细胞核内反义RNA和反义ribozyme——基因表达抑制新途径

近年来,新采用的反义技术已有细胞核内反义RNA和Antizyme。前者是指将反义RNA限制于细胞核内抑制靶基因原始转录子,以避免在细胞浆需抑制极其巨大数量的靶RNA,而起到把问题解决在萌芽状态的独特作用,这种模拟真核生物天然存在反义RNA封闭基因表达机制的高效方法,无疑开辟了一条抑制基因表达的新途径。后者是反义ribozyme,即ribozyme基因与反义RNA基因相连接,转录成具有ribozyme和反义RAN双重功能的一类RNA分子,实际上是基因剪刀和基因表达封条的联合体。目前,它在转基因植物研究方面,应用比较广泛。从研究进展、存在问题、发展对策和应用前景四方面评述细胞核内反义RNA和反义ribozyme是抑制基因表达的新途径。     

端粒酶反义RNA技术在抑制结肠癌生长中的研究现状

反义RNA是指能够通过碱基互补与靶RNA(主要是mRNA)特异性结合,抑制靶RNA的功能,从而控制其表达的一类小分子转录物.反义RNA的发现始于原核生物,后来发现真核细胞中也存在天然反义RNA.由于能够选择性地封闭靶基因表达,而且随着近年来反义RNA技术与端粒酶研究的不断深入,构建出针对端粒酶的反义RNA抑制其活性,达到抑制肿瘤生长的目的,成为近年来的研究热点.本文对反义RNA作用原理、抗结肠癌作用中的应用等进行综述.     

EB病毒基因在鼻咽癌组织转录表达的研究

本研究在转录水平上,利用转录载体PGEM-2与两种EB病毒基因片段(LMP和FBER-1)分别构建重组质粒,以SP~6和T~7RNA聚合酶合成含有~35标记的单链反义RNA(Anti-sense RNA或cRNA)和正义RNA(sense RNA),并分别与经病理确诊的鼻咽癌组织40例进行组织原位杂交,结果显示与40例鼻咽癌组织原位杂交后,LMP单链反义RNA有36例呈阳性,其阳性率为90％;EBER-1反义RNA40例均呈阳性,阳性率为100％;两种基因片段的单链正义RNA均为阴性。     

反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较

目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义RNA和P区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法:构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量,用Nested-PCR法检测血清HBV DNA转阴率.结果:PLXSN-asX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制,至给药后8周抑制依然存在;PLXSN-asP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制,至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别于2和8 wk达到抑制高峰,抑制率均为58%; 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8).结论:HBV X区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显著差异,但X区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 探讨表达乙型肝炎病毒（HBV）双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,转染PA317细胞,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度,以假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测其上清HBsAg和HBeAg,并以荧光聚合酶链反应定量方法检测2.2.15细胞内DNA和RNA含量。结果 HBVX、P双靶区反义RNA抗HBV的作用较单靶区反义RNA更明显,且对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA和RNA抑制作用大,正义RNA无明显抑制作用。结论 细胞内表达HBV反义RNA具有明显抗HBV复制和表达的作用。双靶区反义RNA作用更明显。     

反义BTEB2腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 :构建反义BTEB2重组腺病毒载体 ,以研究BTEB2反义RNA对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖及动脉再狭窄的影响。　方法 :从培养的大鼠VSMC中提取总RNA ,通过RT PCR制备BTEB2cDNA ,将BTEB2cDNA反向连接至腺病毒穿梭质粒pDC31 5中 ,构建重组穿梭质粒pDC31 5ASBTEB2 ,将其与腺病毒基因组质粒pBHGloxΔE1 ,3Cre共转染 2 93细胞获得重组腺病毒 ,采用PCR方法对其进行鉴定 ;用重组腺病毒感染VSMC ,通过RT PCR检测BTEB2反义RNA在VSMC中的表达。　结果 :在病变 2 93细胞的冻融上清中含有反义BTEB2重组腺病毒 ,其滴度为 5×1 0 9ml。VSMC被重组腺病毒感染后 ,可检测到BTEB2反义RNA的表达。　结论 :成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体 ;重组腺病毒可在VSMC中表达BTEB2反义RNA ,为进一步研究BTEB2反义RNA对VSMC增殖及动脉再狭窄的影响奠定了基础     

Cubilin反义RNA对大鼠肾小管超负荷重吸收白蛋白的抑制作用

目的探讨经肾动脉灌注腺病毒载体介导Cubilin反义RNA对肾小管超负荷重吸收白蛋白的抑制作用。方法建立大鼠阿霉素肾病模型,正义RNA组和反义RNA组分别经肾动脉缓慢灌注GFP基因标记的pAdEasy-Cub和pAdEasy-ACub,对照组和模型组灌注等量生理盐水。激光共聚焦显微镜下观察GFP的表达,并监测24h尿蛋白量及其他生化指标;光镜下观察肾小管间质病理变化;免疫组化法观察肾小管Cubilin基因的表达以及肾小管上皮细胞内白蛋白的沉积。结果转染第4天,正、反义RNA组肾脏GFP基因有较强表达,11d达到高峰,可持续至实验结束;反义RNA组与其他各组相比,24h尿蛋白量明显增高（P〈0.01）,小管间质病变轻微,Cubilin阳性表达率最低,且与白蛋白的沉积呈显著正相关（r=0.896,P〈0.01）。结论经肾动脉途径灌注重组腺病毒,能器官靶向性表达外源基因;Cubilin反义RNA对肾小管超负荷重吸收白蛋白有明显的抑制作用,并可以有效地减轻蛋白尿引起的肾间质损伤。     

VEGF165反义RNA表达对人胃癌细胞恶性生物学行为的影响

目的利用本室构建的反义VEGF165（血管内皮生长因子,vascular endothelial growth factor）真核表达载体,研究VEGF反义RNA表达对人胃癌细胞生物学表型的影响. 方法用阳性脂质体介导的基因转染技术,将VEGF反义RNA重组体转入人胃癌细胞系,观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学表现. 结果 VEGF反义RNA重组体转染胃癌细胞后,斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,反义RNA基因转染技术可使VEGF的表达明显减弱;与未转染的细胞相比,G2/M期细胞增加(0.39),而S期细胞减少(0.54);克隆形成率(2.2%)低于未转染细胞(4.0%);肿瘤细胞接种裸鼠后33 d时,VEGF反义RNA表达人胃癌细胞所致的移植瘤体积（345±136) mm3明显小于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF反义RNA可以通过抑制肿瘤组织血管生成而防治肿瘤的生长,另外VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

反义c-myc表达载体的构建及其瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应

目的:构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立新型的c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,研究瞬时表达对HepG2.2.15细胞的体外生物学效应。方法:XbaI和HindIII双酶切携带目的基因的质粒pcMYC和pcDNA3.1(-)真核表达载体,T4DNA连接酶连接,构建c-myc反义RNA表达载体。合成针对表皮生长因子受体(EGFR)的相应16肽GE7和流感病毒血凝素功能域的HA20寡肽,并与多聚赖氨酸连接,连接物与c-myc的反义RNA表达载体混合,构建新型c-myc反义RNA肝癌靶向性转移系统,即四元复合体。结果:成功构建反义RNA表达载体pcDNA3.1-as-myc,建立了as-myc四元复合体基因转移系统,经HepG2.2.15细胞系瞬时转染,证实c-myc蛋白的表达下降。结论:构建的反义表达载体pcDNA3.1-as-myc具有阻断c-myc表达的效应。     

反义RNA在植物基因工程领域的应用进展

反义RNA广泛存在于各类生物中.它通过与靶RNA进行碱基互补配对的结合方式参与基因表达的调控.目前利用反义RNA技术调控植物基因的表达取得了很大进展,反义RNA在植物基因工程领域主要应用于抑制果实成熟、抗病、作为反向筛选标记基因、控制花色、控制淀粉合成、控制油料种子中脂肪酸的合成、控制雄性不育等方面.此外,通常采用反义RNA技术抑制食物中原有的与所需去除的化学成分合成有关的基因表达,降低或去除食物中的有害化学成分.反义RNA技术的研究尚处于初级阶段,但它作为一门新兴的生物技术必将在今后的农业发展中发挥重要作用.     

反义RNA与肝癌的研究进展

反义RNA是一类能与特异性mRNA互补并从翻译、转录或转录后水平上高度特异地抑制靶基因表达的RNA分子.肝癌是全球最常见且致命的恶性肿瘤.肝癌组织的无限增殖、侵袭转移、放化疗耐受等能力成为其无法治愈并不断恶化的重要原因.反义RNA 在肝癌肿瘤中异常表达,肿瘤的恶性表型维持需要众多反义RNA的参与.近年来,利用反义RNA技术治疗恶性肿瘤已经成为了一个新的研究方向,本文对这一技术治疗肝癌进行了综述.     

反义寡核苷酸作为治疗药物(编译)

反义寡核苷酸与RNA内靶序列互补核酸片段杂交形成DNA—RNA双链,从而阻断信使RNA翻译成蛋白质。化学和分子生物学进展为反义寡核苷酸的发展及改善其选择、稳定和特异的作用提供了基础。反义技术已广泛用于体内、体外实验,成为研究生物过程的调节机制和治疗癌症、病毒感染和遗传紊乱等疾病潜在的药物工具。     

反义肽核酸对树突状细胞CD86表达的抑制作用

目的　探讨 CD86 m RNA反义肽核酸 (peptide nucleic acid,PNA)阻断树突状细胞 CD86表达和第二信号传递的可能作用。方法　采用激光共聚焦显微镜研究生物素化 PNA的细胞内化 ;利用流式细胞术、荧光细胞组织化学以及 RT- PCR研究 CD86反义 PNA对 CD86分子表达的抑制作用。结果　 1激光共聚焦显微镜光学细胞切片证明 ,培养的人未成熟树突状细胞能够有效内化生物素化 PNA。 2流式细胞术和荧光细胞组织化学证实 CD86反义 PNA在蛋白质水平上对 CD86分子表达有抑制作用。 3RT- PCR证明反义 PNA能够抑制 DC CD86m RNA水平。结论　 CD86反义 PNA能够抑制人树突状细胞 CD86 m RNA的表达 ,从而为进一步利用反义 PNA阻断第二信号传递 ,诱导免疫耐受奠定了基础     

反义技术在造血系统疾病研究中的应用

<正> 反义技术是根据碱基互补的原理,用人工合成或生物体生成的与目标靶的DNA或RNA序列特定互补的短核苷酸片段,抑制或封闭基因表达的技术方法。反义技术能够较好地抑制和封闭目的基因的表达,干扰复制、转录和翻译,为肿瘤的基因治疗和基因功能的研究提供了强有力的工具。1978年,Zamecnik和Stephenson首次发现反义RNA能抑制Rous肉瘤病毒在培养细胞中的增殖,展示了反义核酸作为基因水平治疗药物的潜力。1990年美国的基因工程新闻将反义技术列为9O年代十大热点生物技术之一。反义技术在临床应用方面取得了重大进展,目前已有4种反义     

反义同源盒基因的导入对子宫内膜癌AN3CA细胞浸润能力的影响

目的：通过同源盒（HOX）B13、C13基因的反义RNA片段的导入,研究子宫内膜癌细胞浸润能力发生的变化。方法：通过质粒转染技术将反义HOXB13基因片段和反义HOXC13基因片段分别或共同转染到子宫内膜癌AN3CA细胞中;应用Matrigel浸润试验比较转染前后细胞浸润能力发生的变化。结果：转染了HOXB13反义RNA和共同转染HOXB13＋HOXC13反义RNA的AN3CA细胞的浸润能力下降了90%（P〈0.01）,而转染了HOXC13反义RNA的AN3CA细胞的浸润能力没有明显下降。结论：在39种人类HOX基因中虽然只有HOXB13和HOXC13基因在正常的子宫内膜细胞中不表达而在子宫内膜癌的细胞中过量表达,但是只有HOXB13基因与子宫内膜癌的浸润密切相关,HOXC13与子宫内膜癌的浸润能力的增强没有明显相关。     

反义端粒酶RNA与1,25-（OH）2D3抑制肝癌细胞增殖的协同作用

【目的】观察1,25-(OH2)D3对转染反义端粒酶RNA的肝癌细胞增殖的作用。【方法】经脂质体介导,将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212-hTR导入维生素D3受体(VDR)阳性的肝癌细胞株SMMC7721细胞中培养。细胞克隆转移扩大培养,添加1,25-(OH)2D3分别作用于各实验组细胞后,采用四唑蓝比色实验(MTT)和平板克隆形成实验,检测细胞的存活和生长;TUNEL法检测细胞凋亡。【结果】转染组细胞和对照组细胞的端粒酶活性分别为0.686和1.685,说明反义端粒酶RNA可显著降低肝癌细胞端粒酶活性。10 nmol/L浓度的1,25-(OH2)D3对肝癌细胞的增殖具有明显的抑制作用;且较之于单独的1,25-(OH2)D3或转染反义端粒酶RNA对肝癌细胞增殖的抑制作用,在转染反义端粒酶RNA,降低肝癌细胞端粒酶活性后,1,25-(OH2)D3抑制肝癌细胞增殖的作用显著得到增强。各组细胞的凋亡率分别为3.4%、12.2%、8.8%、23.6%。经统计学处理,上述实验结果证实均存在显著的差异(P<0.01)。【结论】在转染反义端粒酶RNA、降低细胞端粒酶活性的基础上,1,25-(OH2)D3抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用进一步得到增强。     

RNA干扰及其在医学中的应用

1995年,Guo等[1]在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义和正义RNA都阻断了基因的表达,他们对这个结果百思不得其解.直到1998年,Fire等[2]研究发现这种抑制并不是单独正义链的作用,而是正义链中污染了反义链后形成的双链RNA所致.     

实验性动脉内膜损伤后抑制血管平滑肌细胞增生的研究

目的 :观察血管内膜损伤后 c- m yc反义 RNA在抑制血管平滑肌细胞 (VSMC)增生、迁移及防止动脉粥样硬化形成和血管再狭窄中的作用。方法 :选雄性日本大白兔 36只 ,经球囊造成腹主动脉内膜损伤的同时 ,局部给予 c- myc反义 RNA、正义 RNA及盐水 ,高胆固醇喂养 12周处死。测量内膜厚度 ,计数增殖细胞核抗原 (PCNA)阳性细胞数。结果 :盐水及正义 RNA对照组动脉内膜明显增厚 (317μm) ,PCNA阳性细胞数明显增多 (6 2 % ) ,可见明显的粥样斑块灶形成。而反义 RNA治疗组内膜增厚度为 2 17μm,PCNA阳性细胞为 30 .5 % ,明显低于对照组 (P <0 .0 1)。结论 :c- myc反义 RNA具有显著抑制 VSMC增生 ,减轻粥样斑块形成的作用。     

反义寡核苷酸治疗白血病的研究现状

反义核酸技术是近十年来肿瘤治疗研究的热点,它包括反义寡核苷酸(又称反义DNA,Antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)、反义RNA、核酶及RNA干扰等技术.其中反义寡核苷酸技术的主要作用原理是根据碱基互补配对原则,利用合成的寡核苷酸选择性地与靶基因mRNA互补结合,干扰或阻止其基因产物的形成,从而达到治疗肿瘤的目的.