淋巴细胞增殖实验,采用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖活性,并获得初步实验结果即新疆黑蜂胶对淋巴细胞具有激活作用且存在明显的浓度依赖性。(2)研究新疆黑蜂胶对小鼠T细胞亚群的调节作用,应用流式细胞技术、CBA法或ELISA法分别检测服用不同剂量黑蜂胶粗品的小鼠Treg、Th17、CTL细胞亚群及其分泌的细胞因子(TGF-β、IL-10、IL-17、IL-2、IFN-γ),分析新疆黑蜂胶对T细胞亚群形成的免疫平衡作用以及正/负调节免疫应答的机制。(3)开展新疆黑蜂胶体外抗肿瘤实验。采用流式细胞技术等方法检测和观察黑蜂胶对小鼠肿瘤细胞凋亡,分析其对Fas凋亡受体表达的正调节作用。以上几项研究均采用高中低三个不同蜂胶剂量,同时探讨其功能与药物剂量的相关性,并筛查黑蜂胶有效作用浓度。 【材料】 新疆黑蜂胶醇提粗制品;Balb/C小鼠;MTT,检测小鼠Treg、Th17、CTL的荧光标记抗体试剂,检测小鼠CK的抗体标记CBA;流式细胞仪、酶标仪等仪器。 【可行性】 本次课题成功立项新疆医科大学2013年大学生科研项目,本课题项目团队在教师指导下提取了黑蜂胶并已完成实验内容1,为其余实验做了很好的准备,在我校内具有实验所需仪器和技术支持。 【创新性】 新疆黑蜂胶产品是珍贵的本土资源,具有很高的经济和科研价值。目前研究蜂胶的免疫功能主要集中在其对固有免疫(如吞噬细胞)的激活作用,对蜂胶调节T细胞亚群研究文献报道甚少,对新疆黑蜂胶免疫调节功能的研究尚无文献报道。     

白芍总苷抑制NLRP3活化治疗干燥综合征小鼠的实验研究

目的：探讨白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）治疗干燥综合征的效果及与抑制核苷酸结合寡聚化结构域 （nucleotide binding oligomerization domain，NOD）样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3， NLRP3）炎症体活化的关系，旨在阐明TGP治疗干燥综合征的新机制。方法：选取雌性非肥胖性糖尿病小鼠为干燥综合征模型。400 mg/kg TGP灌胃1个月后，测量小鼠唾液流量，观察颌下腺组织淋巴细胞浸润情况，检测脾脏细胞NLRP3炎症体活化状态。体外刺激脾脏细胞NLRP3炎症体活化，并用100 μg/mL TGP处理，RT-qPCR和Western blot法检测脾脏细胞NLRP3炎症体活化状态。结果：与对照组相比，TGP灌胃组小鼠唾液流量显著增加（P＜0.05），颌下腺组织淋巴细胞浸润显著减少，脾脏细胞的NLRP3炎症体表达水平显著下降（P＜0.05）；体外实验也表明，TGP抑制脾脏细胞的炎症体活化（P＜0.05）。结论：TGP改善干燥综合征小鼠症状，其机制与抑制NLRP3炎症体活化相关，揭示了TGP治疗干燥综合征的新机制，为进一步推广应用 TGP治疗干燥综合征提供了新的证据。     

基于NF-κB探究苗医验方四大血调控佐剂性关节炎大鼠TNF-α表达的作用机制

【立论依据】 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的致残率在关节病中高居首位。四大血流传于西南苗族地区,在风湿类疾病的治疗中应用广泛。研究显示,炎症因子(如:TNF-α、IL-1β等)及信号通路(如:NF-κB等)的上调及激活与RA发病密切相关,且RA临床症状的改善与炎症因子的下调及信号通路的抑制有关。因而我们提出猜想:四大血能否下调TNF-α、IL-1β表达、抑制NF-κB激活?若能下调,该作用是否与抑制NF-κB有关? 【设计思路】 首先用四大血作用于RA模型动物及关节滑膜细胞,观察其能否下调TNF-α、IL-1β表达;若能,则对另一组RA模型动物及滑膜应用NF-κB抑制剂,去除NF-κB在四大血作用RA过程中的影响;之后,应用四大血观察TNF-α、IL-1β的表达水平是否下调,若未下调,说明四大血下调TNF-α、IL-1β的作用只与其抑制NF-κB有关,若部分下调(与应用NF-κB抑制剂之前相比,下调幅度减少),说明四大血下调TNF-α、IL-1β与抑制NF-κB部分有关,若完全下调(下调幅度与应用NF-κB作用前相同),说明四大血下调TNF-α、IL-1β的作用与其抑制NF-κB无关。 【实验内容】 (1)建立RA动物模型——佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠用于体内实验,并培养AA大鼠滑膜细胞用于体外实验;(2)灌胃给予AA大鼠及滑膜细胞一定浓度四大血;(3)观察给药后TNF-α、IL-1β变化情况;(4)若TNF-α、IL-1β下调,则用NF-κB抑制剂(BMS345541)对另一组AA大鼠及滑膜细胞进行预处理;(5)预处理后的AA大鼠及滑膜细胞给予一定浓度四大血;(6)观察TNF-α、IL-1β的表达水平。 【材料】 试剂:四大血、TNF-α、IL-1β等。动物及组织:SD大鼠、滑膜细胞。仪器:酶标仪、细胞培养箱等。 【可行性】 (1)本实验组前期成功建立AA大鼠模型并通过测量大鼠足跖肿胀度及病理形态学观察,证实了四大血最RA确切的治疗作用,具有较为扎实的实验基础;(2)所需实验器材易于获取;(3)采用常规实验手段,方法稳定可靠;(4)小组成员掌握所需实验技术手段,技能可靠。 【创新性】 (1)本实验研究对象为西南民族草药,具有地域性、民族性、特色性;(2)应用信号通路抑制剂,从而在去除NF-κB的基础上,单方面的探讨四大血对TNF-a、IL-1β的作用。     

人工合成红景天苷对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤早期防治作用的机制初探

【立论依据及设计思路】 急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是呼吸道重大疫病(如SARS、禽流感等)的病理基础,ALI进一步发展即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),目前尚无有效的治疗手段。民间用红景天治疗肺炎咳嗽和咳血等症状已有上千年历史,新近发现传统中药红景天对ALI具有保护作用,其主要有效成分红景天苷可能发挥主要功能,但机制不详。目前如何开发人工合成的高纯度红景天苷替代日益枯竭的红景天资源用于临床治疗是个亟待解决的问题。我们的初步研究提示,人工合成红景天苷对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠的ALI早期具有防治效果。在此基础上,我们将进一步探究红景天苷治疗ALI的分子机制。 【实验内容】 动物实验:LPS气管滴注构建ALI的大鼠模型,实验分组:对照组、LPS组、LPS + 地塞米松组、LPS + 不同剂量红景天苷组,观察指标:血气分析(PaCO2、PaO2、pH)、血球分析(白细胞总数、中性粒细胞数等)、肺大体和肺组织形态学(H-E染色)、肺系数和肺湿/干重比、肺泡灌洗液(总蛋白含量、中性粒细胞数、促炎因子NF-κB、IL-1和IL-6水平);细胞实验:分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,并与大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383同步进行实验,实验分组:对照组、LPS组、LPS + 不同剂量红景天苷组。细胞经相应药物处理,收集细胞和培养上清,检测关键炎症信号通路LPS/NF-κB(如NF-κB转录活性、NF-κB与DNA结合活性和NF-κB核转位等)和LPS/MAPK(如p38、ERK 和JNK磷酸化)的改变, ELISA测定培养上清中NF-κB、IL-1和IL-6等炎症介质含量。最后进行统计学分析。 【材料】 雄性SD大鼠,NR8383细胞系,纯度>99.5%的人工合成红景天苷,LPS。 【可行性】 前期预实验结果提示人工合成红景天苷对LPS诱导大鼠ALI早期具有防治作用。目前已成功分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,为在细胞分子水平探讨作用机制提供可能。 【创新性】 首次探究人工合成红景天苷对LPS诱导大鼠ALI早期的防治作用及其可能的分子机制。     

草苁蓉环烯醚萜苷对H22小鼠肝癌移植瘤的抑瘤作用

目的 探讨草苁蓉环烯醚萜苷对小鼠H²²移植瘤的生长抑制作用。方法 建立小鼠皮下H²²移植瘤模型,将实验动物分为模型组、草苁蓉环烯醚萜苷高、中、低剂量（400、200、100 mg/kg）组和5-Fu（25 mg/kg）组,草苁蓉环烯醚萜苷组连续ig给药10 d;5-Fu组隔日ip给药,给药5次,计算抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数,并以ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-2（IL-2）,比色法检测血清总抗氧化活力（T-AOC）和丙二醛（MDA）水平。结果 与模型组比较,草苁蓉环烯醚萜苷能显著减轻移植瘤瘤质量,高、中、低剂量组抑瘤率分别为38.05%、34.98%、26.95%。同时,明显升高荷瘤小鼠的脾脏指数,升高血清IL-2水平和降低TNF-α水平,升高血清T-AOC和降低MDA水平。结论 草苁蓉环烯醚萜苷对H²²移植瘤具有明显的抑制作用,其作用机制可能与调节IL-2和TNF-α等细胞因子的表达以及增强荷瘤小鼠抗氧化能力有关。     

类风湿性关节炎患者外周血NKG2D、NKG2A及颗粒酶B表达的研究

目的 本研究旨在探讨类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者外周血中NK细胞表达NKG2D、NKG2A及胞内颗粒酶B的水平,并且分析它们与疾病活动度（DAS28）的相关性。方法 流式细胞术检测41例RA患者和35例健康对照者外周血中NK细胞、NKG2D⁺NK细胞、NKG2A⁺NK细胞以及颗粒酶B⁺NK的表达水平;采用Spearman秩相关分析法分析它们与DAS28的相关性。结果 RA患者外周血中,NK细胞表达水平显著低于健康对照组（P=0.016）;NKG2D的表达水平显著低于健康对照组（P=0.002）,且NKG2D的表达水平与DAS28评分呈负相关（P<0.05）;NKG2A的表达水平与健康对照组之间比较差异无统计学意义（P=0.547）,且与DAS28评分不存在显著相关性（P>0.05）;颗粒酶B的表达水平有所降低（P=0.034）,但与DAS28评分不存在显著相关性（P>0.05）。结论 活化性受体NKG2D以及胞内颗粒酶B表达的异常降低可能导致NK细胞杀伤活性的损伤,不能有效杀伤免疫效应细胞,从而促进了RA的发生、发展。     

白细胞介素-33对肿瘤组织中髓系抑制性细胞功能的调控及机制

【目的】 CD11b⁺Gr-1⁺髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)具有强大的抑制T细胞的功能,是肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸和促进肿瘤发展的重要细胞亚群,但其功能调控的分子机制尚不清楚。本研究目的是揭示肿瘤组织中白细胞介素-33(interleukin 33,IL-33)对MDSC功能的调控作用及其机制。 【方法】 给BALB/c小鼠接种4T1细胞,构建小鼠乳腺癌模型;用免疫荧光、定量PCR、免疫组化和ELISA等方法检测小鼠4T1和人乳腺癌组织中IL-33的表达水平;流式细胞术检测野生型和IL-33受体ST2敲除小鼠(ST2^-/-)肿瘤组织中CD11b⁺Gr-1⁺MDSC的比例,以及MDSC增殖和凋亡的水平;检测IL-33处理前后MDSC存活水平,以及精氨酸酶-1(arginase 1,Arg-1)在mRNA水平以及酶活性上的变化;蛋白质印迹法检测IL-33处理后MDSC相关信号通路分子的改变,并用转录因子抑制剂进行验证,以揭示IL-33调控MDSC功能的关键转录因子。 【结果】 小鼠4T1和人乳腺癌组织中存在大量IL-33表达的现象;小鼠和人乳腺癌组织上清液中检测到高水平的IL-33。在小鼠肿瘤组织中,MDSC高表达ST2,其中45%的ST2⁺细胞为MDSC;ST2^-/-小鼠肿瘤组织中MDSC的数量比野生型显著减少(P<0.001);ST2^-/-小鼠肿瘤组织中的MDSC增殖显著减少,凋亡显著增多(P<0.05); 体外IL-33刺激能诱导MDSC增殖,减少凋亡;IL-33处理24 h后,Arg-1的mRNA表达及酶活性均显著增高(P<0.01)。IL-33处理后,MDSC的NF-κB和ERK的磷酸化水平明显增加,而加入转录因子抑制剂后,IL-33诱导MDSC上调Arg-1表达的效应显著降低(P<0.01),表明NF-κB和ERK对于IL-33调控MDSC的功能极其重要。 【结论】 证实肿瘤组织中高水平IL-33分泌可诱导MDSC增殖,促进其在肿瘤组织中的聚集,并上调MDSC表达Arg-1而增强其免疫抑制功能,NF-κB和ERK是IL-33作用于MDSC通路中至关重要的转录因子。研究结果为揭示肿瘤细胞免疫逃逸的机制提供了新的观点,并可能为肿瘤的免疫治疗提供新的思路。