脂肪细胞去分化及构建组织工程化脂肪的实验研究

目的 探讨成熟脂肪细胞去分化及去分化脂肪细胞作为种子细胞构建组织工程化脂肪组织的可行性.方法 取健康女性脂肪抽吸术的抽吸物,使用酶消化法获取成熟脂肪细胞.采用天花板贴壁法培养.取第3代细胞进行实验.体外实验:成脂、成软骨和成骨诱导培养,并分别采用油红"O"染色、阿尔辛蓝染色和茜素红染色法鉴定.体内实验:实验组(n=6):取第3代细胞使用荧光染料Dil标记,与纤维蛋白胶混合后注射于裸鼠背部一侧皮下,8周后,从大体观察、组织学、油红"O"染色及荧光显微镜观察新生物形成情况;对照组(n=6):以空白的纤维蛋白胶注射于同一裸鼠背部另一侧皮下,于同一时间点进行检测.结果 成熟脂肪细胞呈单房圆形,经天花板贴壁法培养后变为长梭形成纤维细胞状,即去分化脂肪细胞.去分化脂肪细胞在定向诱导培养下能够分别成脂、成软骨及成骨分化.体内实验中实验组8周后在裸鼠背部皮下有新生组织块形成,经检测后证实其为成熟脂肪块井来源于植入的去分化脂肪细胞,对照组无新生组织形成,纤维蛋白胶被降解吸收.结论 成熟脂肪细胞可通过体外培养实现去分化,去分化脂肪细胞具有成脂、成软骨和成骨等多向分化能力,以去分化脂肪细胞为种子细胞可在裸鼠皮下构建出脂肪组织.     

小鼠棕色脂肪原代培养模型的建立

目的:探索小鼠棕色脂肪细胞原代培养的方法?方法:取C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织,采用胶原酶消化过滤法获得梭形细胞,对培养出来的细胞进行形态学观察,诱导分化后用油红O染色法染色定性,荧光定量PCR检测棕色脂肪标志基因表达情况?结果:培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,诱导分化后分化率高,经油红O染色证实为脂肪细胞,荧光定量PCR检测棕色脂肪标志基因UCP-1表达量明显升高?结论:从C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织中可以分离出具有很强增殖?分化能力的前棕色脂肪细胞,这种棕色脂肪细胞原代培养模型的建立为在体外进一步研究棕色脂肪的功能提供了良好的基础?     

小鼠皮下和内脏前脂肪细胞原代培养模型的建立

目的:探索小鼠皮下和内脏前脂肪细胞的培养方法?方法:取C57BL/6J 小鼠腹股沟皮下脂肪和附睾旁内脏脂肪组织,采用胶原酶消化过滤法获得梭形细胞,对培养的细胞进行形态学观察,诱导分化后用油红O染色法染色定性,荧光定量PCR检测成脂功能标志基因表达情况?结果:培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,诱导后分化率高,经油红O染色证实分离获得的前脂肪细胞可以分化为成熟脂肪细胞,荧光定量PCR检测成脂功能标志基因Fabp4(fatty acid binding protein 4)的表达量明显升高?结论:从C57BL/6J 小鼠腹股沟皮下和附睾旁内脏脂肪组织中可以分离出具有很强增殖?分化能力的皮下和内脏前脂肪细胞,这种前脂肪细胞原代培养模型的建立为在体外进一步研究皮下?内脏脂肪功能的差异提供了良好的基础?     

人眼眶前脂肪细胞的培养和诱导分化及鉴定

目的近来研究显示,人眼眶脂肪组织中的前脂肪细胞可能参与多种疾病的发病过程。文中建立人眼眶前脂肪细胞原代培养模式,对其进行培养、诱导分化及鉴定,以便深入了解人眼眶前脂肪细胞的生物学特性。方法从18～56岁成人眼眶脂肪组织中分别以组织块法及酶消化法分离得到前脂肪细胞,进行形态学观察,成脂诱导分化,并对其进行鉴定。结果 2种方法均可获得前脂肪细胞,细胞为长梭形,呈"S"形生长,可成脂分化,且油红O染色阳性。结论从人眼眶脂肪组织中可分离出纯度高、增殖快、成脂分化率高的前脂肪细胞。     

大鼠前脂肪细胞消化酶原代培养方法改良的探讨

目的:改进大鼠前脂肪细胞的原代培养方法.方法:对Poznanski胶原酶消化法进行改良,包括延长胶原酶消化法时间、3次离心和2次滤网过滤,分化培养后采用油红O染色埘细胞进行鉴定,通过形态学观察、生长曲线的绘制确定原代培养大鼠前脂肪细胞的细胞学特性.结果:用改良后的方法获得大量成份均一、生长旺盛的前脂肪细胞,细胞活力测定90%为活细胞;前脂肪细胞5 d左右进入指数增长期,8 d左右达到平台期,倍增时间约为60 h;在分化培养基的诱导下可以向脂肪细胞分化.结论:实验成功地建立了前脂肪细胞培养体系,较原方法更加有效.     

甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞的培养及分化

【目的】研究甲状腺相关眼病患者(TAO)眼眶组织中是否存在前脂肪细胞，在一定条件下能否分化为成熟脂肪细胞，探讨脂肪细胞在TAO发病中的作用。【方法】选用TAO患者眼眶中的脂肪颗粒，共8例(8只眼)，采用组织块培养法培养细胞，观察细胞形态；细胞免疫组织化学方法检测前脂肪细胞因子-1的表达，初步验证前脂肪细胞的存在；诱导细胞向成熟脂肪细胞分化，油红O染色观察细胞形态及细胞内脂滴形成情况；RT-PCR检测分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)表达的改变。【结果】原代培养细胞为梭形，增殖旺盛；免疫组化显示前脂肪细胞因子-1表达阳性；细胞可分化为成熟脂肪细胞，并伴有PPARγ基因表达的增强。【结论】TAO患者眼眶组织中存在着功能活跃的前脂肪细胞；进一步验证了脂肪细胞数量的增加在TAO发病中的重要作用。     

甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞的培养及分化

[目的]研究甲状腺相关眼病患者(TAO)眼眶组织中是否存在前脂肪细胞,在一定条件下能否分化为成熟脂肪细胞,探讨脂肪细胞在TAO发病中的作用.[方法]选用TAO患者眼眶中的脂肪颗粒,共8例(8只眼),采用组织块培养法培养细胞,观察细胞形态;细胞免疫组织化学方法检测前脂肪细胞因子-1的表达,初步验证前脂肪细胞的存在;诱导细胞向成熟脂肪细胞分化,油红O染色观察细胞形态及细胞内脂滴形成情况;RT-PCR检测分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)表达的改变.[结果]原代培养细胞为梭形,增殖旺盛;免疫组化显示前脂肪细胞因子-1表达阳性;细胞可分化为成熟脂肪细胞,并伴有PPARγ基因表达的增强.[结论]TAO患者眼眶组织中存在着功能活跃的前脂肪细胞;进一步验证了脂肪细胞数量的增加在TAO发病中的重要作用.     

人前脂肪细胞的培养及鉴定

目的研究从皮下脂肪组织中分离人前脂肪细胞的可行性。方法从18-,-40岁成人皮下脂肪组织中以酶消化法分离得到前脂肪细胞。对分离的前脂肪细胞进行形态学观察；以免疫细胞化学方法及成脂诱导分化鉴定前脂肪细胞。结果培养的前脂肪细胞，形态与成纤维细胞类似，增殖、传代快；表达脂肪前体细胞的特异标志aP2、S-100蛋白；前脂肪细胞自发成脂率低，成脂诱导分化率〉95％。结论从人皮下脂肪组织中可以分离出纯度高、增殖快、成脂分化率高的前脂肪细胞。     

成人前脂肪细胞的原代培养

目的探索人前脂肪细胞的原代培养方法.方法取成人的腹部纯脂肪颗粒,采用原代消化细胞培养法培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线并用油红O脂肪染色法进行染色及定性.结果培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高,经动态形态学观察、生长曲线测定及油红O脂肪染色法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞.结论在成熟的脂肪组织中存在着可以增殖并分化成熟、形成脂肪组织的前脂肪细胞.组织工程化的脂肪组织是修复软组织缺损的最佳填充材料,该实验为脂肪组织工程的发展和应用打下了一定的基础.     

胰岛素抵抗患者前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立

目的 探索多囊卵巢综合征(PCOS)胰岛素抵抗(IR)患者的前脂肪细胞原代培养模型.方法 取PCOS IR患者腹部纯脂肪颗粒,采用改进的"贴壁-天花板"法,培养出梭形细胞,同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作对照,采用胰岛素样生长因子-1(IGF-1)为主的脂肪细胞分化培养液,诱导前脂肪细胞的分化.结果 培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高.经形态学动态观察、生长曲线及对IGF-1和地塞米松反应的测定证明其是功能活跃的前脂肪细胞,在体外重现了其增殖、分化的全过程.结论 采用改良"贴壁-天花板"法,能成功地培养出胰岛素抵抗患者前脂肪细胞;采用IGF-1取代胰岛素作为脂肪细胞分化培养液,可以诱导前脂肪细胞的分化.     

大鼠成熟脂肪细胞原代培养方法比较

目的:探寻体外分离培养大鼠成熟脂肪细胞的最佳方法.方法:采用器官培养法、天花板培养法和改良天花板培养法3种不同的原代培养方法,体外培养大鼠成熟脂肪细胞.通过观察显微镜下细胞形态及油红O染色结果,比较3种培养方法所培养的脂肪细胞的差异.结果:3种培养方法均培养出成熟的脂肪细胞,细胞形态一致,其中改良天花板培养法的培养效率最高,培养出的细胞形态最好.结论:改良天花板培养方法是一种长期稳定的大鼠成熟脂肪细胞原代培养方法,为进行脂肪细胞的相关研究提供良好的技术平台.     

人前脂肪细胞的原代培养

[目的]建立人前脂肪细胞原代培养方法,以更深入地研究人体脂肪组织增生的生物学特征.[方法]选用成人的腹部脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞;同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作为对照.[结果]培养出的棱形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高.经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重现了其增殖的全过程.[结论]在成熟的脂肪组织中存在着可分化成熟、生成脂肪的前脂肪细胞.由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,本实验为进一步研究与肥胖及胰岛素抵抗相关的疾病如多囊卵巢综合症等打下了基础.     

成人前脂肪细胞的原代培养

目的 探索人前脂肪细胞的原代培养方法。方法 取成人的腹部纯脂肪颗粒,采用原代消化细胞培养法培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线并用油红O脂肪染色法进行染色及定性。结果 培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高,经动态形态学观察、生长曲线测定及油红O脂肪染色法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞。结论 在成熟的脂肪组织中存在着可以增殖并分化成熟、形成脂肪组织的前脂肪细胞。组织工程化的脂肪组织是修复软组织缺损的最佳填充材料,该实验为脂肪组织工程的发展和应用打下了一定的基础。     

人网膜前脂肪细胞原代培养

目的：建立人网膜前脂肪细胞原代培养方法。方法：选取成人网膜脂肪组织，用原代消化细胞培养法培养出形态均一的梭形细胞，用条件培养基诱导分化，油红O染色进行脂肪细胞鉴定。结果：培养出的细胞形态均一，4-5代以内增殖旺盛。用条件培养基诱导后，细胞形态由梭形向圆形变化，细胞体积增大，胞浆内聚集脂肪颗粒，油红O染色鉴定为成熟的脂肪细胞。结论：人网膜脂肪组织中存在一定数量的前脂肪细胞，予以适当刺激可完成其向成熟脂肪细胞的分化。     

人前脂肪细胞的原代培养

目的：建立人前脂肪细胞原代培养方法,以更深入地研究人体脂肪组织增生的生物学特征。方法：选用成人的腹部脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞;现时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作为对照。结果：培养出的棱形细胞成分均一,增殖旺盛,分率化高。经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重视了其增殖的全过程。结论：在成熟的脂肪组织中存在着可分化成熟、生成脂肪和前缘脂肪细胞。由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,本实验为进一步研究与肥胖及胰岛素抵抗相关的疾病如多囊卵巢综合症等打下了基础。     

人网膜前脂肪细胞原代培养及其生物学特性研究

目的建立人网膜前脂肪细胞原代培养的方法,研究内脏脂肪增生肥大和内分泌功能的生物学特性。方法选取人网膜脂肪组织,采用酶消化细胞原代培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学观察、MTT法测定生长曲线、油红O脂肪染色法进行脂肪细胞鉴定、酶联免疫法测定脂肪细胞因子瘦素和脂联素水平。结果培养出的梭形细胞成分均一。第3天开始增殖,4～9d为指数增长期,倍增时间约为60h。经分化诱导21d约有90％的细胞分化为成熟脂肪细胞。前脂肪细胞可检出低水平瘦素分泌,经诱导分化分泌量持续增多,第17天达峰值（1．6ng·ml^-1·24h^-1）,之后保持高分泌状态至诱导结束;而脂联素直到诱导分化第7天始可检测到低水平分泌,此时光镜下已可见胞质含脂滴的细胞;7～17d分泌逐渐增多,第17天分泌达峰值（99ng·ml^-1·24h^-1）,之后有明显下降趋势。经油红0脂肪染色和瘦素、脂联素分泌检测证实分离培养的细胞为功能活跃的前脂肪细胞。结论成功建立了人网膜前脂肪细胞模型,观察到瘦素和脂联素不同分泌模式。脂联素可作为鉴定前脂肪细胞分化成熟的内分泌功能特异标志物。     

联合培养法进行人牙周膜细胞的比较培养与鉴定

目的 比较消化法与组织块法联合培养与单纯组织块法两种方法获得人牙周膜细胞的成功率及细胞来源鉴定情况.方法 刮取因正畸需要而拔牙的牙周膜,分别进行组织块法和消化法与组织块法联合培养进行人牙周膜细胞的原代培养,并进行波形丝蛋白、角蛋白和碱性磷酸酶(ALP)的检测,以鉴定细胞来源.结果 组织块法在1～2周内有原代细胞游出.在第2或第3天,联合培养法消化游离出来的细胞开始贴壁,消化后的疏松状牙周膜亦可贴壁,且有细胞爬出.组织块法的成功率为27％,联合培养法成功率为70％.ABC免异组化法及ALP鉴定其为非牙龈来源的中胚层细胞.结论 联合培养法可显著提高原代细胞培养的成功率,并在短期内获得大量和相对纯化的实验用细胞.     

姜黄素对SW872细胞增殖及分化的影响

目的探讨姜黄素对SW872前脂肪细胞增殖、分化的影响。方法体外培养SW872脂肪细胞,采用0.6 mmol/L油酸诱导SW872前脂肪细胞分化,MTT法检测不同浓度姜黄素对SW872前脂肪细胞增殖活力的影响;油红O染色观察前脂肪细胞内脂肪的聚积情况。结果低浓度姜黄素对SW872前脂肪细胞没有明显作用;当姜黄素浓度>20μmol/L时,细胞生长速度减缓,细胞增殖受抑制。同时,姜黄素处理细胞24 h,可抑制前脂肪细胞的分化,呈剂量-效应关系。结论姜黄素对SW872前脂肪细胞具有抑制生长和分化的功能。     

平目汤含药血清对人Graves眼病眼眶脂肪细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究平目汤含药血清对前脂肪细胞及成熟脂肪细胞的作用,探讨其治疗Graves眼病的机制。方法:采用组织块法将人Graves眼病眼眶前脂肪细胞原代培养并传代,选用间接免疫荧光技术鉴定;用平目汤药液灌胃SD大鼠制备平目汤含药血清,并配成低(5%)、中(10%)、高(20%)三个剂量组;油红O染色观察前脂肪细胞的诱导分化作用;MTT法检测平目汤对前脂肪细胞增殖的影响;流式细胞术检测平目汤对成熟脂肪细胞凋亡率的影响。结果:(1)通过组织块法成功培养出梭形细胞,间接免疫荧光检测为前脂肪细胞。(2)成功诱导前脂肪细胞分化,油红O染色证实为成熟脂肪细胞。(3)平目汤各组均可显著抑制前脂肪细胞的分化,与空白对照组及地塞米松组比较差异明显。(4)平目汤各组均可下调前脂肪细胞增殖活性,以平目汤中剂量组、干预96 h效果最佳,组间比较差异有统计学意义(P0.05)。(5)平目汤各组成熟脂肪细胞凋亡率明显高于空白对照组(P0.05),以平目汤中剂量组效果最佳。结论:平目汤含药血清可抑制人Graves眼病眼眶前脂肪细胞增殖、促进眼眶成熟脂肪细胞凋亡、减少眼眶脂肪细胞的数量,从而减少眼眶脂肪容积、改善Graves突眼症状。     

促酰化蛋白促进脂肪细胞分化过程中的克隆增殖

目的　观察促酰化蛋白 (ASP)对 3T3 L1前脂肪细胞的分化过程中克隆增殖的影响 ,以进一步探讨ASP诱导前脂肪细胞分化的可能机制。方法　采用3 H胸腺嘧啶掺入法和MTT法分别检测ASP诱导 3T3 L1前脂肪细胞分化过程中DNA合成量及细胞增殖的情况 ,并采用流式细胞术检测诱导分化后细胞周期构成的变化。结果　①ASP组在诱导分化 2 4h时 ,DNA合成量明显增加 ,与对照组相比差异有极显著性意义 (P <0 0 1) ,在 4 8h和 72h时DNA合成量降低 ,与对照组相比差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。②诱导分化 2 4h时 ,ASP组细胞增殖明显 ,与对照组相比差异有显著性意义 (P <0 0 5 ) ;诱导分化 4 8h、 72h时 ,ASP组细胞增殖不明显。③ASP组可促进处于生长停滞期的前脂肪细胞重新进入细胞周期 ,G0 /G1期细胞减少 ,S期的细胞明显增多 ,细胞处于分裂增殖状态。结论　诱导分化过程中 ,ASP可促进 3T3 L1前脂肪细胞发生克隆增殖。ASP促进细胞克隆增殖的作用 ,可能是其诱导前脂肪细胞分化的分子机制之一。