基于CRISPR-Cas12a系统反式切割活性的凝血酶检测技术研究

目的 通过构建快速、灵敏的凝血酶检测技术,为多种血管栓塞性疾病,如脑静脉窦血栓形成（cerebral venous sinus thrombosis,CVST）的早期诊断和治疗提供新的策略。方法 利用所筛选的高特异性凝血酶适配体设计发夹结构变构探针,用于高特异性识别凝血酶并将凝血酶信号转化为核酸信号。在变构探针识别凝血酶后,适配体结合凝血酶引发变构探针变构,暴露Cas12a活性部分。CRISPR-Cas12a系统识别活性部分后,其反式切割特性被触发,开始无序切割周围存在的单链DNA荧光探针,导致标记在荧光探针两端的荧光基团（Cy3）和淬灭基团（BHQ）分离,使处于被淬灭状态的Cy3荧光重新出现。所产生的荧光信号的强度与体系中存在的凝血酶浓度呈正相关。结果 通过荧光实验证实所设计的变构探针对凝血酶表现出极高的识别特异性和稳定性;在所优化的实验条件下,该方法表现出良好的检测性能,检测限为0.23 pmol/L。结论 该方法结合了高灵敏度、低成本和良好的便携性等优点,为凝血酶相关疾病的检测与精准诊断提供了强有力的技术支持。     

细胞表面α2,6-唾液酸在肝癌细胞粘附中的作用及机制研究

【目的】 分析比较细胞表面不同连接方式的唾液酸在小鼠肝癌高淋巴道转移细胞株Hca-F和低淋巴道转移细胞株Hca-P中的表达,并研究差异性表达的α2,6-唾液酸在肝癌细胞淋巴结黏附行为中的作用及分子机制。 【方法】 利用免疫细胞化学、流式细胞技术,分析肝癌细胞表面不同连接方式的唾液酸在Hca-F和Hca-P中的表达差异;通过RNA干扰技术干预差异表达的唾液酸转移酶,并使用RT-PCR、蛋白质印迹及Lectin-blot方法检测其干扰效果;利用细胞黏附实验和凝集素阻断实验,检测干扰前后、阻断前后Hca-F细胞黏附能力的变化;利用FAK信号通路特异性抑制剂,探讨α2,6-唾液酸介导肝癌细胞黏附行为的分子机制。 【结果】 α2,6-唾液酸在小鼠肝癌高、低转移细胞株中表达具有显著差异,而α2,3-唾液酸的表达无显著差异;当通过RNA干扰技术特异性使Hca-F细胞中ST6Gal-I表达下调时,其细胞表面α2,6-唾液酸表达减少,削弱Hca-F细胞对淋巴结的黏附能力降低。此外,ST6Gal-I表达下调可抑制p-FAK及下游p-paxillin蛋白分子的表达。 【结论】 细胞表面α2,6-唾液酸可通过FAK信号转导通路正性介导肝癌细胞的黏附行为,为肝癌的治疗提供新的靶点。     

MNPs-exosomes联合载药系统的制备及其在肿瘤治疗中的可行性探索

【立论依据】 药物靶向输送系统在肿瘤治疗中至关重要。磁性纳米颗粒(MNPs)可在外磁场引导下使其负载药物定向于肿瘤组织,达到肿瘤化疗中低毒高效的目的。然而,它的非生物源性使它不能在体液和组织中稳定地存在。Exosomes是一种由体内多种细胞释放的、直径介于50~150纳米的微囊体。因不引起补体或凝血因子的激活,以及难以被单核巨噬细胞吞噬,故可以在体内稳定存在,也是药物的理想载体。但由于靶向性较弱,难以富集至肿瘤组织。 【设计思路】 本项目拟设计并制备MNPs-exosomes二者联合的载药系统,以达到优势互补的效果,并通过体内外实验探讨其是否具有协同效应,从而为构建肿瘤靶向给药系统提供一种新思路。 【实验内容】 (1)制备3种药物载体:MNPs、exosomes、MNPs-exosomes联合载药体;(2)将3种药物载体分别与药物结合:选用多柔比星;(3)体内外实验验证其靶向性;(4)体内外实验评价其治疗效果。 【材料】 RAW-264.7细胞、HEPG-2细胞、MNPs、四氧化三铁悬液、250nm二氧化硅粒子悬液、聚苯乙烯、甲苯。 【可行性】 本课题组已进行了制备MNPs-exosomes联合载药体的预实验,实验结果符合预期。在以往的研究中,我们已经掌握了进行上述实验所需要的技术和方法,具备一定的科研悟性和热情,可以完成此研究。 【创新性】 (1)首次提出将MNPs与exosomes联合载药,通过二者的优势互补,来观察联合体是否具有协同作用;(2)我们拟通过制作超小粒径分子筛分离提纯exosomes,避免了传统方法的弊端。     

和厚朴酚固体脂质纳米粒的制备及性质研究

目的 制备具有缓释作用的和厚朴酚固体脂质纳米粒。方法 采用乳化蒸发-低温固化法制备和厚朴酚固体脂质纳米粒,通过正交试验对处方进行优化,并对其包封率、粒径、体外释放等进行考察。结果 制备的固体脂质纳米粒的平均粒径为159 nm,包封率为77.1%。结论 乳化蒸发-低温固化法可用于制备和厚朴酚固体脂质纳米粒。     

α-生育酚抑制日本血吸虫性成熟的作用研究

【立论依据及设计思路】 血吸虫病是我国重点防治的重大传染病,虫卵既是主要致病因子,又是传播的关键环节。迄今唯一有效杀虫药物吡喹酮虽能杀虫但不能清除沉积宿主肝脏和肠系膜静脉中的虫卵,且已发现吡喹酮耐药虫株,故研发血吸虫病新型防治药物刻不容缓。众多研究确证α-生育酚可明显促进哺乳动物的生殖性能,但对无脊椎动物血吸虫的生殖作用未见报道。我们第一次证实α-生育酚喂食感染血吸虫小鼠,可显著抑制血吸虫的发育成熟。课题组拟进一步结合体内外实验,以揭示α-生育酚抑制血吸虫性成熟的分子基础及相关机制。 【实验内容】 (1)α-生育酚对感染小鼠血吸虫性成熟抑制作用的时间、剂量效应研究:确定作用的最佳喂食时间和最佳浓度。(2)α-生育酚抑制血吸虫性成熟的宿主普适性研究:新增SD大鼠、新西兰兔等为血吸虫感染模型。(3)综合利用差异蛋白质组学和RNAi等技术研究α-生育酚抑制血吸虫性成熟的作用机制。 【材料】 α-生育酚、Balb/c小鼠、SD大鼠、新西兰兔、阳性钉螺、RNAi尾蚴、蛋白质纯化试剂盒及定量试剂盒、荧光正置显微镜、细胞因子芯片、双向电泳、质谱等。 【可行性】 本项目所涉及技术本课题组均已掌握,可满足项目所需的全部实验条件。前期阶段性研究已表明,α-生育酚喂食血吸虫感染小鼠,可显著抑制血吸虫发育为成熟虫体。差异蛋白质组学研究进一步发现,α-生育酚可显著导致血吸虫副肌球蛋白、糖原磷酸化酶等基因的表达水平。 【创新性】 我们首次提出通过α-生育酚抑制血吸虫的性成熟和产卵来防治血吸虫病。本研究若取得预期效果,将具有良好的临床应用和血吸虫病现场防治推广价值。     

壳聚糖耦联杂大环Cu(II)配合物的制备及其催化释放NO性能

【目的】 寻求高效低毒的内源性一氧化氮供体型前药,并探究其在生理条件下催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【方法】 采用常规法与微波法考察关键中间体制备条件;应用壳聚糖成膜策略耦联杂大环Cu(II)化合物,通过¹HNMR、¹³CNMR、SEM等手段对中间体及目标前药分子的结构和组成进行表征;利用重氮化反应探究其催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结果】 (1)探寻出关键中间体的高效、节能制备方法;(2)成功制备并表征了各中间体及其目标前药;(3) 制备的目标前药具有良好的催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结论】 为人工合成高效低毒的一氧化氮供体型前药的设计开辟了新思路,也为一氧化氮的供药方式提出了新的供药途径。     

水茄的化学成分研究

目的 研究茄科植物水茄Solanum torvum的化学成分。方法 应用溶剂萃取及柱色谱方法分离水茄的化学成分,通过波谱技术鉴定化合物的结构。结果 从水茄地上全草中分离得到11个化合物,其中有4个酰胺类、4个甾体皂苷类、2个黄酮类、1个有机酸类成分,分别鉴定为N-反式阿魏酸酪酰胺（1）、N-反式-对-香豆酰基酪胺（2）、3-(4-羟基苯基)-N-[2-(4-羟基苯基)-2-甲氧基乙基]丙烯酰胺（3）、N-反式-对-香豆酰基章鱼胺（4）、山柰酚（5）、槲皮素（6）、反式咖啡酸（7）、(25S)-6α-羟基-5α-螺甾烷-3-酮-6-O-(β-D-吡喃鸡纳糖苷)（8）、(25S)-6α-羟基-5α-螺甾烷-3-酮-6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-β-D-吡喃鸡纳糖苷]（9）、(25S)-螺甾烷-5-烯-3β-醇-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷]（10）、(25S)-5α-螺甾烷-3β-醇-6α-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃鸡纳糖苷]（11）。结论 化合物3为新的天然产物,化合物1～7为首次从该植物中分得。     

弓形虫重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP的制备、鉴定及免疫保护效应

【立论依据】 弓形虫微线体分泌的粘附蛋白MIC2与M2AP(MIC2相关蛋白)以1∶1的比例形成MIC2-M2AP六聚复合体,转移到弓形虫顶端与宿主细胞膜之间形成的连接区域,协助虫体进入宿主细胞。 【设计思路】 制备弓形虫重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP,鉴定其免疫原性和免疫反应性及其在抗弓形虫入侵宿主细胞中的作用,为筛选MIC2-M2AP作为弓形虫疫苗候选抗原的研究奠定基础。 【实验内容】 RT-PCR扩增弓形虫MIC2和M2AP基因,克隆至组成型表达的毕赤酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组真核表达质粒 pGAPZαA-MIC2和pGAPZαA-M2AP,利用同源重组的方法将MIC2和M2AP基因整合到同一毕赤酵母细胞X33的基因组中进行发酵表达获得重组MIC2-M2AP复合体,His标签Ni-NTA柱亲和层析纯化后免疫小鼠,采用免疫小鼠血清和弓形虫感染鼠血清进行蛋白质印迹鉴定重组MIC2-M2AP复合体的免疫原性和免疫反应性,免疫小鼠抗重组MIC2-M2AP复合体多抗血清体外中和实验观察阻断弓形虫入侵宿主细胞效应,重组MIC2-M2AP复合体免疫小鼠的抗弓形虫感染效应。 【材料】 弓形虫RH株速殖子,毕赤酵母表达载体pGAPZαA。 【可行性】 国外文献已经证实MIC2-M2AP复合体在协助虫体的滑移运动和侵入细胞中发挥重要的作用,敲除MIC1基因后,弓形虫株对宿主细胞的入侵率下降50%,敲除MIC2的结合蛋白M2AP后,弓形虫株对宿主细胞的入侵率下降80%以上,因此重组MIC2-M2AP复合体有可能作为弓形虫疫苗候选抗原。目前我们已成功构建了重组真核表达载体 pGAPZαA-MIC2和pGAPZαA-M2AP,其核苷酸序列与GenBank中的序列同源性为100%。 【创新性】 国内外在弓形虫疫苗候选抗原筛选研究中,目前报道较多的是弓形虫表面抗原(SAG)、棒状体蛋白(ROP)、致密颗粒抗原(GRA)等可能作为弓形虫疫苗候选抗原的研究,而关于微线体蛋白(MIC)尤其是MIC2-M2AP复合体可作为弓形虫疫苗候选抗原的研究未见报道,而根据已报道的微线体蛋白相关研究成果,我们推测重组MIC2-M2AP复合体免疫会产生较强的免疫保护效果。     

HIF-1α信号通路相关分子在胃癌中的表达及其对细胞增殖与侵袭的影响研究

【立论依据】 缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)是参与低氧环境中细胞适应性调节的关键转录因子,通过结合于靶基因上游转录调节区的低氧反应原件调控多种分子的表达。HIF-1α的异常增高参与了多种癌症的发生发展,课题组前期研究揭示了胃癌组织中存在着HIF-1α的高表达现象,但是HIF-1α的异常表达通过哪些下游靶基因及信号通路来实现对胃癌细胞的增殖、侵袭的调控尚不清晰。因此,高通量筛选及验证HIF-1α下游靶基因,构建HIF-1α信号网络并进行功能分析,为深入理解以HIF-1α为核心的信号通路相关分子对胃癌细胞增殖与侵袭的影响奠定重要理论基础,同时也为阐明胃癌发生、发展机理,寻找胃癌早期诊断和治疗的靶标提供科学依据。 【设计思路】 本设计旨在前期研究基础上,检测胃癌细胞中HIF-1α的表达变化,结合转录组学及数据库信息绘制与细胞增殖及侵袭相关的HIF-1α调控网络图;利用RNAi技术沉默HIF-1α,检测其靶基因的表达,探讨转染后对肿瘤细胞增殖及侵袭的影响。 【实验内容】 (1)结合转录组及数据库信息,初步构建胃癌中HIF-1α调控网络,RT-qPCR及蛋白质印迹对HIF-1α及靶基因进行验证;(2)siRNA技术对胃癌细胞HIF-1α进行敲除,RT-qPCR、蛋白质印迹检测敲除后HIF-1α 及其靶基因表达;(3)MTT及transwell实验检测有效基因敲除后胃癌细胞株的增殖能力及侵袭性变化。 【材料】 (1)胃癌细胞株SGC-7901,细胞转染相关材料及试剂,HIF-1α及其靶基因引物、抗体,逆转录及实时定量PCR试剂,蛋白质印迹相关试剂。(2)转录组学信息,TRED数据库,cytoscape做图软件等计算机工具。 【可行性】 课题组前期利用外显子芯片、RT-qPCR及蛋白质印迹法证实HIF-1α在胃癌组织中呈高表达,并且结合TRED数据库及胃癌基因表达谱筛选出胃癌中HIF-1α可能的靶基因。以上工作为进一步探索HIF-1α作用的下游靶基因及其对胃癌细胞增殖及侵袭性的影响及机制研究提供了思路及实验基础。此外,项目组具有完成信号调控网络研究的硬件设施及研究基础,为项目的顺利实施奠定基础。 【创新性】 将高通量组学、生物学实验及计算生物学技术紧密联合,探讨HIF-1α信号通路对胃癌细胞增殖及侵袭性的影响及可能的机制。     

NADPH氧化酶来源的活性氧在2型糖尿病发生发展中的作用

【目的】 探讨NADPH氧化酶来源的活性氧在糖尿病发生发展中起到的作用。 【方法】 我们建立了长时程高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的大鼠模型来模拟人类2型糖尿病。在此模型基础上,运用常规的形态学和生物化学测定有关蛋白质的含量;运用免疫放射法测定胰岛素的含量。通过对糖代谢通路关键酶、血糖、胰岛素的测定来判定大鼠糖尿病的发生、发展。通过对大鼠体内ROS、MDA、TOAS的测定来判定大鼠体内氧化应激的状态。通过测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及糖原磷酸化酶的活性来反映大鼠糖代谢通路的变化。 【结果】 apocynin可以明显降低糖尿病大鼠的血糖升高水平,于此同时,在apocynin的干预下,糖尿病大鼠体内的氧化应激的水平比其它各组明显降低,其还可降低糖尿病大鼠肝脏糖原分解关键酶的活性、使其更接近于正常水平。 【结论】 NADPH氧化酶来源的活性氧可能通过糖原分解通路,对2型糖尿病的发生发展发挥作用。