小檗碱通过激活 Nrf2-HO-1/GPX4 通路抑制小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡

目的 探讨小檗碱对于Erastin诱导小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡的保护作用及其可能机制。方法 以HT22小鼠海马神经元细胞为研究对象,分为对照组、Erastin模型组、Erastin+30 μmol/L BBR组、Erastin+60 μmol/L BBR组。采用CCK-8法、特异性 Fe2+ 荧光探针、荧光染料（DAPI）检测和荧光探针（H2DCFH-DA）检测各实验组细胞的增殖情况、活性铁水平、细胞凋亡和活性氧（ROS）变化。 RT-qPCR和Western blot分别检测各实验组细胞的Nrf2、HO-1、GPX4 mRNA和蛋白表达情况。以60 μmol BBR的最适浓度来进一步探究其作用机制,分为对照组、Erastin模型组、Erastin+60 μmol/L BBR组、Erastin+60 μmol/LBBR+2 μmol Nrf2抑制剂 ML385组。通过使用荧光探针和Western blot检测Nrf2抑制剂（ML385）作用后的活性铁的水平、活性氧含量以及Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的表达来验证小檗碱调节的Nrf2-HO-1/GPX4通路对Erastin处理的HT22细胞的保护作用。结果 0.5 μmol/L Erastin作用于HT22细胞8 h,细胞存活率与对照组相比显著被抑制（P<0.05）;同时细胞凋亡、ROS以及活性铁含量增加（P<0.05）。与Erastin组比较,Erastin+30 μmol/L BBR组和Erastin+60 μmol/L BBR组的细胞存活率明显升高（P<0.05）,同时显著降低细胞凋亡、ROS以及活性铁含量（P<0.05）。小檗碱增加 HT22细胞中Nrf2、HO-1、GPX4基因及蛋白的 表达量（P<0.05）。加入Nrf2抑制剂ML385后,Nrf2-HO-1/GPX4通路被抑制,并且ROS以及活性铁含量升高（P<0.05）。结论 Erastin诱导HT22细胞发生铁死亡,小檗碱抑制Erastin诱导的铁死亡,可能机制是激活了Nrf2-HO-1/GPX4通路。     

过氧化氢诱导HUVECs氧化应激模型的构建

目的 利用过氧化氢 (H2O2) 诱导人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 构建体外氧化应激细胞模型.方法 H2O2分6个浓度梯度处理HUVECs不同时间, 倒置显微镜观察细胞形态变化, CCK-8法检测细胞存活率, 流式细胞术检测细胞凋亡率, DCFH-DA荧光探针和流式细胞仪检测细胞内活性氧水平, 筛选H2O2的最佳作用浓度和时间.结果 不同浓度H2O2处理细胞不同时间, 对HUVECs均有损伤作用;400、600、800μmol/L H2O2处理HUVECs 24 h, 细胞存活率显著降低 (P<0.05) , 800μmol/L H2O2作用HUVECs不同时间, 细胞存活率随处理时间延长逐渐降低 (P<0.01) ;各组H2O2处理HUVECs 24 h, 细胞凋亡率显著增加 (1 000μmol/L除外, P<0.05) , 坏死率亦显著增加 (100μmol/L除外, P<0.05) ;800μmol/L H2O2处理HUVECs不同时间, 细胞凋亡率随处理时间延长逐渐增加, 24 h时达到最高 (P<0.05) , 细胞坏死率亦逐渐增加, 48 h时达到最高 (P<0.05) ;各组H2O2作用HUVECs 24 h, 浓度400μmol/L时, 细胞内ROS水平达到最高 (P<0.01) , 800μmol/L H2O2处理HUVECs, 胞内ROS水平随处理时间延长而递增 (P<0.01) .结论800μmol/L H2O2与HUVECs作用24 h可构建体外细胞氧化应激模型.     

青葙皂苷对过氧化氢诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响及机制研究

目的 研究青葙皂苷（Celosins,CES）对H2O2诱导的H9c2凋亡的保护作用。方法 噻唑蓝检测各组细胞活力以确定CES的最佳作用浓度,以及对H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用。细胞分组为：空白对照组、H2O2处理组、低剂量青葙皂苷+H2O2处理组、中剂量青葙皂苷+H2O2处理组、高剂量青葙皂苷+H2O2处理组。利用流式细胞术检测心肌细胞凋亡比例、ROS的产生情况。蛋白印记法（WB）检测凋亡信号通路相关蛋白的表达和Nrf2 /ARE 信号通路相关蛋白表达。结果 （1）青葙皂苷可升高H2O2处理的H9c2细胞活力,差异具有统计学意义(P＜0.05)。（2）青葙皂苷可降低H2O2处理的H9c2细胞凋亡率(P＜0.05)。降低ROS的产生(P＜0.05)。（3）青葙皂苷可降低蛋白细胞质细胞色素C、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、Bax的表达(P＜0.05),升高蛋白Bcl-2、Nrf2 核转位与HO-1的表达(P＜0.05)。结论 CES通过激活Nrf2 /ARE信号通路抑制H2O2诱导的H9c2细胞损伤。     

蛋白激酶C- 核因子相关因子2 调节大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶-1 的表达

目的：探讨蛋白激酶C(PKC)- 红系衍生的核因子相关因子2 (Nrf2) 对香烟烟雾提取物(CSE) 诱导 的大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶-1(HO-1) 表达的影响。方法：将25 只SD 大鼠的气道上皮细胞随机分为对 照组、CSE3h 组、RO318220(PKC 抑制剂) 组、Nrf2 siRNA 组和Nrf2 siRNA+RO318220 组,每组5 只。对照组 用DMEM/F12 正常培养,CSE3h 组用10% CSE 共培养3 h;RO318220 组则用3 mol/L RO318220 预处理0.5 h,余处理同CSE3h 组;Nrf2 siRNA 组先用Nrf2 siRNA 预处理,余处理同CSE3h 组;Nrf2 siRNA+RO318220 组则先用3 mol/L RO318220 和Nrf2 siRNA 预处理,余处理同CSE3h 组。用Western 印迹法分别检测HO-1, Nrf2 和PKC 蛋白表达,细胞免疫化学法观察HO-1 蛋白表达,反转录- 聚合酶链反应(RT-PCR) 法检测HO-1 mRNA 表达,免疫荧光法观察Nrf2 核转位,测定HO-1 活性。结果：CSE 明显诱导Nrf2 核转位,其诱导作 用可被RO318220 阻断。HO-1 蛋白在CSE3h 组强阳性表达,在对照组、RO318220 组、Nrf2 siRNA 组和Nrf2 siRNA+RO318220 组均弱阳性表达。CSE3h 组PKC 蛋白、HO-1 mRNA 和蛋白表达较对照组显著升高,HO-1 活性较对照组明显增强(P<0.05)。PKC 蛋白表达水平在Nrf2 siRNA 组和CSE3h 组无明显差异(P>0.05)。结论： CSE 通过PKC 信号通路诱导Nrf2 核转位,上调HO-1 的表达水平。     

木犀草素对EA.hy926细胞Nrf2信号通路的激活作用及H2O2致氧化损伤的保护作用

目的 研究木犀草素对人脐静脉内皮EA.hy926细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路的影响,及对H2O2诱导的细胞氧化损伤的保护作用。方法 将细胞分成对照组、H2O2处理组、阳性药物(莱菔硫烷)组、不同浓度(5、10、20、40μmol/L)木犀草素组和不同浓度木犀草素(5、10、20、40μmol/L)+H2O2组,采用ARE荧光素酶报告基因、Western blotting和qRT-PCR确证木犀草素对Nrf2信号通路的影响;荧光标记流式细胞仪检测内源性活性氧(ROS)水平;MTT法评价木犀草素对H2O2诱导的EA.hy926细胞的保护作用。结果 木犀草素能够剂量依赖性地增强ARE荧光强度,上调Nrf2及其下游基因血红素加氧酶-1(HO-1)、抗氧化酶NAD(P)H醌氧化还原酶-1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)的蛋白和mRNA表达,降低内源性ROS水平;采用木犀草素和H2O2协同处理细胞,可表现出保护作用。结论 木犀草素可以激活EA.hy926细胞Nrf2信号通路,抑制H2O2诱导的细胞毒性,对EA.hy926细胞具有氧化损伤保护作用。     

核因子E2相关因子2在晶状体上皮细胞抗氧化损伤中的作用*

目的 探讨核因子E2相关因子2（Nrf2）在晶状体上皮细胞抗过氧化氢（H2O2）氧化损伤和凋亡中的作用。方法 通过MTT测定不同浓度H2O2对人晶状体上皮细胞（HLECs）活力的影响；流式细胞术检测正常对照组（不加H2O2），不同浓度H2O2处理组（100、200及300?μmol/L）和Nrf2抑制组（GSK-3β+H2O2 300?μmol/L）活性氧（ROS）及超氧化物酶歧化酶（SOD）的含量；Western blotting检测凋亡相关蛋白剪切型Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）、Bax、Bcl-2、Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白及Nrf2浆蛋白的表达；免疫荧光法检查Nrf2在晶状体上皮细胞的表达和定位。结果 当H2O2浓度为400?μmol/L时，晶状体上皮细胞不可逆死亡。细胞经H2O2处理48?h后，各组ROS的表达量比较，差异有统计学意义（P?<0.05），与正常对照组比较，各处理组ROS含量升高（P?<0.05），Nrf2抑制组与H2O2高浓度组比较，差异无统计学意义（P?>0.05）。处理48 h后，各组SOD的含量比较，差异有统计学意义（P?<0.05）；与正常对照组比较，各处理组的SOD含量降低（P?<0.05），与H2O2高浓度组比较，Nrf2抑制组SOD含量下降（P?<0.05）。处理48?h后，各组Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2表达的比较，差异有统计学意义（P?<0.05），与正常对照组比较，H2O2各个浓度组Caspase-3、Bax降低（P?< 0.05），Bcl-2升高（P?<0.05），与H2O2高浓度组比较，Nrf2抑制组的Cleaved-Caspase-3、Bax升高（P?<0.05），而Bcl-2降低（P?<0.05）；H2O2各浓度组中Nrf2相对表达相应增多且有核内转移的趋势，Nrf2抑制组无Nrf2表达。结论 Nrf2在人晶状体上皮细胞中的表达及核易位能增加抗氧化酶和抗凋亡蛋白的含量，降低促凋亡蛋白含量，从而起到自身抗氧化损伤和抗凋亡的作用。     

金丝桃苷通过激活Keap1/Nrf2/HO-1通路保护小鼠GC-2细胞的氧化损伤

目的 从Keap1/Nrf2/HO-1通路角度研究金丝桃苷（Hyp）对H2O2所诱导的小鼠精母细胞（GC-2）氧化损伤的保护作用。方法 将GC-2细胞随机分为正常组、模型组、氮乙酰半胱氨酸组（阳性组,NAC,2.5 mmol/L)以及金丝桃苷组（50、100、200 μmol/L）,各组按剂量孵育48 h后,除正常组外其余各组细胞加入H2O（2 150 μmol/L）处理2 h,正常组给予等容量培养基。采用CCK-8法检测细胞的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,酶联免疫法检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）活力以及丙二醛（MDA）含量,Western blot和RT-qPCR检测Nrf2、Keap1、HO-1蛋白及mRNA的相对表达水平,免疫荧光法检测Nrf2核转位水平。结果 150 μmol/L H2O2干预2 h可制备GC-2细胞氧化损伤模型。与正常组比较,模型组GC-2细胞增殖率以及SOD、GSH、CAT活力显著降低,MDA含量、细胞凋亡率,Keap1和Nrf2 mRNA表达显著升高（P<0.05）以及Keap1蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较,NAC组和金丝桃苷200 μmol/L组细胞增殖率和SOD、GSH-PX、CAT活力显著升高,MDA含量、细胞凋亡率显著下降（P<0.05）;金丝桃苷200 μmol/L组Keap1 mRNA表达显著下降,HO-1 mRNA表达显著升高（P<0.01）;金丝桃苷200 μmol/L组Nrf2核蛋白（NEs-Nrf2）以及HO-1的蛋白表达显著升高（P<0.05）,Keap1蛋白表达显著下降（P<0.01）;金丝桃苷组出现了明显的核转位现象（P<0.05）。结论 金丝桃苷可能通过激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,对H2O2诱导的GC-2细胞氧化损伤具有保护作用。     

毛钩藤碱对H2O2诱导的大鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及机制

目的：观察毛钩藤碱（HS）对H2O2诱导的大鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用,并初步探讨其机制。方法：选取出生1～2 d的大鼠乳鼠提取原代心肌细胞作为研究对象,用400 μmol/L浓度的H2O2刺激细胞,复制细胞氧化应激模型。将细胞分为4组：Control组、HS组、H2O2组、H2O2+HS组。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞活性,采用Tunel法检测细胞凋亡情况,采用免疫荧光法检测细胞形态结构,采用蛋白质印迹法（Western blot）检测Bcl-2、Bax、Caspase 3、Cleaved-caspase 3、Nrf2及HO-1的蛋白水平表达情况。结果：细胞活力检测结果发现,与Control组比,H2O2处理6、12、24 h,细胞活性均显著降低（P ＜0.01）;与H2O2 组比,H2O2+1 μmol/L HS、H2O2+10 μmol/L HS组细胞活力显著升高（P ＜0.01）;与H2O2组比,H2O2+100 μmol/L HS组细胞活力显著下降（P ＜0.01）。细胞凋亡检测结果显示,与H2O2组比,H2O2+HS组细胞凋亡显著下降（P ＜0.05）,肌节结构相对完整;与H2O2组比,H2O2+HS组细胞Bax/Bcl-2、Cleaved-caspase 3/Caspase 3 蛋白比值下调（P ＜0.05）,Nrf2、HO-1 蛋白表达上调（P ＜0.05）。结论：HS对H2O2诱导的大鼠心肌细胞线粒体凋亡有保护作用,其机制可能通过Nrf2/HO-1信号通路发挥作用。     

二甲双胍激活Nrf2通路对PC12细胞H2O2氧化损伤的机制研究

目的：研究二甲双胍对H2O2诱导的PC12 细胞损伤可能的保护作用机制。方法：使用CCK-8法检测二甲双胍对PC12细胞的细胞活力;建立H2O2损伤PC12细胞的细胞模型,使用CCK-8法和LDH法检测二甲双胍对PC12细胞生存率和LDH释放量,采用Hoechst 33342染色法和流式细胞术检测二甲双胍对PC12细胞的凋亡和ROS水平情况。qPCR和Western blot法检测二甲双胍对Nrf2/HO-1通路mRNA和蛋白表达水平。使用小干扰RNA沉默Nrf2检测二甲双胍对H2O2诱导细胞的保护作用。结果：二甲双胍在浓度0.5、1和2 mmol/L下对PC12细胞不表现毒性作用。预处理二甲双胍可对H2O2造成的PC12细胞损伤产生浓度依赖性保护作用和降低LDH。同时,二甲双胍降低H2O2造成的细胞凋亡和ROS水平。二甲双胍能激活细胞内Nrf2/HO-1通路起到抗氧化保护作用。结论：二甲双胍预处理后通过激活细胞内Nrf2/HO-1通路对H2O2诱导的 PC12 细胞损伤具有保护作用。     

人参皂苷对波动性高糖所致内皮细胞损伤的作用及机制研究

目的观察人参皂苷对波动性高糖所致内皮细胞损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为对照组、波动性高糖模型组及人参皂苷低中高浓度组(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL)。Western blot检测NF-E2相关因子2(Nrf2)的核转位及下游抗氧化蛋白血红素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和醌氧化还原酶(NQO1)的表达;RT-PCR检测下游抗氧化蛋白HO-1、γ-GCS和NQO1的m RNA表达;Western blot检测瞬时转染Nrf2 si RNA质粒后Nrf2总蛋白和核蛋白及下游HO-1、γ-GCS和NQO1蛋白的表达。结果人参皂苷治疗后,HUVECs中的Nrf2核蛋白及下游抗氧化蛋白HO-1、γ-GCS和NQO1表达均明显增强(P0.05)。瞬时转染Nrf2 siRNA质粒后,人参皂苷的治疗作用消失。结论人参皂苷通过促进Nrf2核转位,调控Nrf2/ARE信号通路发挥其抗波动性高糖所致内皮细胞损伤的氧化应激损伤作用。     

异氟烷预处理激活Nrf2-ARE通路保护H9c2心肌细胞缺氧-复氧损伤

目的 研究异氟烷预处理对大鼠胚胎心肌细胞(H9c2)缺氧-复氧损伤及Nrf2-ARE信号通路的影响.方法 用大鼠H9c2细胞低氧模拟缺血性损伤,并将细胞分为空白对照组、缺氧-复氧组、异氟烷预处理组、转染Nrf2 siRNA组、转染非特异性siRNA组(Scramble组)、异氟烷预处理的Scramble组和异氟烷预处理的siRNA组.采用MTT法检测H9c2细胞存活率,TUNEL染色检测细胞凋亡,分别使用硫代巴比妥酸法(TBA)和分光光度法测定MDA和GSH水平,qRT-PCR及Western blot检测Nrf2、HO-1和NQO1基因的表达.结果 与空白对照组比较,缺氧-复氧组细胞活力降低,凋亡细胞数上升,MDA水平升高,GSH水平降低,同时H9c2细胞中Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表达降低,差异均具有统计学意义(JP＜0.01).与缺氧-复氧组比较,异氟烷可提高H9c2细胞活力,降低凋亡细胞数,并降低MDA水平,升高GSH水平,上调Nrf2、HO-1和NQO1的表达(P＜0.05).siRNA转染组Nrf2的mRNA和蛋白表达与缺氧-复氧组和Scramble组相比均降低(P＜0.05),2％异氟烷对siRNA转染组Nrf2 mRNA和蛋白表达均无影响(P＞0.05);经2％异氟烷处理的siRNA转染组H9c2细胞存活率与空白对照组、2％异氟烷处理组和2％异氟烷处理的Scramble组相比降低,凋亡细胞数增多,MDA水平升高,GSH水平降低(P＜0.05).结论 异氟烷预处理对H9c2细胞缺氧-复氧损伤具有保护作用,这种保护作用与激活Nrf2-ARE信号通路有关.     

姜黄素对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡及衰老的影响

目的 探讨姜黄素对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬、凋亡及衰老的影响.方法 体外培养HUVECs,分为对照组(只给予培养基),模型组(给予60 μmol/L H2O2),姜黄素组(给予60μmol/L H2O2+ 10 μmol/L姜黄素),3-MA组[(给予60 μmol/L H2O2+ 10μmol/L姜黄素+1 mmol/L3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine)],培养4d后,DCFH-DA法检测细胞培养液中活性氧(ROS)的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老程度,Western blot技术检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达水平.结果 与对照组相比,模型组ROS含量、凋亡率、SA-β-gal阳性率及p62水平升高(均P＜0.05),而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值差异无统计学意义(P＞0.05).与模型组比,姜黄素组ROS含量、凋亡率及SA-β-gal阳性率及p62水平降低(均P＜0.05),但LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高(P＜0.05).与姜黄素组比较,3-MA组ROS含量、凋亡率、SA-β-gal阳性率及p62水平升高(均P＜0.05),但LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低(P＜0.05).结论 姜黄素可减轻H2O2诱导内皮细胞凋亡及衰老,其机制与提高内皮细胞自噬有关.     

酰化4-羟基查耳酮对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的抗氧化保护作用及初步机制

目的:研究查尔酮化合物B1、B2对过氧化氢(H2O2)诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其对Nrf2/ARE信号通路的影响。方法:建立H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的模型,用MTT法检测化合物B1和B2的抗氧化活性及细胞毒性;用实时荧光定量PCR(real-time PCR)法检测其对转录相关因子Nrf2调控基因谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)、血红素氧合酶-1(HO-1)m RNA表达的影响;用Hoechst染色检测其对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用。结果:分别加了B1、B2的细胞孵育1 h后,B1、B2对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤无保护作用,而孵育24 h后,B1、B2均具有较好的保护作用,两者在浓度为10μmol/L时对细胞无毒性;B1对Nrf2下游GCLC、HO-1基因的表达无明显影响,而B2可明显激活GCLC、HO-1基因的表达,且明显抑制H2O2诱导的PC12细胞的凋亡。结论:B1、B2均对H2O2诱导的PC12细胞损伤具有较好的抗氧化保护作用,B2的作用机制可能是通过激活Nrf2/ARE抗氧化信号通路来实现,B1可能是通过其他机制起到抗氧化作用。     

依托咪酯对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移、铁死亡和Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的 探究依托咪酯对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移、铁死亡和Nrf2/HO-1信号通路的影响。方法CCK-8法检测依托咪酯(0、0.5、1、2、4、8、16、32和64μmol·L-1)对SH-SY5Y细胞活力的影响并计算IC50值；BrdU染色检测细胞增殖；划痕实验检测细胞迁移；DCFH-DA探针检测ROS含量；Western blot法检测增殖相关蛋白(Ki67、Survivin)、迁移相关蛋白(MMP-2、Vimentin、Fibronectin)、铁死亡相关蛋白(xCT、GPX4、DMT1)和Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白(p-Nrf2、Nrf2、HO-1)的蛋白表达水平。结果 与0μmol·L-1依托咪酯组比较，2、4、8、16、32、64μmol·L-1依托咪酯组细胞活力显著降低(均P<0.05),IC50值为17.2μmol·L-1,故选择8、16、32μmol·L-1浓度组进行后续实验。与对照组(0μmol·L-1组)比较，16、32μmol·L-1依托咪酯组BrdU阳性细胞数、划痕愈合率降低(均P<0.05),ROS含量显著升高(P<0.05),Ki67、Survivin、MMP-2、Vimentin、Fibronectin、xCT、GPX4蛋白表达水平显著降低(均P<0.05),DMT1、p-Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。结论依托咪酯可抑制SH-SY5Y细胞增殖、迁移和铁死亡，这可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路实现的。     

小檗碱通过ROS及caspase通路对肝癌HepG2细胞凋亡的作用

目的 探究小檗碱(BBR)对肝癌HepG2细胞的增殖抑制及作用机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度(0、10、20、40、80 μmol/L) BBR对肝癌HepG2细胞的抑制作用;采用Hoechst 33342染色观察处理后HepG2细胞形态学变化;用流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡率;间接荧光标记法检测BBR对细胞内活性氧簇(ROS)水平的影响;JC-1染色法检测细胞内线粒体膜电位的变化;应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、caspase-3、Cleaved-caspase-3的表达变化.结果 MTT法显示BBR可呈剂量、时间依赖性抑制肝癌HepG2细胞活力(P＜0.05);Hoechst 33342染色发现细胞形态发生明显变化,0μmol/L BBR处理的细胞呈淡蓝色,处理组细胞核固缩,形成凋亡小体,细胞凋亡率与药物浓度呈正相关(P＜0.05).流式细胞术发现BBR能使细胞内ROS升高,线粒体膜电位水平下降.Western blot法显示随着药物浓度升高,Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-聚腺苷二磷酸核糖聚合酶表达增强,Bcl-2蛋白表达降低,凋亡相关蛋白caspase-3表达下降.结论 BBR在体外可能通过增加ROS、提高促凋亡蛋白Bax并激活caspase-3表达抑制肝癌HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡.     

高压氧联合血红蛋白对高糖引起的血管内皮细胞损伤的作用

摘要:目的 探究高压氧(HBO)联合血红蛋白(Hb)对高糖诱导的血管内皮细胞活力、侵袭、迁移及小管形成能力的 影响及其调控机制。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),CCK-8法检测不同剂量血红蛋白(2、4、6、8、10 μmol/L)和高压氧(0.10、0.15、0.20、0.25Mpa)对 HUVECs细胞活力的影响。建立高糖诱导的 HUVECs细胞模型,分 为6组:对照组(5.5mmol/L葡萄糖处理48h),甘露醇组(27.5mmol/L甘露醇处理48h),高糖组(33mmol/L葡萄糖 处理48h),高糖+0.25Mpa高压氧组,高糖+6μmol/L血红蛋白组,高糖+0.25Mpa高压氧+6μmol/L血红蛋白组。 通过 CCK-8法检测细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测 LDH 水平;TUNEL 染色观察细胞凋亡情况;免疫印迹 (Westernblot)法检测凋亡相关蛋白表达;划痕实验和 Transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭能力;小管形成实验检测 血管生成;最后通过 Westernblot检测核因子 E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)蛋白表达。结果 随着血 红蛋白或高压氧剂量的不断增加,HUVECs细胞活力未发生显著变化。与对照组相比,高糖组 HUVECs细胞活力、迁 移、侵袭和 小 管 形 成 能 力 下 降,LDH 水 平 升 高,凋 亡 率 增 加,且 Bcl-2、Nrf2 和 HO-1 蛋 白 表 达 减 少,Bax 和 cleaved Caspase-3蛋白表达增加。与高糖组相比,高糖+0.25Mpa高压氧组和高糖+6μmol/L血红蛋白组细胞活力、迁移、侵 袭和小管形成能力升高,LDH 水平降低,凋亡率下降,且 Bcl-2、Nrf2和 HO-1蛋白表达增加,Bax和cleavedCaspase-3蛋 白表达减少;而高压氧和血红蛋白两者联合作用时,影响更为显著。结论 高压氧联合血红蛋白促进高糖作用下 HUVECs的细胞活力、侵袭、迁移及小管形成能力并抑制细胞凋亡,其机制可能与激活 Nrf2/HO-1通路有关。     

右美托咪定调控Nrf2/HO-1通路对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用研究

目的 探讨右美托咪定调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)通路对过氧化氢(H₂O₂)诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用。方法 体外培养大鼠H9C2心肌细胞,设置对照组、H₂O₂组、1μmol右美托咪定+H₂O₂组、5μmol右美托咪定+H₂O₂组、10μmol右美托咪定+H₂O₂组。CCK-8法检测各组H9C2细胞增殖情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组H9C2细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测各组H9C2细胞Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量;Western blotting检测各组H9C2细胞Nrf2、HO-1蛋白相对表达量。结果 与对照组比较,H₂O₂组H9C2细胞存活率、SOD水平、Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白相对...     

毛蕊异黄酮通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻H_2O_2导致的SH-SY5Y细胞损伤

目的探讨毛蕊异黄酮对H_2O_2刺激的SY5Y细胞氧化应激损伤的调控作用及其机制。方法 MTT法检测毛蕊异黄酮对SY5Y细胞活性的影响以筛选合适的药物干预浓度;实验分PBS对照组,H_2O_2(250μmol/L)模型组和H_2O_2(250μmol/L)+毛蕊异黄酮(0.035μmol/m L)干预组;试剂盒检测MDA的含量和SOD的活性;免疫荧光染色检测Nrf2的核内转移情况及HO-1的表达,免疫印迹法检测总Nrf2、核内Nrf2、NQO1和HO-1蛋白水平。结果与PBS对照组比较,H_2O_2组SY5Y细胞活性降低,毛蕊异黄酮可以改善H_2O_2诱导的细胞损伤,降低MDA的含量、增加SOD的活性。同时,毛蕊异黄酮能够激活Nrf2并促进其向核内转位,明显上调H_2O_2损伤后细胞总Nrf2、核内Nrf2、NQO1和HO-1的水平。结论毛蕊异黄酮可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制H_2O_2诱导的SY5Y细胞氧化应激损伤。     

栀子苷对氧化应激所致H9C2心肌细胞损伤的保护作用机制研究

目的探讨栀子苷(GE)对H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法研究于2016年12月—2017年9月在武汉大学心血管病研究所进行。采用过氧化氢(H_2O_2)建立H9C2细胞氧化应激损伤模型。将细胞分为3组:PBS组、H_2O_2组以及H_2O_2+GE组,分别给予磷酸缓冲盐溶液(PBS)、H_2O_2(200μmol/L)、H_2O_2+GE(100μmol/L),刺激后继续培养24 h。检测各组内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,丙二醛(MDA)、活性氧簇(ROS)水平,检测Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(KEAP1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)通路及其下游的血红素加氧酶-1(HO-1)和SOD-1的mRNA水平,CCK-8检测细胞存活率,原位末端缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果 H_2O_2处理后,H9C2心肌细胞内SOD和GSH-Px的活性下降,与H_2O_2组比较,H_2O_2+GE组细胞SOD和GSH-Px活性增加;H_2O_2处理可导致H9C2心肌细胞MDA水平明显升高,栀子苷可抑制这种脂质过氧化产物的产生;H_2O_2可诱导H9c2细胞ROS的产生,栀子苷处理后ROS的水平显著下降。H_2O_2刺激细胞后,KEAP1转录水平上升,Nrf2、HO-1、SOD-1转录水平下降;栀子苷处理后,KEAP1转录水平下降、Nrf2、HO-1、SOD-1转录水平回升;栀子苷明显升高细胞存活率,减轻细胞凋亡。结论栀子苷可通过激活KEAP1/Nrf2通路抑制H_2O_2引起的心肌细胞的氧化损伤。     

HO-1介导H2O2 预处理对PC12细胞氧化应激损伤的适应性细胞保护作用

目的探讨血红素氧合酶-1(HO-1)对H2O2预处理的适应性细胞保护效应的介导作用。方法PI染色流式细胞仪(Flowcytometer,FCM)检测PC12细胞凋亡,流式细胞仪检测PC12细胞HO-1蛋白的表达。结果PC12细胞经10μmol/L H2O2预处理90 min后,20、30、50、100μmol/L H2O2对PC12细胞凋亡的诱导作用明显下降;10μmol/L H2O2预处理90 min后,PC12细胞HO-1蛋白表达量明显增加;给予10μmol/L的HO-1蛋白特异性阻断剂ZnPP后,可显著阻断10μmol/L H2O2预处理90 min对50μmol/L H2O2损伤PC12细胞的保护作用。结论血红素氧合酶-1(HO-1)介导了H2O2预处理对PC12细胞氧化应激损伤的适应性细胞保护作用。