p16~(INK4a)/p14~(ARF)基因在细胞衰老和肿瘤抑制中的作用研究进展

细胞衰老发生后细胞在形态和生化成分都发生改变,进而发生生理性功能障碍,最终进入凋亡和死亡程序。细胞衰老是生命体在细胞水平防止永生化和恶变、预防肿瘤发生的一种机制。细胞衰老由多种原因引起,近年来的研究发现,p16INK4a-pRb(视网膜母细胞瘤抗癌蛋白)和p14ARF-p53这2条途径的活化与细胞衰老的启动和调节过程密切相关,对细胞衰老的信号传导通路及其调节因子等方面的深入研究,可以进一步认识细胞增生、衰老进程,以及防治肿瘤的规律,并为衰老相关疾病的治疗提示研究方向。     

松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响

[目的]研究松花粉对衰老细胞(2BS)内细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21WAF1基因mRNA表达的影响。[方法]2BS细胞从28代开始培养,随机分成年轻对照组(30代)、衰老模型组(56代)、松花粉中剂量(120mg/dl)组(56代)、松花粉高剂量(240mg/dl)组(56代)。流式细胞术分析细胞周期,检测G1期比例;半定量RT-PCR法测定p16INK4a、p21WAF1mRNA的表达。[结果]衰老模型组细胞出现典型的细胞体积增大,形态不规则;松花粉处理组细胞,体积回缩,形态趋于规则。G1期细胞比例松花粉中剂量组(72.73%±1.76%)和高剂量组(64.15%±0.87%)较衰老模型组(81.33%±3.43%)显著下降(P<0.05)。细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4amRNA的表达量在松花粉中剂量组(0.3483±0.0078)和高剂量组(0.3222±0.0055)较衰老模型组(0.3974±0.0078)表达灰阶明显下调。p21WAF1mRNA的表达量在松花粉中剂量组(0.7692±0.1749)和高剂量组(0.4451±0.0363)较衰老模型组(1.1767±0.2782)。[结论]松花粉具有改善细胞衰老的作用,其分子机制可能与下调衰老细胞内细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21WAF11mRNA的表达从而改善衰老细胞G1期阻滞有关。     

p16INK4A诱导的衰老相关基因表达差异

目的检测衰老主导基因p16与衰老相关基因p21、CSIG、TOM1间的相互关系。方法正、反义p16转染人胚肺2倍体成纤维细胞(2Bs)后,用RT-PCR检测p21、CSIG、TOM1的表达,用Western Blot检测p21蛋白的表达。结果p16对p21存在转录后调控作用,正义p16转染细胞TOM1高表达,反义p16转染细胞CSIG高表达。结论衰老主导基因p16与衰老相关基因p21、CSIG、TOM1间存在相互作用,进一步说明了p16在衰老中的主导地位。     

流式细胞术分析p16转染的成纤维细胞

目的研究正义p16转染的2BS(人胚肺二倍体成纤维细胞)与衰老2BS细胞的不同,进一步探讨p16与细胞衰老的相互关系。方法建立稳定表达的2BS/p16,2BS/asp16,和2BS/neo细胞系,并用FACS(流式细胞仪)对各种转染细胞和各阶段正常2BS细胞进行分析。结果正义p16转染的2BS/p16细胞阻滞在G1期和G2/M期,而衰老的2BS细胞仅阻滞在G1期。结论p16对细胞衰老的诱导,伴随着p21的表达变化。     

芦笋多糖对衰老小鼠p16基因表达的影响

目的：研究芦笋多糖对衰老小鼠p16基因表达的影响,探讨芦笋多糖的抗衰老机制。方法：用D-半乳糖建立衰老小鼠模型,以芦笋多糖水煎剂治疗,RT-PCR法观察小鼠脑海马p16基因的mRNA表达。结果：治疗组p16基因mRNA表达降低。结论：芦笋多糖能降低p16基因的表达,从而起到抗衰老的作用。     

A549细胞中过表达p16INK4A引起细胞衰老样表型的研究

目的 研究p16^INK4A对A549肺小细胞腺癌细胞系表型的影响。方法 用pcDNA3-p16质粒转染p16基因缺失的A549肺小细胞腺癌细胞系并通过Northern blot和Western blot鉴定p16基因的异位表达，通过流式细胞仪分析转染后细胞周期变化，利用Western blot和SA—β-pgal染色检测Rb蛋白磷酸化状态的改变和细胞表型变化。结果 证实了在A549中p16^INK4A能稳定表达。p16^INK4A的表达能使细胞产生明显的G1期阻滞并伴随着Rb蛋白磷酸化状态的改变，Rb蛋白主要以低磷酸化形式存在。发生生长阻滞的转染细胞表现出一系列细胞衰老样表型，如细胞体积变大，细胞形态呈明显的扁平状态，并且存在衰老相关半乳糖苷酶阳性染色。结论 在A549细胞中表达p16^INK4A能使细胞发生衰老样表型并提示p16^INK4A在细胞衰老中起重要作用。     

p16INK4a在睾酮干预心肌细胞衰老中的作用及其机制

目的：探讨不同剂量睾酮对小鼠心肌细胞衰老的干预作用及可能机制。方法：用1μM、 100nM、10nM三种剂量睾酮干预自然衰老的小鼠心肌细胞,检测各组衰老相关β-半乳糖甘酶染色阳性细胞率,细胞周期分布,p16INK4a和雄激素受体(AR)mRNA及蛋白表达。结果：与衰老心肌细胞相比,1μM、100nM、10nM睾酮可剂量依赖性的降低衰老相关β-半乳糖甘酶染色阳性细胞率及细胞G0/G1期比例(P<0.05)。睾酮干预亦可剂量依赖性的下调p16INK4a mRNA及蛋白表达,这一作用可被雄激素受体阻断剂所阻断(P<0.05)。AR mRNA及蛋白表达与睾酮剂量呈负相关(P<0.05)。结论：1μM、100nM、10nM睾酮可剂量依赖性的抑制小鼠心肌细胞衰老,这一作用部分是由睾酮通过AR降低p16INK4a表达来实现的。     

p21Waf1／Cip1甲基化调控细胞衰老

目的：探讨 p21Waf1／Cip1启动子甲基化改变对细胞衰老进程的影响。方法采用克隆、测序的方法定量检测p21Waf1／Cip1启动子在人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）衰老过程中的甲基化改变;RT‐PCR和Western blot检测p21Waf1／Cip1的表达;采用5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷去甲基化处理2BS细胞,通过M T T和β‐半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果 p21Waf1／Cip1启动子在年轻2BS中,CpG甲基化的发生率为1．25％;在中年细胞中为27．27％;在衰老2BS细胞中为0．64％;p21Waf1／Cip1的表达在细胞衰老过程中呈波动性变化,先增加,后降低,到细胞开始衰老时,表达又显著增加;中年2BS细胞经5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷处理后,p21Waf1／Cip1表达增加,细胞增殖速率较正常中年细胞显著降低,同时细胞β‐半乳糖苷酶染色阳性率增加。结论 p21Waf1／Cip1去甲基化加速细胞衰老。     

衰老机制的分子水平研究进展

衰老机制复杂,涉及面广,对衰老机制的研究始终是生命科学领域中最基本、最关键的问题。有关衰老的学说繁多,但迄今为止没有一种学说能完全阐释衰老的机制。近年来,随着现代遗传学、细胞生物学、分子生物学等边缘学科的飞速发展,对衰老机制的研究越来越趋向于分子水平。现主要从端粒与端粒酶、衰老与长寿基因、DNA修复能力、线粒体DNA损伤几个方面与细胞衰老的关系进行阐述。     

不同剂量睾酮干预心肌细胞衰老中p16~(INK4a)的表达

目的探讨不同剂量睾酮干预小鼠心肌细胞衰老中p16^INK4a的表达。方法用1μmol／L,100nmol／L,10nmol／L3种剂量睾酮干预自然衰老的小鼠心肌细胞,检测各组衰老相关β-半乳糖甘酶染色阳性细胞率,细胞周期分布,p16^INK4a mRNA及蛋白表达。结果与衰老心肌细胞相比,1μmol．／L,100nmol／L,10nmol／L睾酮可剂量依赖性的降低衰老相关β-半乳糖甘酶染色阳性细胞率及细胞G0／G1期比例（P〈0．05）。睾酮干预亦可剂量依赖性地下调p16^INK4a mRNA及蛋白表达。结论1μmol／L,100nmol／L,10nmoL／L睾酮可通过剂量依赖性地减少p16^INK4a的表达,抑制小鼠心肌细胞衰老。     

抑癌基因与细胞衰老研究进展

大量的文献表明,抑癌基因与细胞增殖调控密切相关,因此,它们与细胞衰老的关系已成为最近几年来人们研究的一个热门课题,p53、p21、p16、RB是目前研究比较深入的几个与细胞衰老相关的抑癌基因。     

Lower Phosphorylation of p38 MAPK Blocks the Oxidative Stress-induced Senescence in Myeloid Leukemic CD34~+CD38~- Cells

Leukemia seems to depend on a small population of "leukemia stem cells (LSCs)" for its growth and metastasis. However, the precise surviving mechanisms of LSCs remain obscure. Cellular senescence is an important obstacle for production and surviving of tumor cells. In this study we investigated the activated state of a pathway, in which reactive oxygen species (ROS) induces cellular senescence through DNA damage and phophorylation of p38 MAPK (p38), in myeloid leukemic CD34+CD38- cells. Bone marrow samples were obtained from patients with acute myeloid leukemia (AML, n=11) and chronic myeloid leukemia (CML, n=9). CD34+CD38- cells were isolated from mononuclear cells from these bone marrow samples, and K562 and KG1a cells (two kinds of myeloid leukemia cell lines) by mini-magnetic activated cell sorting. Hematopoietic stem cells (HSCs) from human cord blood served as controls. Intracellular ROS level was detected by flow cytometry. DNA damage defined as the γH2AX level was measured by immunofluorescence staining. Real-time RT-PCR was used to detect the expression of p21, a senescence-associated gene. Western blotting and immunofluo-rescence staining were employed to determine the p38 expression and activation. The proliferation and apoptosis of CD34+CD38- cells were detected by MTT assay and flow cytometry. Our results showed that ROS and DNA damage were substantially accumulated and p38 was less phosphorated in myeloid leukemic CD34+CD38- cells as compared with HSCs and H2O2-induced senescent HSCs. Furthermore, over-phosphorylation of p38 by anisomycin, a selective activator of p38, induced both the senescence-like growth arrest and apoptosis of CD34+CD38- cells from K562 and KG1a cell lines. These findings suggested that, although excessive accumulation of oxidative DNA damage was present in LSCs, the relatively decreased phosphorylation of p38 might help leukemic cells escape senescence and apoptosis.     

组蛋白乙酰化修饰对IEC-6恶性转化细胞细胞周期和p53、p21WAF1基因表达的调控

目的 分析和探讨IEC-6恶性转化细胞不同时期组蛋白乙酰化修饰对肿瘤发生相关基因表达的影响.方法 采用我们已建立的3个转化期(化学致癌剂MNNG和诱导剂PMA共同作用6、12、24次) 的IEC-6转化细胞进行培养,提取不同转化时期的IEC-6转化细胞的细胞核蛋白,采用免疫印迹检测H3乙酰化水平;并用ChIP及RT-PCR检测组蛋白H3乙酰化对p21WAF1表达的影响.结果 24次IEC-6恶性转化细胞组蛋白H3乙酰化水平高于6次IEC-6转化细胞,而组蛋白H3去乙酰化水平低于6次IEC-6转化细胞;同时发现p21WAF1的启动子区PCR产物减少.在6、12次IEC-6转化细胞中均有较弱的p53、p21WAF1表达;在24次IEC-6恶性转化细胞中仍可检测到较弱的p53表达,但p21WAF1表达缺如.结论 IEC-6恶性转化细胞过程中,组蛋白H3乙酰化水平增高,导致p21WAF1基因表达受抑,近而可能影响转化细胞的细胞周期.     

Lamin C protein deficiency in the primary fibroblasts from a new laminopathy case with ovarian cystadenoma

Background Laminopathies are a group of rare genetic disorders characterized by multiple-tissue degeneration.We describe a new laminopathy with ovarian cystadenoma and explore its molecular etiology.Methods The case is a 15-year-old girl who presents the prominent progeroid disorders, multiple system degeneration and early-onset cystadenoma of the ovary.Candidate genes including LMNA, ZMPSTE24, PPAR G, INSR and WRN were sequenced to screen for DNA variants.The mRNA and protein expression levels of LMNA were examined in primary fibroblasts.The pathophysiological events such as morphologic alterations, cell senescence, cell proliferation,apoptosis and pRb as well as p53 protein expressions were also investigated in primary fibroblasts.Results No mutation was identified in the candidate genes screened.Nuclear abnormalities including nuclear blebs,mislocalization of lamin A/C were evident in the patient fibroblasts.Ultrastructurally, nucleus exhibited nuclear herniation and almost complete loss of peripheral heterochromatin.In addition, lamin C protein expression was markedly reduced whereas lamin A protein level was normal and no prelamin A was detected in the primary fibroblasts.Although the senescence-associated β-galactosidase staining of patient＇ cells was negative, cells in S phase increased in accompany with a decrease in pRb protein expression.Furthermore, increases in apoptotic cell death and p53 expression were observed.Conclusions Our data suggest that selective deficiency of lamin C protein is associated with a case of laminopathy with ovarian cystadenoma.The abnormalities in nuclear structure and alterations in gene expression such as the decrease in pRb and increase in p53 may be responsible for the multiple tissue degeneration.     

p14ARF基因与宫颈癌关系的研究进展

宫颈癌是女性生殖道恶性肿瘤中发病率最高的肿瘤,在女性癌瘤中发病率仅次于乳腺癌。研究表明,细胞周期与细胞癌变关系密切。p1F4ARF基因是近年来报道的专职调控细胞周期的抑癌基因,在肿瘤的发生、细胞周期和细胞凋亡方面都具有至关重要的作用,已成为国内外学者研究的热点。现就p14ARF基因及其与宫颈癌关系的研究现状予以综述。     

抑癌基因p53、nm23、p16在儿童胚芽细胞肿瘤中的表达及意义

目的 初步探讨抑癌基因ｐ５３、ｎｍ２３、ｐ１６在儿童胚芽细胞肿瘤中的表达及意义。方法 对３０例儿童胚芽细胞肿瘤石蜡标本进行免疫组织化学染色,观察肿瘤组织中抑癌基因ｐ５３、ｎｍ２３、ｐ１６的表达情况。结果 在３０例肿瘤标本中有较高的ｐ５３阳性表达率和ｐ１６阴性表达率,均达６３．３％（１９／３０）,有约５０％的病例呈ｎｍ２３阳性表达（１６／３０）,但三种抑癌基因的表达与发病年龄、临床分期、预后及肿瘤部     

乳腺癌干细胞耐放射性与细胞周期的关系

肿瘤的放射疗法是一种建立在细胞周期基础上的治疗方法,乳腺癌干细胞在放疗过程中出现的G2/M期阻滞、衰老途径下调、APE1水平升高及细胞周期调控相关基因p21和p53活性等改变直接或间接导致细胞周期紊乱,均与乳腺癌干细胞的耐放射性密切相关,是分子遗传学和肿瘤生物学研究的热点.     

p70S6K1在结直肠癌中的作用及潜在分子机制

目的 探讨p70S6K1在结直肠癌（CRC）中的潜在分子机制及其与蟾蜍灵的相互作用。方法 运用免疫组织化学染色方法验证p70S6K1在CRC组织中的表达量变化,并探讨其与CRC患者预后的关联性;利用p70S6K1的抑制剂PF-4708671分别通过 MTT、β-半乳糖苷酶染色、细胞周期及划痕实验来检测PF-4708671对细胞生长、细胞衰老、细胞周期和细胞迁移的影响;在CRC细胞中使用蟾蜍灵,观察其对细胞生长及p70S6K1表达水平的影响。结果 与正常对照相比,CRC组织中p70S6K1的表达增加,并与患者预后不良相关。p70S6K1特异抑制剂PF-4708671能降低细胞生长速率、诱导细胞衰老、促进细胞周期阻滞和减弱细胞迁移能力。此外,蟾蜍灵可明显抑制CRC细胞生长,下调p70S6K1的表达。结论 p70S6K1可能是蟾蜍灵的新靶点,其可作为CRC治疗的潜在靶点。