小鼠口服重组LTB和Hp UreB免疫活性的研究

目的 观察重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（rLTB)的粘膜佐剂活性以及重组Hp尿素酶B亚单位（rUreB)的免疫学活性，为制备安全有效的Hp疫苗奠定基础。方法 ELISA检测rLTB的GM1（神经节苷脂）结合活性，利用本室基因工程重组表达的rLTB和rUreB口服免疫BALB/c小鼠后，在第4和/或5周ELISA方法检测血清IgG，以及吃得开液，粪便抽提物，肠粘液sIgA水平，采用^3H掺入实验，检测小鼠脾脏淋巴细胞对特异性抗原的增殖反应。结果 （1）rLTB具有GM1结合活性。（2）与不加佐剂的对照比较，加rLTB的实验组，能够有效地诱发吃得开液及肠道sIgA的产生，（3）口服HprUreB抗原能够刺激小鼠产生特异性的IgG和sIgA。（4）^3HT-dR掺入实验提示加佐剂组较不加佐剂组，脾脏淋巴细胞对特异性抗原的增殖反应更强。（5）不加佐剂组血清IgG，免疫第5周较第4周高；加佐剂则是第4周比第5周高，结论 重组LTB具有良好的粘膜佐剂功能；HprUreB具备良好的免疫原性；小鼠口服rLTB和rUreB后可以产生保护性sIgA;rLTB对Thl/Th2平衡的调节可能是血清IgG合成改变的原因。     

乳糖诱导对幽门螺杆菌UreB、HpaA和大肠杆菌LTKA63、LTB重组蛋白表达的影响

目的:探讨乳糖诱导幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB)、黏附因子(hpaA)和大肠杆菌肠毒素B亚单位(ltB)、A亚单位突变体63(ltKA63)重组基因表达的效果及最佳表达条件.方法:采用BIO-RAD凝胶图象分析系统测定表达的目的重组蛋白产量.采用SDS-PAGE检测不同乳糖浓度、诱导时间和温度对不同生长阶段工程菌重组蛋白表达量的影响,并与异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)比较.结果:乳糖较IPTG更为有效地诱导rHpaA、rUreB、rLTB、rLTKA63的表达.37℃诱导的目的重组蛋白表达量明显高于28℃.rHpaA表达的最佳条件为起始菌液OD600值0.8、50 g/L乳糖,诱导4 h;rUreB和rLTB均为起始菌液OD600值1.2、100 g/L乳糖,诱导5 h;rLTKA63为起始菌液OD600值0.8、100 g/L乳糖,诱导4 h.结论:乳糖较IPTG更有效地诱导上述重组基因表达目的蛋白,且无毒和廉价,为幽门螺杆菌基因工程疫苗工业化生产奠定了有利的基础.     

BALB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌热休克蛋白A疫苗的免疫应答

目的评价重组热休克蛋白A(rHspA)作为幽门螺杆菌(Hp)口服疫苗成分的效果.方法采用重组Hp保护性抗原HspA与粘膜免疫佐剂(霍乱毒素,CT;大肠不耐热肠毒素B亚单位,LTB)共口服免疫BALB/c小鼠,ELISA分析小鼠血清、胃肠粘液中IgA、IgA抗体水平,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况以及IL4、IFN-γ的变化.结果单纯口服rHspA组产生的抗体水平与对照组(PBS)相差不显著,而rHspA 佐剂组与对照组相差非常显著.rHspA 佐剂组小鼠脾淋巴细胞体外培养,在Hp抗原刺激作用下出现明显的增殖反应;不加佐剂免疫组分泌IFN-γ水平增加,IL-4水平未发现增加;而加佐剂免疫组除IFN-γ水平增加外,IL-4水平也发现显著增加.结论BALB/c小鼠口服rHspA和CT以及LTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

BalB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫应答

目的：评价重组尿酶B亚单位（rUreB）作为幽门螺杆菌（Hp)口服疫苗成份的效果、探讨Hp的免疫保护机制。方法：采用重组Hp保护性抗原UreB与粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位（CTB）共口服免疫BalB/c小鼠，ELISA分析血清、唾液和粪便、胃粘液中IgG、IgA抗体水平，体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL－4、IFN－γ的变化。结果：BalB/c小鼠口服rHreB和CTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。结论：rUreB可以作为Hp疫苗成分用于Hp感染的预防和治疗。     

应用纯化抗原检测尿液和血清抗幽门螺杆菌抗体的比较

目的:对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染患者尿液和血清抗Hp抗体进行比较研究,探讨尿液抗Hp抗体检测的临床意义.方法:分别以多株Hp超声上清、重组Hp热休克蛋白A亚单位(rHspA)纯品和重组Hp热休克蛋白尿素酶B亚单位(rUreB)纯品混合物为抗原,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对126例患者的尿液抗HpIgG和血清抗HpIgG、抗HpIgA同时进行检测.结果:使用rHspA和rUreB混合纯品进行检测,其特异性和敏感性明显优于Hp超声上清.诊断Hp感染的优劣顺序为:血清IgG、尿液IgG、血清IgA.结论:尿液的抗体检测可用于Hp感染诊断,尤其是尿液抗HpIgG是一个诊断Hp感染的敏感、特异指标.     

口服抗原预防幽门螺杆菌感染的实验病理研究

目的:研究幽门螺杆菌超声粉碎抗原与霍乱毒素B亚单位组成的口服疫苗预防Hp感染的作用,探讨其保护性免疫应答的机制。方法:用Hp超声粉碎抗原2mg加CTB 10 μg作为免疫预防组,另设单纯Hp超声粉碎抗原组、单纯CTB组和PBS组为对照组。免疫4w后以活菌攻击,观察各组小鼠的免疫保护率,小鼠胃粘膜分泌性IgA抗体变化情况。结果:(1)免疫预防组小鼠免疫保护率为73.33%和对照组全部感染Hp(P <0 .0 0 1) ;(2 )免疫后4w各组小鼠未见明显的炎症反应;Hp攻击感染后4w免疫预防组小鼠可见明显的炎症反应,而各对照组相对较轻(P <0 .0 1) ;(3)Hp攻击前后免疫预防组小鼠局部胃粘膜IgA抗体显著升高(P <0 .0 1)。结论:Hp超声粉碎抗原加CTB可预防Hp感染。     

幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究

目的：口服基因工程疫苗是研发幽门螺杆菌（Hp）疫苗唯一可行的途径。较为肯定的Hp保护性抗原为尿素酶B亚单位和Hp粘附素。大肠杆菌不耐热肠毒素突变体LTK63及其A和B亚单位是目前公认效果较好的粘膜免疫佐剂，霍乱弧菌肠毒素B亚单位适于注射免疫。Hp菌株感染的蒙古长爪沙鼠和SS1株感染的BaLb/C或C57BL/6小鼠是较为理想的动物模型。     

应用纯化抗原检测尿液和血清抗幽门螺杆菌抗体的比较

目的 :对幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)感染患者尿液和血清抗Hp抗体进行比较研究 ,探讨尿液抗Hp抗体检测的临床意义。方法 :分别以多株Hp超声上清、重组Hp热休克蛋白A亚单位 (rHspA)纯品和重组Hp热休克蛋白尿素酶B亚单位 (rUreB)纯品混合物为抗原 ,采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)方法对 12 6例患者的尿液抗HpIgG和血清抗HpIgG、抗HpIgA同时进行检测。结果 :使用rHspA和rUreB混合纯品进行检测 ,其特异性和敏感性明显优于Hp超声上清。诊断Hp感染的优劣顺序为 :血清IgG、尿液IgG、血清IgA。结论 :尿液的抗体检测可用于Hp感染诊断 ,尤其是尿液抗HpIgG是一个诊断Hp感染的敏感、特异指标。     

胃黏膜局部免疫反应在以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗免疫保护中的作用

目的探讨以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌(Hp)疫苗的免疫保护作用及其机理。方法BALB/C小鼠随机分为9组:①空白对照组;②壳聚糖酸溶液组;③壳聚糖颗粒组;④Hp抗原组;⑤Hp抗原+壳聚糖酸溶液组;⑥Hp抗原+壳聚糖颗粒组;⑦Hp抗原+霍乱毒素(CT)组;⑧Hp抗原+壳聚糖酸溶液+霍乱毒素组;⑨Hp抗原+壳聚糖颗粒+霍乱毒素组,各组于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次,免疫后4周给予1×109/ml的SS1Hp菌液0.5ml/只进行攻击,隔日1次,共2次。4周后,采用定量Hp培养和病理改良Giemsa染色法检测胃黏膜内Hp感染。用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测唾液和胃黏膜内抗HpIgA,用定量ELISA法检测胃黏膜内Th1和Th2细胞因子,用SP免疫组织化学法检测胃黏膜内分泌型IgA(sIgA)。结果(1)以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率达60%,与以霍乱毒素为佐剂的Hp疫苗的免疫保护率(58.33%)相似,显著高于单纯Hp抗原组及其他不含Hp抗原组(P<0.01或P<0.05),同时以霍乱毒素+壳聚糖为佐剂的Hp疫苗的保护率为84.62%、85.71%,其Hp的定植评分显著低于无佐剂组及以霍乱毒素为佐剂组(P<0.01或P<0.05)。(2)胃黏膜内sIgA及特异性抗HpIgA水平在壳聚糖为佐剂组与以霍乱毒素为佐剂组无差别(P>0.05),显著高于无佐剂组,而壳聚糖与霍乱毒素联合应用组显著高于单以霍乱毒素为佐剂组(P<0.01或P<0.05)。(3)胃黏膜内白细胞介素(IL)2含量在攻击前各组间差异无统计学意义(P>0.05),攻击后含佐剂组显著高于对照组(P<0.01或P<0.05),且攻击后含Hp抗原各组均显著高于攻击前(P<0.05)。(4)胃黏膜内IL10含量攻击前以壳聚糖为佐剂组显著高于无佐剂组(P<0.01或P<0.05),攻击后各组之间差异无统计学意义(P>0.05),且攻击后含佐剂组均显著低于攻击前(P<0.01)。(5)胃黏膜内IL4含量攻击前以壳聚糖为佐剂组显著高于无佐剂组(P<0.05),攻击后以壳聚糖颗粒为佐剂组显著高于以霍乱毒素为佐剂组(P<0.05),以壳聚糖溶液为佐剂组显著高于对照组、无佐剂组及佐剂中含霍乱毒素组(P<0.01或P<0.05),且攻击后含佐剂组均显著低于攻击前(P<0.01或P<0.05)。结论(1)以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗对Hp感染具有免疫保护作用。并可成功的诱导黏膜局部特异性的体液免疫反应,这可能在其免疫防御中起作用;(2)以壳聚糖为佐剂的Hp疫苗可促进Th1和Th2的混合免疫反应,并可逆转攻击后Th2反应的抑制,恢复Hp感染所致的Th1/Th2失衡,从而发挥其免疫保护作用。     

Th1反应及γ-干扰素在幽门螺杆菌疫苗免疫保护中的作用

目的　探讨磷酸胞苷酰寡核苷酸 (CpG ODN)作为幽门螺杆菌 (Hp)疫苗佐剂的作用及Th1反应与γ 干扰素 (γ IFN)在免疫保护作用中的角色。方法　以Hp全菌超声粉碎物 (WCS)为抗原 ,CpG ODN为佐剂经鼻道或口服免疫小鼠 ,采用 5× 10 6CFU和 5× 10 8CFUHp两个菌量攻击小鼠 ,2周及 8周处死小鼠鉴定感染及炎症情况 ,收集小鼠血清、唾液、胃液 ,ELISA法检测血清中IgG、IgG1、IgG2a及IgA水平和唾液、胃液中IgA水平。流式细胞术检测脾细胞内CD+ 4 和CD+ 8T细胞分泌γ IFN和白细胞介素 4 (IL 4 )的水平。结果　当细菌攻击量由 5× 10 8Hp降至 5× 10 6Hp时 ,滴鼻WCS/CpG组保护率由 70 %提高至 90 % ,无免疫对照组的感染率也由 10 0 %降至 80 %。细菌攻击后2周及 8周时 ,滴鼻WCS/CpG ODN组的血清IgG和IgG2a均高于对照组 (P <0 0 5 ) ;CD+ 4 细胞和CD+ 8细胞中的γ IFN水平也均高于其他各组 (P <0 0 5 )。结论　CpG ODN可作为Hp疫苗佐剂成分 ,其免疫保护作用与Th1反应和γ IFN相关。     

幽门螺杆菌基因重组尿素酶亚单位免疫预防作用的实验研究

目的 评价幽门螺杆菌（Ｈｐ）基因重组尿素酶Ａ、Ｂ亚单位（ｒＵｒｅＡ、ｒＵｒｅＢ）的免疫预防作用。方法 将ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠分为如下７组：阴性对照组（１０只）、霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴＢ）对照组（１０只）、ｒＵｒｅＡ对照组（１０只）、ｒＵｒｅＢ对照组（１０只）、ｒＵｒｅＡ＋ＣＴＢ实验组（３０只）、ｒＵｒｅＢ＋ＣＴＢ实验组（３０只）、Ｈｐ超声粉碎物＋ＣＴＢ实验组（３０只）,胃内分别接种如下物质：１５０ｍｌ     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质研究

目的 分析重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质。方法 重组尿素酶B亚单位注射免疫BALB／c小鼠、家兔，双向琼脂扩散、ELISA、免疫印迹分析特异抗体的产生及性质。结果 重组尿素酶B亚单位能有效刺激机体的免疫应答，且产生的抗体能与天然幽门螺杆菌发生抗原抗体反应。结论 重组尿素酶B亚单位表现出天然幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质，提示可作为幽门螺杆菌特异性抗体检测的包被抗原及幽门螺杆菌疫苗的有效成分。     

过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防小鼠幽门螺杆菌感染

目的 利用人类幽门螺杆菌(H.priori)感染的小鼠模型研究过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防H.pylori感染的作用.方法 把实验动物无特定致病菌C57BL/6小鼠分成7组,分别通过灌胃方法给予过氧化氢酶和尿素酶B亚单位(各100μg)加霍乱毒素(CT)(2 μg)、过氧化氢酶(100 μg)加CT(2 μg)、尿素酶B亚单位(100 μg)加CT(2 μg)、PBS、单纯过氧化氢酶(100μg)、单纯尿素酶B亚单位(100μg)、单纯CT(2μg),共4次.2周后再用活H.pylori灌胃,再4周后处死动物.取胃粘膜行半定量细菌培养检查H. pytori情况.结果 实验各组H.pylori完全保护率分别为:过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加CT组83.3%(20/24)、过氧化氢酶加CT组41.7%(10/24)、尿素酶B亚单位加CT组54.2%(13/24);生理盐水组、单纯过氧化氢酶、单纯尿素酶B亚单位、单纯CT组根除率均为0%.未完全保护的小鼠,疫苗组H. pylori的定植密度明显低于其它4组(P<0.05).此外,二价疫苗组的H. pylori完全保护率及定植密度较单价疫苗组均有显著性差异(P<0.05).结论 由过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加免疫佐剂组成的二价口服疫苗较单价口服疫苗有更好的免疫预防效果.     

幽门螺杆菌重组粘附素rHpaA生物学活性及免疫原性的体外评价

目的：体外评价幽门螺杆菌（Hp)重组粘附素rHpaA的生物学活性及免疫原性,探讨其在Hp疫苗应用中的可行性。方法：流式细胞术和光镜定量计数法检测rHpaA及其抗体对Hp与胃上皮细胞粘附的影响;ELISA法测定Hp感染者血清中抗HpaA抗体,^3H-TDR掺入法测定人外周血淋巴细胞（PBL）对rHpaA的增殖反应,评价rHpaA对体液和细胞免疫的细胞;流式细胞术检测rHpaA对T辅助细胞（Th）表型的选择作用,探讨rHpaA可能的免疫机制。结果rHpaA和抗rHpaA抗血清均能部分阻断Hp与胃上皮细胞系的粘附;ELISA法能检测出Hp阳性患者血清中存在抗HpaA抗体,检测出率与Hp超声破碎抗原（HpSON)包被下的检出率相近（50%vs54%,P＞0．05）;不论培养基中是否加入IL－2,rHpaA均可刺激Hp PBL的增殖（P＜0．05）;Hp阳性或阴性PBL细胞与rHpaA孵育后均能显著提高IL－4阳性T细胞比例（P＜0．05）。结论HpaA是具有免疫原性的Hp菌体成分,且能选择性增加Th2细胞比例,有望成为Hp疫苗研制中一种有效的新抗原。     

Highly efficient expression, purification of recombinant LTB protein and its activity against mucosal immunoadjuvant by nasal immunization

B subunitofEscherichiacoliheat labileenterotoxin(LTB) ,hasbeenregardedasthemostpowerfulmucosalimmunogenandmucosaladjuvant,elicitingstrongimmunoresponsetoco administeredantigens 1,2 Therefore ,muchmorestresshasbeenputonthepreparationofLTB Recently,wehaveestablishedarecombinantLTB (rLTB)preparationsystembywhichwecouldpreparerLTBproteinhighefficiently ,furthermore ,wecarriedoutastudyaboutrLTB’smucosaladjuvantactivity METHODSExpressionofrLTBproteinMarinevibrioVSP6 0wastransformedwith…