小鼠胚胎神经干细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法:分离孕13～15d的小鼠胚胎脑组织,在加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的B27无血清培养基中克隆培养,并用10%的胎牛血清诱导其贴壁分化,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白(Nestin),β-微管蛋白(β-tublin),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,对神经干细胞(NSCs)及其分化的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞可形成典型的神经球,并传代。细胞表达神经巢蛋白,并可诱导分化为神经细胞和神经胶质细胞。结论:小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下大量增殖,并且具有多向分化潜能。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

大鼠骨髓基质细胞体外增殖分化的实验方法研究

目的:研究大鼠骨髓基质细胞(MSC)在体外增殖分化为神经元样细胞的条件,为MSC的移植提供实验参考。方法:用DMEM冲洗SD大鼠四肢骨的骨髓腔,通过密度梯度离心获得有核细胞后接种于DMEM/10%胎牛血清培养液中,观察在培养液中加入神经生长因子后对MSC的增殖、分化及存活的影响,并以β-巯基乙醇(β-ME)作对照观察MSC分化及分化后的存活情况。结果:在DMEM/10%胎牛血清培养液中加入神经生长因子后MSC增殖速度加快,培养7~9 d后有神经元样细胞形成,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)为(52±9.2)%,神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)为(15±7)%,细胞分化后继续培养仍可存活7 d以上。而用β-ME诱导MSC,6 h后表达NSE为(71.0±8.8)%,GFAP阴性,分化细胞24 h后逐渐死亡。结论:MSC在DMEM/10%胎牛血清培养液中加入神经生长因子后增殖速度加快,可以分化为神经元样细胞,分化细胞存活时间延长。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及分化研究

目的:研究大鼠胚胎神经干细胞体外分离、培养的条件及增殖、分化特性。方法:取胎龄15~17 d的SD大鼠胎脑海马及室周组织,在含碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF),表皮生长因子(EGF),B27、N2添加剂的无血清培养基中培养,用有限稀释法进行克隆、传代,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞克隆球及诱导分化后的细胞。结果:大鼠胎脑能在体外培养获得大量神经干细胞,并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:胚胎脑组织有丰富的神经干细胞,可在体外长期培养并保持干细胞特性,能分化为神经元、胶质细胞等终末细胞。     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法采用机械方法从流产的10～18周胎龄的人胚胎前脑分离神经干细胞,用无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖,进行体外扩增、传代培养.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果从人胚胎前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养.神经细胞球用特异性的鼠抗人巢蛋白(nestin)抗体鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论从人胚胎前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

脑络欣通药物血清与胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞分化的比较

目的:比较脑络欣通药物血清与胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞分化的差异。方法:分别采用脑络欣通药物血清和胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞分化,应用相差显微镜和免疫荧光染色对其进行比较观察。结果:脑络欣通药物血清和胎牛血清均可诱导绝大多数神经干细胞分化成神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。此外,脑络欣通药物血清还能在一定程度上促进培养的神经干细胞的增殖。前者诱导干细胞分化的进程比后者要慢,但其分化的神经细胞在细胞形态学上与发育成熟的神经细胞更为接近。结论:脑络欣通药物血清能够诱导神经干细胞分化,并使其分化更加成熟,且在一定程度上促进培养的神经干细胞的增殖。     

成人视网膜前体细胞的体外分离培养和鉴定

 【目的】对成人视网膜前体细胞进行体外分离、培养和鉴定。【方法】成人眼球12只，“机械分离联合酶消化法”分离出睫状上皮层的色素性细胞。10ng／mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）＋10ng／mL表皮生长因子（EGF）的无血清DMEM／F12培养液中培养，并从三方面鉴定其神经干细胞特性：A．免疫荧光染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白Nestin的表达；B．自我更新能力：原代神经球消化传代后，继续培养观察新神经球的形成；C．多向分化潜能：原代细胞培养4～5d，改用含10mL／L胎牛血清的DMEM/F12培养液。继续培养7～10d，分别用抗神经丝蛋白（NF）抗体、抗微管相关蛋白-2（MAP2）抗体、抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、抗视紫质蛋白抗体、抗β-微管蛋白抗体以及抗无长突细胞特异性抗体作免疫荧光细胞染色。【结果】0．48％±0．08％（1：208）原代细胞在含bFGF＋EGF无血清培养条件下能保持增殖未分化状态。形成神经球样结构，消化传代后90．1％±8．3％的第二代细胞能重新形成新的神经球样结构，具有自我更新能力：原代及传代后的神经球均表达神经干细胞特异性抗原nestin；在含10mL／L胎牛血清的促分化培养液中。细胞分别分化为可表达神经细胞、星形神经胶质细胞和感光细胞等特异性抗原的细胞，表明具有多向分化潜能。【结论】在成人眼睫状体扁平部分离得到具有干细胞特性的视网膜前体细胞，并在体外成功进行培养鉴定。     

培养胚胎神经干细胞向少突胶质细胞诱导分化的实验研究

目的培养大鼠胚胎神经干细胞,诱导分化获得较高纯度的少突胶质细胞。方法取孕11.5 d的胚胎大鼠神经管尾段制备单细胞悬液,无血清条件培养基培养,获得神经干细胞;加入胎牛血清诱导分化,利用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞不同的生长特性进行分离,获取较高纯度的少突胶质细胞。结果本实验得到纯度达90%以上的少突胶质细胞。结论利用培养大鼠胚胎神经干细胞诱导分化可以获取较多较高纯度的少突胶质细胞,以进行进一步研究。     

胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定

目的:建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法,探讨神经干细胞的基本生物学特性.方法:取孕14 d胎鼠大脑皮层,吸管吹打机械分离制成单细胞悬液,采用无血清培养和胎牛血清诱导分化,应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞.结果:从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白(Nestin)免疫阳性并能在体外传代培养,血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白,诱导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin.结论:分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin,并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能,属于中枢神经系统的神经干细胞.     

人脐带血细胞分化为神经样细胞的实验研究

为探讨人脐带血细胞分化为神经样细胞的可行性 ,无菌条件下采集正常人脐血 5 0～ 10 0mL置于加有抗凝剂的采血袋中 ,分离脐血单个核细胞进行培养 ,并加入细胞因子加以诱导分化 ,利用免疫细胞化学方法进行鉴定。结果显示 :脐血单个核细胞能在体外培养中增生分化和表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白 (nestin) ,并最终分化为神经元样和神经胶质样细胞。免疫组化染色可见神经元特异性烯醇化酶 (NSE)和胶质原性纤维酸性蛋白 (GFAP)抗原表达。碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮生长因子 (EGF)协同作用对脐血细胞的分化有促进作用。提示 :脐血单个核细胞具有增生和分化潜能 ,可分化为神经元样及神经胶质细胞样细胞 ,可以作为神经细胞的种子细胞。     

均一的成人骨髓源性神经干细胞的简捷获取

目的 探讨建立具均一性的、未分化且具有神经分化能力的成人骨髓源性神经干细胞（human adult bone marrow-derived neural stem cells,Md-NSCs）的有效获取方案。方法 抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞（human adult bone marrow stromal cells, hMSCs）,贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为Md-NSCs,以诱导培养基于体外诱导培养Md-NSCs向神经系细胞分化;相差显微镜下观察 hMSCs及Md-NSCs的形态学特征;免疫组化法检测Md-NSCs中Nestin的表达,以及由 Md-NSCs诱导分化后得到的神经系细胞中GFAP、NG2及MAP2ab的表达。结果 传代纯化后的hMSCs呈梭形,贴壁生长,增殖旺盛。经10~15d诱导培养,hMSCs可分化为Md-NSCs,其形态为均一性的、呈球形的细胞克隆,不贴壁生长,增殖旺盛,并聚集成神经球结构,Md-NSCs克隆高度表达神经干细胞标志蛋白Nestin。经7~10天诱导培养,Md-NSCs于体外可分化成神经系细胞,分化细胞可表达星形胶质细胞标志蛋白GFAP、少突胶质细胞标志蛋白NG2及神经元细胞标志蛋白MAP2ab。 结论 通过本方案可简捷有效地获得均一的成人骨髓源性神经干细胞,可为体内移植治疗人类神经系统疾病提供丰富而理想的神经干细胞来源。     

新生小牛血清对人胎脑海马组织神经干细胞分化的影响

目的 探讨新生小牛血清对人胎脑海马组织神经干细胞分化的影响。方法 采用细胞培养和免疫细胞组化技术,观察不同浓度新生小牛血清对人胎脑海马组织神经干细胞分化的影响。结果 新生小牛血清能诱导人神经干细胞分化为神经细胞及神经胶质细胞,在无血清培养基与含不同浓度新生小牛血清培养基中培养的神经干细胞分化为神经细胞和神经胶质细胞的数目在发生变化,并且随着新生小牛血清浓度的增加,神经干细胞分化为神经细胞的数量在减少,分化为神经胶质细胞的数量增加。结论 新生小牛血清影响人神经干细胞分化为神经细胞和神经胶质细胞的比例,并与新生小牛血清的浓度有一定的关系。     

Effects of neonatal calf serum on differentiation of human fetal neural stem cells in the hippocampus]

OBJECTIVE: To investigate the effects of neonatal calf serum on the differentiation of human neural stem cells in the hippocampus. METHODS: The effects of various concentrations of neonatal calf serum on the differentiation of human fetal neural stem cells in the hippocampus were observed in cell culture experiment and immunocytochemical staining. RESULTS: Neonatal calf serum efficiently induced the differentiation of human fetal neural stem cells into neurons and astrocytes, whose amount varied between serum-free cell culture and the culture with neonatal calf serum of different concentrations. As the concentration of neonatal calf serum increased, the differentiation of human fetal neural stem cells shifted toward astrocytes, while the differentiation into neurons was decreased. CONCLUSION: Neonatal calf serum causes alteration of the ratio between neurons and glial cells differentiated from human neural stem cells in the hippocampus.     

纹状体组织提取液诱导人胚胎神经干细胞向多巴胺能神经元分化的实验研究

目的体外培养人胚胎神经干细胞并诱导其向多巴胺能神经元分化。方法从临床引产的人胚胎（胎龄8～16周）海马组织中分离、培养人胚胎神经干细胞, 对其进行诱导分化。诱导剂采用来源于20周胎龄胚胎的纹状体的组织提取液。实验分为2组：对照组无诱导剂,培养基为撤除生长因子的基础培养基;实验组培养基中加入纹状体组织提取液50μL/mL;于诱导分化的第7天终止诱导分化,采用标记TH的免疫荧光染色方法检测TH阳性细胞量,用RT-PCR方法检测TH-mRNA的表达情况。结果抗TH的免疫荧光染色结果为：对照组与实验组的TH阳性细胞率分别为(0.53±0.17)%和(7.38±0.84)%,两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。RT-PCR结果显示：对照组TH-mRNA表达不明显,实验组明显表达TH-mRNA,实验组与对照组的TH-mRNA表达差异亦有统计学意义（P＜0.05）。结论纹状体组织提取液具有促进人胚胎神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用。     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

胎鼠、新生鼠和成年鼠神经干细胞的体外增殖和分化

目的比较个体发育不同阶段所得神经干细胞的体外增殖和分化情况。方法常规的神经干细胞分离培养方法，用免疫细胞化学方法鉴定细胞。结果从胎鼠所得的神经干细胞增殖能力最强，新生鼠的次之，成年鼠的较差。神经干细胞的分化更多地决定于培养条件。结论个体发育不同阶段所得的神经干细胞有不同的生物学特性。     

人胚神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：从流产人胚前脑中分离培养人胚神经干细胞。方法：神经干细胞具有自我复制和多向分化潜能。本实验利用神经干细胞特定的培养增殖培养体系分离纯化人胚神经干细胞，并对分离得到的神经干细胞的分子标记及分化潜能进行鉴定。结果：从8~10周龄流产人胚胎分离得到了神经干细胞，它能表达神经干细胞特异性抗原nestin，并能在体外诱导分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论：在人胚中枢神经系统中存在神经干细胞，并能够在体外扩增，为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础。     

躯干神经嵴干细胞体外分离培养及其增殖、分化的实验研究

目的体外分离培养鉴定躯干神经嵴干细胞,探讨其生物学特性,为研究周围神经再生修复提供新的细胞来源。方法取大鼠胚胎躯干部神经管,组织块法培养获取躯干神经嵴干细胞,通过形态学及免疫细胞化学观察其细胞生长、增殖、分化等特性。结果原代培养的躯干神经嵴干细胞呈梭形,其特异性标记物nestin和p75表达阳性,并有较高的增殖活性。传代培养后,在含血清培养基中,其分化细胞呈GFAP、MAP 2、α SMA阳性。结论成功地培养了躯干神经嵴干细胞,细胞表现出多潜能干细胞特性,为研究周围神经组织工程种子细胞来源提供实验依据。     

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究。     

人血小板裂解液替代胎牛血清促进骨髓间质干细胞的增殖

目的探讨人血小板裂解液(human platelet lysates,HPL)对骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖以及生物学特性的影响。方法通过对机采血小板反复冻融获得HPL,采用密度梯度离心法从骨髓中分离MSCs,分别用10%胎牛血清(feotal calf serum,FCS)和LD-DMEM添加不同浓度的HPL进行培养,以确定最佳HPL浓度。分离6株人源MSCs,从原代开始分别用添加胎牛血清和最佳HPL浓度的LD-DMEM进行培养,对两种培养体系下6株不同来源的MSCs的增殖能力,表面标记表达量以及细胞周期进行研究,并利用t-test进行统计学分析,P<0.05视为有统计学差异。结果研究发现HPL中含有MSCs生长所必需的4种生长因子,PDGF-AB(人血小板衍生生长因子AB),bFGF(成纤维细胞生长因子),IGF-1(胰岛素样生长因子1),TGF-β1(转化生长因子β1),浓度分别为:(0.53±0.06)ng/ml,(37.5±4.31)pg/ml,(0.15±0.06)mg/ml,(5150±463)pg/ml。适合MSCs增殖的最佳HPL浓度为7.5%。两种培养条件下的细胞形态无明显区别,均为长梭形。8代以前,细胞增殖能力没有显著性差异(P>0.05),两种培养条件下的MSCs均表达CD105,CD106以及粘附分子CD29和CD44,不表达CD34,CD45,且其表达量没有显著性差异(P>0.05)。两种培养体系下绝大多数细胞处于G0-G1期,FCS培养的MSCs其G0-G1期占(96.97±0.95)%,7.5%的HPL培养的MSCs其G0-G1期占(94.58±1.56)%,两种培养条件下不同周期没有显著性差异(P>0.05)。结论本研究适合MSCs增殖的最佳HPL浓度为7.5%,HPL可以替代胎牛血清体外培养扩增人骨髓间质干细胞,并保持其生物学特性基本不变。