5-Aza-2'-dC通过上调DR4与DR5表达增加TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的敏感性

目的 探讨5-Aza-2'-dC增加肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导乳腺癌细胞凋亡敏感性的作用及其可能机制.方法 5 μmol/L 5-Aza-2'-dC顸处理细胞96 h,TRAIL(0,50,100,200 ng/mL)处理细胞12h,MTT检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,流式细胞技术检测TRAIL受体DR4及DR5的表达,Western blot检测caspase-8蛋白表达水平,Real-time PCR检测细胞DR4、DR5和caspase-8 mRNA表达.结果 5-Aza-2'-dC预处理组与对照组相比,TRAIL对细胞增殖抑制率和诱导凋亡率明显高于对照组(P＜0.05).5-Aza-2'-dC能增加细胞表面DR4和DR5表达,促进凋亡通路关键蛋白caspase-8活化.5-Aza-2'-dC在mRNA水平增加了DR4、DR5和caspase-8的表达.结论 5-Aza-2'-dC增加了TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的敏感性,其可能机制是通过上调DR4、DR5和caspase-8表达实现.     

RAIL泰素帝协同诱导人肺腺癌细胞凋亡的研究

目的：探讨肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL）和化疗药物泰素帝（TXT）联合应用对体外培养人肺腺癌A549细胞的凋亡诱导作用,并初步探讨其作用机制。方法：通过形态学观察和MTT比色法检测TRAIL、TXT及二者联合应用对A549细胞的形态学影响和细胞增殖的抑制作用； Annexin Ⅴ FITC/PI染色，流式细胞术检测A549细胞的凋亡率；半定量RT PCR检测TXT对A549细胞死亡受体DR4、DR5基因表达的影响。结果：①TXT对A549细胞的生长有明显的抑制作用，且呈显著的剂量依赖性，IC50为62.1?ng/ml；而A549对TRAIL不敏感，100?ng/ml的抑制率仅为（6.84±1.14）%，1600?ng/ml的抑制率为（26.10±4.02）%。4?ng/ml TXT与100?ng/ml TRAIL联合应用有显著的协同抑制作用（P＜0.05），抑制率为（19.98±4.15）%；②100?ng/ml TRAIL、4?ng/ml TXT单独作用A549细胞24?h的凋亡率为4.44%和12.26%。100?ng/ml TRAIL与4?ng/ml TXT联合作用A549细胞24?h的凋亡率为16.84%；③4?ng/ml TXT作用前后，死亡受体DR4、DR5mRNA表达水平无明显改变。结论：人肺腺癌细胞A549对TRAIL不敏感，但TRAIL与TXT联合有显著的协同诱导细胞凋亡作用，这种协同作用机制与DR4、DR5的表达无关。     

5-Aza-2′-dC通过上调DR4与DR5表达增加TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的敏感性

目的探讨5-Aza-2′-dC增加肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导乳腺癌细胞凋亡敏感性的作用及其可能机制。方法 5μmol/L 5-Aza-2′-dC预处理细胞96 h,TRAIL(0,50,100,200 ng/mL)处理细胞12 h,MTT检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,流式细胞技术检测TRAIL受体DR4及DR5的表达,Western blot检测caspase-8蛋白表达水平,Real-time PCR检测细胞DR4、DR5和caspase-8 mRNA表达。结果 5-Aza-2′-dC预处理组与对照组相比,TRAIL对细胞增殖抑制率和诱导凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。5-Aza-2′-dC能增加细胞表面DR4和DR5表达,促进凋亡通路关键蛋白caspase-8活化。5-Aza-2′-dC在mRNA水平增加了DR4、DR5和caspase-8的表达。结论 5-Aza-2′-dC增加了TRAIL诱导乳腺癌细胞凋亡的敏感性,其可能机制是通过上调DR4、DR5和caspase-8表达实现。     

p16基因CpG岛过甲基化与其转录失活的探讨

目的　探讨肿瘤细胞 p16基因CpG岛过甲基化对其表达的影响。 方法　利用甲基化特异性PCR (MSP)检测了 4种肿瘤细胞 (SPC A1、BIU 87、T2 4、HepG2 )的甲基化状态 ,并通过RT PCR检测该 4种肿瘤细胞在用去甲基化试剂 5 氮杂脱氧胞苷 (5 Aza CdR)处理前后表达程度的差异。结果　除BIU 87外 ,其它 3种肿瘤细胞p16基因都有不同程度的甲基化 ,用 5 Aza CdR处理后比处理前 p16mRNA的表达有显著升高。 结论　p16基因CpG岛的过甲基化可导致转录表达失活 ,与肿瘤的发生、发展关系密切。     

TRAIL及其受体在多发性肌炎/皮肌炎患者外周血CD3~+T淋巴细胞中的表达

目的:通过检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)患者外周血CD3+T淋巴细胞表面肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其受体DR4、DR5的表达,探讨TRAIL及其受体在PM/DM患者T淋巴细胞凋亡中的作用。方法:采用流式细胞术对44例PM/DM患者和20例健康人的外周血CD3+T淋巴细胞表面TRAIL及其受体DR4、DR5的表达进行检测。用流式细胞术检测外周血单个核细胞的凋亡率。结果:PM/DM组的m TRAIL、DR4、DR5的阳性表达率均显著高于健康对照组(均P<0.05)。不同浓度TRAIL(0,5,10,50,100ng/ml)刺激淋巴细胞24h后,检测其凋亡率,PM/DM组淋巴细胞凋亡率(%)分别为25.63±8.79,33.04±12.31,42.42±10.72,80.74±14.52,69.9±16.99,均显著高于对照组的凋亡率(%):18.72±12.48,23.23±17.00,24.69±9.15,26.64±13.28,20.32±11.07。结论:TRAIL及其受体DR4、DR5在多发性肌炎/皮肌炎患者外周血CD3+T淋巴细胞表面的表达阳性率增高,提示TRAIL介导的细胞凋亡可能在多发性肌炎/皮肌炎的发病机制中发挥一定的作用。     

5-杂氮脱氧胞苷逆转膀胱癌T24细胞死亡相关蛋白激酶的转录表达

目的 研究膀胱癌细胞T24中死亡相关蛋白激酶(DAPK)启动子区的甲基化状态,探讨使用5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-dc)处理T24细胞后对DAPK转录表达的影响及其细胞生物学效应.方法 使用不同浓度去甲基化药物5-aza-dc处理膀胱癌细胞株T24后,使用MTT法、流式细胞仪分别检测5-aza-dc对T24细胞的增殖抑制作用及凋亡率.应用甲基化特异性PCR(MSP)方法分别检测5-aza-dc(12.5 μmol/L)处理前后T24细胞中DAPK启动子区甲基化状态的变化情况.应用RT-PCR、Western-blotting分别检测5-aza-dc(12.5 μmol/L)处理前后T24细胞中DAPK转录、表达的变化情况.结果 MTT法显示不同浓度5-aza-dc对T24细胞有明显的增殖抑制作用,流式细胞仪检测T24细胞的最大凋亡率为(24.12±1.4)%.正常培养条件下T24细胞中DAPK启动子区出现高甲基化且DAPK mRNA无表达,在5-aza-dc(12.5μmol/L)作用24 h后,T24细胞中DAPK启动子区恢复为未甲基化状念且DAPK mRNA及蛋白重新恢复表达.结论 膀胱癌细胞株T24中DAPK启动子区高甲基化可能是抑制其转录表达的重要原因;5-aza-dc可以通过去甲基化作用使DAPK恢复表达,从而抑制T24细胞的增殖并诱导细胞凋亡.5-aza-dc有望成为膀胱癌化疗的有效药物.     

对TRAIL耐药的肝癌细胞caspase-8基因甲基化状态及其mRNA表达

目的研究肝癌细胞株HepG2和SMMC 7721对肿瘤坏死因子相关与凋亡诱配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的敏感性与caspase-8基因启动子区5′CpG岛的甲基化状态和mRNA表达的关系及5′-氮-2′-杂脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对TRAIL抗癌活性的影响.方法采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR method, MSP)方法检测caspase-8基因5′CpG岛甲基化状态;采用RT-PCR方法检测caspase-8 mRNA表达;采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色方法检测细胞凋亡.结果 2株肝癌细胞均属TRAIL耐药细胞,caspase-8基因5′CpG岛均为非甲基化状态; 5-Aza-CdR即不能增加caspase-8 mRNA表达,亦不能提高肝癌细胞对TRAIL的敏感性.结论肝癌细胞对TRAIL的敏感性与caspase-8基因的甲基化状态及mRNA表达无关,5-Aza-CdR不能提高肝癌细胞对TRAIL的敏感性.     

重组人可溶性TRAIL分子诱导细胞凋亡机理探讨

目的探讨重组人可溶性TRAIL蛋白(rhsTRAIL)诱导细胞凋亡的机理.方法应用DNA染料和流式细胞仪定性分别检测rhsTRAIL诱导的细胞凋亡;流式细胞仪检测靶细胞膜表面TRAIL受体表达格局,荧光定量法检测凋亡细胞中Caspase-3活性.结果100ng/ml人可溶性TRAIL蛋白分子对外周血淋巴细胞无明显毒性,但可诱导肿瘤细胞凋亡,不同的肿瘤细胞凋亡率有差异,凋亡范围在26%～57%.不同细胞表面TRAIL受体表达量不同,外周血淋巴细胞的死亡受体DR4、DR5受体表达5%,而诱骗受体DcRl表达55%,相反肿瘤细胞上的DR4、DR5表达高(40%～88%),而DcRl表达很低(8%～17%).rhsTRAIL诱导HL-60细胞发生凋亡,其细胞内Caspase-3活性增高.ActD可增加TRAIL抑制细胞生长活性.结论重组人可溶性TRAIL蛋白分子可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡活性TRAIL受体类型及Caspase-3活性增高有关.     

5-氮杂胞苷对胃癌裸鼠移植瘤死亡受体DR4和DR5表达的影响

[目的]研究5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌裸鼠移植瘤中死亡受体4(DR4)和死亡受体5(DR5)表达的影响.[方法]利用RT-PCR方法检测5-Aza-CdR处理后的胃癌裸鼠移植瘤内DR4和DR5的RNA表达水平、用MS-PCR检测5-Aza-CdR处理后的胃癌裸鼠抑制瘤内DR4和DR5启动子区甲基化水平.[结果]5-Aza-CdR能够抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长.5-Aza-CdR能够逆转胃癌裸鼠移植瘤中DR4和DR5的启动子甲基化水平,并上调DR4和DR5的表达水平.[结论]去甲基化药物5-Aza-CdR能够抑制裸鼠胃癌移植瘤生长,提示该药物有治疗作用且能够诱导DR4和DR5的启动子区去甲基化从而使DR4和DR5的表达水平升高.     

5-氮杂胞苷对HL60细胞P16、DAPK及MGMT基因甲基化状态影响

目的：通过检测5-氮杂胞苷作用于急性早幼粒细胞白血病细胞系（HL60）细胞前后P16、死亡相关蛋白激酶（Death associated protein kinase,DAPK）及6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）基因甲基化状态的改变及基因表达的变化情况,探讨5-氮杂胞苷对髓系白血病细胞系作用的相关机制。方法：采用常规细胞培养,加入5-氮杂胞苷培养48 h后,以甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）检测基因甲基化状态,以RT-PCR检测药物作用前后基因表达水平。结果：MSP显示用药前P16基因、DAPK基因及MGMT基因呈高甲基化状态,应用5-氮杂胞苷处理后P16及DAPK基因发生了完全去甲基化,MGMT基因在用药后发生了部分去甲基化;应用5-氮杂胞苷处理前后P16、DAPK及MGMT基因表达强度分别是（0.22±0.04）与（0.64±0.12）、（0.36±0.08）与（1.27±0.09）及（0.75±0.1）与（1.37±0.1）,３个基因前后表达强度均有统计学差异（P<0.05）。结论：5-氮杂胞苷通过对P16、DAPK及MGMT甲基化基因的去甲基化作用,使这些基因恢复表达,从而抑制髓系白血病细胞系的增殖,发挥肿瘤细胞增殖抑制作用。     

甲基化修饰对宫颈癌细胞凋亡相关蛋白激酶表达的调控

目的 :探讨在 DNA甲基转移酶抑制剂 5 -氮胞苷 ( 5 - azacytidine)的化学干预下 ,宫颈鳞癌细胞 Si Ha和宫颈腺癌细胞 He La中凋亡相关蛋白激酶 ( DAPK)基因与甲基化调控的关系。方法 :培养 Si Ha、He L a,以 1 0μmol/L浓度的 5 -氮胞苷干预细胞。提取细胞RNA,用逆转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)方法检测凋亡相关蛋白激酶基因 m RNA的表达。结果 :He La细胞的 DAPK基因用 5 -氮胞苷干预前后无明显变化。 Si Ha中 DAPK基因表达缺失 ,用 5 -氮胞苷处理后 ,Si Ha中 DAPK基因可重新表达。结论 :在不同类型宫颈癌细胞中 DAPK基因的调控有明显差异。 DAPK基因在宫颈鳞癌细胞中的表达受 DNA甲基化调控 ,在腺癌细胞中则不受甲基化调控     

5-氮-2'-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及ING1bmRNA表达的影响

目的　探讨DNA5'CpG岛去甲基化和组蛋白去乙酰化对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及其mRNA表达的影响。方法　应用特异性DNA甲基转移酶（DNMTs）抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷（5-Aza-2'-dc,以下简称Aza）及组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）作用人结肠癌细胞株HT29后,用甲基化特异性PCR(MSP)检测该ING1b基因核心启动子区域CpG岛甲基化情况,用染色质免疫沉淀(ChIP)检测其乙酰化组蛋白绑定的DNA情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ING1bmRNA表达。结果　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因核心启动子区域存在CpG岛半甲基化,且乙酰化水平低,mRNA表达水平低。经Aza及TSA干预后,ING1b基因核心启动子区域CpG岛转为非甲基化,其乙酰化水平增加,ING1bmRNA表达亦比对照组高。结论　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因5端核心启动子甲基化及乙酰化可能是导致该基因表达沉默的主要原因,Aza逆转HT29人结肠癌细胞株ING1b基因异常甲基化,TSA能较好地提高其组蛋白乙酰化水平,并有效地激活因半甲基化所致ING1b基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

ERα基因启动子甲基化状态对乳腺癌细胞系MTA1 mRNA和蛋白表达水平的影响

目的: 探讨乳腺癌细胞系中雌激素受体α(ERα)启动子甲基化状态的改变对其MTA1 mRNA和蛋白表达水平的影响,阐明ERα启动子去甲基化对MTA1基因表达的作用。方法: 用去甲基化药物5-Aza-dC处理ERα启动子高甲基化状态的MDA-MB-435s和低甲基化状态的MDA-MB-231乳腺癌细胞系为5-Aza-dC处理组,同时设 2种细胞系的未处理组为对照组。甲基化特异性PCR(MSP)法检测各组细胞ERα启动子甲基化状态。Western blotting法检测各组细胞MTA1蛋白表达水平,RT-PCR法检测各组细胞MTA1 mRNA表达水平。结果: 5-Aza-dC逆转了MDA-MB-435s和MDA-MB-231细胞系ERα启动子甲基化状态; MDA-MB-435s乳腺癌细胞系中,与对照组比较,5-Aza-dC处理组MTA1 mRNA及蛋白表达水平均下调(P<0.05);MDA-MB-231乳腺癌细胞系中,与对照组比较,5-Aza-dC处理组MTA1 mRNA及蛋白表达水平亦均下调(P<0.05)。结论: 改变MDA-MB-435s和MDA-MB-231乳腺癌细胞系ERα基因启动子甲基化状态后,MTA1 mRNA和蛋白表达均下降,提示ERα启动子去甲基化后可以下调MTA1基因的表达,二者之间存在调控关系。     

Sonic hedgehog在大肠癌细胞株中表达缺失与其启动子高甲基化有关

目的:研究sonic hedgehog(SHH)在大肠癌细胞株的表达及其调控机制。方法:RT-PCR检测SHH mRNA在大肠癌细胞株HCT-8、SW1116、SW480及LOVO中的表达,去甲基化试验观察5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine)处理细胞株后对SHH mRNA表达的影响,采用亚硫酸盐修饰后测序法检测SHH启动子区甲基化状况。结果:SHH mRNA在HCT-8中仅有弱表达,在SW1116、SW480及LOVO中表达缺失,去甲基化处理后,其表达与对照组相比显著增强(P<0.001);SHH启动子在大肠癌细胞株中为高甲基化状态。结论:SHH在大肠癌细胞株中表达缺失与其启动子高甲基化有关。     

膀胱癌中eya4基因启动子区甲基化状态及其临床意义

目的 探讨膀胱癌细胞系和膀胱移行细胞癌组织中EYA转录共激活磷酸酶4(eya4)基因启动子区CpG岛甲基化状态及在临床病理特征中的意义.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测eya4基因在5株膀胱癌细胞系、1株膀胱永生化上皮细胞系和75例膀胱移行细胞癌组织及癌旁组织,并结合临床病理特征行统计学分析.结果 eya4基因启动子区在5株膀胱癌细胞系中,有4株出现甲基化,其甲基化率为80%;在人正常膀胱细胞系中甲基化阴性.eya4在膀胱癌组织中的甲基化率为70.7%(53/75),显著高于癌旁组织(24%,18/75),差异有统计学意义(x2=32.760,P<0.01).eya4基因启动子区CpG岛甲基化在临床病理特征中如单发膀胱肿瘤与多发膀胱肿瘤相比,直径≤3 cm的膀胱肿瘤与＞3 cm的膀胱肿瘤相比,低级别膀胱肿瘤与高级别膀胱肿瘤相比,浅表性膀胱肿瘤与浸润性膀胱肿瘤相比,差异均有统计学意义(P<0.05),但与年龄和性别无关.结论 基因eya4启动子区甲基化与膀胱癌的发生发展有关,可能作为膀胱移行细胞癌诊断的一个新的标志物.     

5-氮-2′-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株p16/CDKN2基因去甲基化的转录调节作用

目的 探讨DNA5′CpG岛去甲基化对RKO结肠癌细胞株p16／CDKN2抑癌基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响,寻找抗癌治疗的新靶点。方法 用特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine)作用结肠癌细胞株72h后,甲基特异性PCR(Methylation-specific PCR．MSP)、T-A克隆及DNA测序分析甲基化状态,四唑盐(MTT)比色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量PCR(Real-timePCR)、免疫组织化学染色(IHC)及蛋白印迹(Western blot)检测用药前后RKO细胞株生长倍增时间以及对p16／CDKN2 mRNA及蛋白表达的影响。结果 (1)未经5-Aza-deoxycytidine作用的对照组RKO细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经5-Aza-CdR作用的RKO结肠癌细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶;(2)与对照组相比,3组不同浓度5-Aza-2′-deoxycytidine均能明显抑制肿瘤细胞生长,倍增时间分别增加了1．49、1．64、1．87倍;(3)经5-Aza-2′-deoxycytidine作用后,p16／CDKN2基因mRNA表达分别增加了4．89、16．91、19．97倍,而DNA甲基转移酶mRNA表达显著降低;(4)免疫组化染色和蛋白印迹均显示,经处理后的肿瘤细胞p16／CDKN2蛋白表达呈明显增强。结论 DNA异常甲基化与RKO结肠癌细胞有关;特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-2′-deoxycytidine能较好地逆转RKO细胞DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致p16／CDKN2基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长。