蚊防御素基因的克隆及序列分析

目的克隆我国重要蚊媒的防御素基因并对其序列进行分析。方法分别提取埃及伊蚊、白纹伊蚊、致乏库蚊、中华按蚊的基因组DNA和总RNA。根据国外已发表的防御素基因序列设计、合成引物,进行PCR和RT-PCR。结果分别从埃及伊蚊、白纹伊蚊、中华按蚊基因组DNA中扩增出预期片段,将片段切胶纯化后进行序列分析并与已发表的防御素基因比较,显示埃及伊蚊和白纹伊蚊的扩增片段与已发表的防御素基因序列有很高的同源性,而中华按蚊的扩增片段则与已发表的防御素基因序列的同源性较低,且不具备特征性的6 个半胱氨酸序列。结论克隆出埃及伊蚊和白纹伊蚊的防御素基因,蚊虫防御素基因的同源性高低与其遗传分类距离有一定的平行关系。     

白纹伊蚊防御素基因的体外扩增及鉴定

目的 克隆白纹伊蚊的防御素基因并对其进行序列分析。方法 提取白纹伊蚊基因组DNA，根据埃及伊蚊防御素基因序列设计合成引物，PCR产物克隆到T载体中进行测序和分析。结果 从白纹伊蚊基因组DNA中扩增出了约375bP的片段，PCR产物经测序后与已发表的埃及伊蚊防御素基因比较，具有很高的同源性。结论 克隆了白纹伊蚊的防御素基因，为下一步蚊虫防御素蛋白的研究莫定了基础。     

中华按蚊防御素基因的克隆、原核表达及其重组产物生物活性的初步评价

目的 克隆、原核表达中华按蚊的防御素基因，并对其表达产物的生物学活性进行评价。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊防御素基因序列设计合成两对引物．以中华按蚊成蚊cDNA为模板进行PCR扩增，将预期片段克隆测序并进行分析；根据表达质粒pET32a( ）上的克隆位点及测序结果设计PCR引物．将截短的基因片段重组入质粒pET32a( )中进行表达．纯化表达产物并进行体外抑菌试验。结果 PCR扩增产物大小约270bp．目的基因的序列与冈比亚按蚊防御素基因同源性为85％；截取其保守功能区域序列(162bp)．构建成功重组表达质粒pET32a( )-tDEF，含重组质粒的转化菌用IPTG诱导表达后，于Mf26000处可见一预期的特异表达带，该蛋白与抗6-His抗体有特异性的反应；琼脂扩散法显示，纯化的重组防御素融合蛋白未出现抑菌环。结论首次克隆了中华按蚊防御素基冈．其截短片段在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达，但重组融合蛋白不具备抑菌活性。     

中华按蚊防御素基因的克隆、原核表达及其重组产物生物活性的初步评价

目的 克隆、原核表达中华按蚊的防御素基因,并对其表达产物的生物学活性进行评价。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊防御素基因序列设计合成两对引物,以中华按蚊成蚊cDNA为模板进行PCR扩增,将预期片段克隆测序并进行分析;根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及测序结果设计PCR引物,将截短的基因片段重组入质粒pET32a(+)中进行表达,纯化表达产物并进行体外抑菌试验。结果 PCR扩增产物大小约270bp,目的基因的序列与冈比亚按蚊防御素基因同源性为85%;截取其保守功能区域序列(162bp),构建成功重组表达质粒pET32a(+)-tDEF,含重组质粒的转化菌用IPTG诱导表达后,于M_r26000处可见一预期的特异表达带,该蛋白与抗6-His抗体有特异性的反应;琼脂扩散法显示,纯化的重组防御素融合蛋白未出现抑菌环。结论 首次克隆了中华按蚊防御素基因,其截短片段在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,但重组融合蛋白不具备抑菌活性。     

白纹伊蚊和致倦库蚊Wolbachia 16S rRNA序列测定与分析

目的：PCRI地扩增与测定白纹伊蚊和致倦库蚊的细胞内共生菌Wolbachia 16S rRNA序列，分析其种系发生关系及传播方式。方法：从单只雌蚊中提取DNA，PCR法扩增16S rRNA序列，扩增产物进行克隆及测序。结果：从白纹伊蚊和致倦库蚊分别扩增出Wolbachia 16S rRNA序列，并克隆入pGEM-T载体，测序证明两序列长度分别为897bp.结论：成功克隆了白纹伊蚊和致倦库蚊Wolbachia 16S rRNA序列，测序和同源性分析表明，它们之间的同源性为99．9％，提示Wolbachia在白纹伊蚊和致倦库蚊可能存在水平传播的方式。     

白纹伊蚊和致倦库蚊Wolbachia 16S rRNA序列测定与分析

【目的】PCR法扩增与测定白纹伊蚊和致倦库蚊的细胞内共生菌 Wolbachia16SrRNA序列 ,分析其种系发生关系及传播方式。【方法】从单只雌蚊中提取DNA ,PCR法扩增 16SrRNA序列 ,扩增产物进行克隆及测序。【结果】从白纹伊蚊和致倦库蚊分别扩增出Wolbachia 16SrRNA序列 ,并克隆入 pGEM T载体 ,测序证明两序列长度分别为 897bp。【结论】成功克隆了白纹伊蚊和致倦库蚊Wolbachia 16SrRNA序列。测序和同源性分析表明 ,它们之间的同源性为 99 9%,提示Wolbachia在白纹伊蚊和致倦库蚊可能存在水平传播的方式。     

深圳市白纹伊蚊rDNA ITS2区克隆及SNP分析

目的 克隆和序列分析深圳市白纹伊蚊核糖体DNA（rDNA）第2内转录间隔区（ITS2），并探明其rDNA ITS2核酸的特异性及不同个体在rDNA ITS2区的单核甘酸的多态性（sinde Nuclear Polymorphism。SNP），以便利用ITS2基因的高度保守I匿及其蚊媒不种群在ITS2片段的多态性束分子鉴别白纹伊蚊。方法 PCR特异扩增白纹伊蚊rDNA ITS2，利用QIAquick技术从琼脂糖胶上回收纯化扩增的目的ITS2DNA片段，纯化后的目的ITS2DNA片段被连接到TA载体上，在含有青霉素的琼脂糖胶平面上筛选舍目的ITS2DNA片段的阳性克隆，阳性克隆经含有青霉素的LB液体培养基培养，用Ultrapure^TM质粒提取试剂盘提取克隆质粒，用双酶切鉴定插入的片段大小，DNA序列分析仪分析每个蚊rDNArrs2的序列，用生物信息系统进行白纹伊蚊rDNAITS2SNP的差异分析。结果 518bp全长的深圳市白纹伊蚊rDNAITS2被克隆和序列分析．深圳市四个不同地理的白蚊伊蚊rDNAITS2的同一性为97％，而两个地方之间的比较有99％的同一性，其rDNAITS2基因单核苷酸存在转换、颠换和缺失，在518bp的范围内有6个C→T，2个A→G的转换，3A→Ts一个A→C的颠换。3个CG和一个AC缺失。结论 白蚊伊蚊rDN AITS2有高度的保守性，不同个体也表现了单核苷酸的多态性。     

白纹伊蚊垂直传播登革病毒后E基因区部分序列的变化

目的：通过对登革病毒经垂直传播后亲代和子一代蚊体内病毒基因序列的分析，了解登革病毒在流行过程中的变异性。方法：用登革2型病毒(DEN-2)NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株，提取亲代及子一代蚊体内病毒总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增蚊体内DEN-2病毒核酸，对阳性聚合酶链反应(PCR)产物进行序列测定和比较。结果：用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株后，子一代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区序列与亲代蚊体内扩增的序列比较，出现3个位点的突变，分别位于第174，215，336位点；亲代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区部分序列与DEN-2 NGC株E基因区序列相同。结论：DEN-2在垂直传播后出现病毒E基因区的点突变。     

两种蚊虫钠通道基因kdr突变点附近序列的研究

目的 分析白纹伊蚊和致倦库蚊钠离子通道基因kdr突变位点附近的核苷酸序列，为进行抗药性监测奠定基础。方法 根据献报道的两种蚊虫钠离子通道基因序列设计引物，分别以白纹伊蚊和致倦库蚊基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得包含击倒抗性突变位点和一个内含子的钠通道基因片段，将其核苷酸序列与蚊虫钠通道基因cDNA序列进行比较，确定内含子的位置及序列。结果 两种蚊虫的内含子序列变异较大，它们在kdr突变位点附近的序列很保守。结论 该内含子序列的变异并不影响用PCR方法检测这两种蚊虫的拟除虫菊酯抗性。     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。     

家蝇幼虫防御素基因的克隆和序列分析

目的：克隆家蝇幼虫防御素（defensin）基因并进行序列分析。方法：根据Genbank公布的家蝇成虫defensin基因序列设计一对引物,以家蝇幼虫基因组DNA为模板,进行PCR扩增、测序,并利用软件进行序列分析。结果：克隆得到的defensin基因的长度为330bp,编码92个氨基酸,4个阳性克隆的DNA序列编码的多肽在第27位氨基酸残基不同,为K或N。结论：从家蝇幼虫基因组DNA中克隆得到了defensin基因,发现了两种相差一个氨基酸残基的defensin前体蛋白,并初步预测了两种前体蛋白的化学性质和二级结构,为该基因的重组表达奠定了基础。     

Cloning and sequence analysis of β-actin gene from Aedes albopictus （Diptera： Culicidae）

Objective: To obtain the complete β-actin gene from Aedes albopictus. Methods: Total RNA was extracted from C6/36 cells. Degenerate primers were designed based on the β-actin sequences of An. gambiae, Ae. aegypti, Cx. pipiens pallens and D.melanogaster. By RT-PCR, the product was amplified, purified, cloned into the pGT vector and sequenced. The β-actin sequence was aligned and phylogenetically analyzed by the BLAST program and the CLUSTAL W program. Results: A sequence of 1132 bp including an open reading frame of 1131 bp was obtained (GenBank DQ657949). The deduced protein had 376 amino acids.Aligned to SWISS-PROT, it exhibited a high level of identity with β-actins from Anopheles, Drosophila and Culex at the amino acid sequence level. Phylogenetic analysis indicated that Ae. albopictus β-actin was much more homologous with invertebrate β-actin than with vertebrate β-actin. Conclusion: The gene may be used as the internal control in the experiments of Ae. albopictus.     

大劣按蚊感染约氏疟原虫defensins基因的克隆及生物信息学分析

目的为探讨大劣按蚊对约氏疟原虫侵入的免疫反应,克隆大劣按蚊的抗菌肽defensins基因并对基因序列进行生物信息学分析。方法分别提取感染疟原虫的大劣按蚊的蚊胃总RNA,根据冈比亚按蚊defensins基因设计、合成简并引物,进行RT-PCR扩增目的片段,TA克隆后测序并进行序列分析。结果用简并引物的RT-PCR扩增出约氏疟原虫感染的大劣按蚊的189bp目的片段,序列分析表明与冈比亚按蚊defensins有87%同源性,与白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,为大劣按蚊的defensins基因。结论成功克隆并分析了大劣按蚊抗菌肽defensins基因,为进一步的重组表达和研究按蚊抗菌肽的生物活性奠定基础。     

北京市3个公园白纹伊蚊种群Rdl抗性基因突变分析

目的 对北京市3个大型森林公园白纹伊蚊（Aedes albopictus）野外种群的Rdl基因抗性突变进行检测,评估其对γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）受体类杀虫剂的抗性风险。方法 利用序列比对分析获得白纹伊蚊编码GABA受体的Rdl基因序列,通过PCR扩增Rdl基因片段并进行测序,分析与抗性有关位点（第A296和V327位点）的突变情况。结果 白纹伊蚊Rdl基因由10个外显子（Exon）和9个内含子（Intron）组成,编码区（CDS）全长1 608 bp,编码535个氨基酸;白纹伊蚊Rdl基因编码氨基酸序列与埃及伊蚊（Aedes aegypti）和淡色库蚊（Culex pipiens pallens）相应序列的相似性分别为99.63%,与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）相似性为91.55%;在3个公园采集野外白纹伊蚊种群中（90只标本）均未检测到上述Rdl靶标抗性突变,均为敏感型（GCA和GTA）。结论 北京市3个大型的城市森林公园环境中白纹伊蚊种群对环戊二烯类有机氯杀虫剂和苯基吡唑类杀虫剂氟虫腈的靶标（即GABA受体）Rdl基因与其他昆虫表现出不同程度的同源性和高度保守的基因结构特征,3个受试白纹伊蚊野外种群未检测到Rdl基因抗性相关突变,提示以靶标敏感为导向反向研发杀虫剂。     

海南岛库蚊和伊蚊基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段的鉴定和特征描述

目的鉴定和特征描述海南岛蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段。方法 收集海南岛内的库蚊、伊蚊和按蚊,分别提取各类蚊子的总基因组,以此为模板PCR扩增弹状病毒类核蛋白内生病毒片段,并通过测序和分子生物学方法对其特征进行鉴定和描述。结果 在海南岛库蚊和伊蚊基因组中获得弹状病核蛋白内生病毒片段,采用测序和分子生物学方法分析和鉴定了该内生病毒片段在进化上高度保守。结论 数据分析证明蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段与弗兰德斯病毒(Flanders virus)相关,这种病毒在海南岛还没见报导过;初步表明蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段是在蚊子扩散到海南岛来之前就已经整合到蚊子基因组当中的。     

Cloning and sequence analysis of β-actin gene from Aedes albopictus （Diptera. Culicidae）

Objective： To obtain the complete β-actin gene from Aedes albopictus. Methods： Total RNA was extracted from C6/36 cells. Degenerate primers were designed based on the β-actin sequences of An. gambiae, Ae. aegypti, Cx. pipiens pallens and D. melanogaster. By RT-PCR, the product was amplified, purified, cloned into the pGT vector and sequenced. The β-actin sequence was aligned and phylogenetically analyzed by the BLAST program and the CLUSTAL W program. Results： A sequence of 1132 bp including an open reading frame of 1131 bp was obtained （GenBank DQ657949）. The deduced protein had 376 amino acids. Aligned to SWISS-PROT, it exhibited a high level of identity with β-actins from Anopheles, Drosophila and Culex at the amino acid sequence level. Phylogenetic analysis indicated that Ae. albopictus β-acfin was much more homologous with invertebrate β- actin than with vertebrate β-actin. Conclusion： The gene may be used as the internal control in the experiments of Ae. albopictus.