卵巢癌血管生成拟态形态学观察和基质金属蛋白酶表达

目的:在卵巢癌腹腔移植瘤模型中进行卵巢癌血管生成拟态的形态学观察并检测基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达情况。方法:卵巢癌细胞SKOV3接种裸鼠腹腔,建立卵巢癌腹腔移植瘤模型,在同一张切片上以抗鼠CD34标记鼠血管内皮细胞,PAS染色行基底膜样结构标记。并应用免疫组化和RT-PCR方法比较MMP2在卵巢癌腹腔移植瘤中央和边缘区域组织的表达差异。结果:卵巢癌腹腔移植瘤中央区域可见卵巢癌细胞围成管状结构,中间可见红细胞,未见CD34阳性细胞出现,PAS阳性物质呈颗粒状弥散分布在卵巢癌细胞浆内,有的贴附在管腔内侧。免疫组化提示MMP2蛋白阳性表达率在肿瘤中央区域组织比肿瘤边缘区域明显增高,RT-PCR分析显示肿瘤组织中央区域MMP2表达与边缘区域相比有显著性差异。结论:卵巢癌细胞分泌PAS阳性物质,可能参与构建肿瘤的血管基质重塑。卵巢癌中央区域可见血管生成拟态,肿瘤中央区域MMP2表达高于肿瘤边缘区域,MMP2表达是否与卵巢癌血管生成拟态形成有关,仍需今后进一步研究。     

胎盘间充质干细胞缺氧培养液对成纤维细胞及巨噬细胞生物学特性的影响

目的探讨胎盘间充质干细胞(p MSCs)缺氧培养液对成纤维细胞及巨噬细胞的作用及机制。方法提取并鉴定胎盘间充质干细胞,ELISA法检测缺氧时p MSCs分泌胰岛素样生长因子1(IGF-1)水平。台盼蓝染色及划痕实验检测p MSCs条件培养液中成纤维细胞增殖及成纤维细胞、巨噬细胞迁移情况。结果成功提取p MSCs,该细胞表达CD29、CD44,不表达CD31、CD34、CD45及HLA-DR。缺氧p MSCs分泌IGF-1增加。p MSCs缺氧培养液中成纤维细胞增殖快于p MSCs常氧培养液(P0.05)。加入IGF-1Ab后,细胞增殖减慢(P0.05)。p MSCs缺氧培养液中成纤维细胞或巨噬细胞迁移快于p MSCs常氧培养液(P0.05)。加入IGF-1Ab后,细胞迁移减慢(P0.05)。结论 p MSCs缺氧培养液促进成纤维细胞增殖及迁移,促进巨噬细胞迁移。其可能与p MSCs在缺氧培养液中分泌IGF-1增多相关。     

人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究

目的探讨人胎盘底蜕膜间充质干细胞(MSCs)体外生物学特性,并验证其多向分化潜能。方法通过酶消化和密度梯度离心法从人足月胎盘底蜕膜中获取MSCs,倒置显微镜下观察其形态变化和生长特点;CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期及表面抗原(CD29、CD44、CD73、CD90、CD34、CD45、CD14)的表达;在特定诱导条件下,使其向成骨、成脂、成软骨方向分化,鉴定其多向分化潜能。结果人足月胎盘底蜕膜中分离的MSCs呈克隆样生长,形态类似于骨髓MSCs,传代后细胞增殖迅速,细胞倍增时间为(2.21±0.21)d;大于70%的细胞处于静止期(G0/G1期),阳性表达CD29、CD44、CD73、CD90,不表达CD34、CD45、CD14;经诱导后茜素红染色、油红O染色和Alcian blue染色均呈阳性表现。结论胎盘底蜕膜中含有丰富的MSCs,易于体外分离培养,且具有多向分化潜能,有希望成为另一新颖的干细胞来源。     

观察大鼠血管平滑肌细胞与间充质干细胞直接接触培养对细胞的诱导分化

目的 观察血管平滑肌细胞与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)直接接触对MSCs向血管成分细胞的诱导分化.方法 分别将MSCs(DAPI标记)与血管平滑肌细胞按一定的比例混合直接接触培养;MSCs加血管平滑肌细胞条件培养液或单独常规培养后,用平滑肌细胞抗体SM-α-actin、Calponin及内皮细胞抗体CD31免疫荧光染色,并观察MSCs的细胞形态变化,检测MSCs的分化情况.结果 MSCs与血管平滑肌细胞混合培养3 d后免疫荧光染色,可见胞核蓝染的MSCs与抗SM-α-actin(绿色),抗Calponin、CD31(红色)的双标细胞出现;5 d后阳性表达率增加.而加血管平滑肌细胞条件培养液或常规单独培养的MSCs抗SM-α-actin阳性,抗Calponin、CD31均为阴性.结论 与血管平滑肌细胞直接接触可以诱导MSCs向血管成分细胞分化.     

成人骨髓间充质干细胞体外培养扩增及其生物学特性研究

目的 建立成人骨髓间充质干细胞 (MSCs)体外培养和扩增的条件 ,探讨其生物学特性。方法 取正常成人骨髓用含10%胎牛血清的LG -DMEM培养液培养、扩增后 ,进行透射电镜观察 ,流式细胞仪行细胞表面抗原及细胞周期分析检测。结果 培养扩增获取的成人骨髓MSCs形态均一 ,增殖能力强 ,细胞扩增至第5代细胞数达 (2～3)×108。该类细胞CD29、CD44、CD166表达阳性 ,CD14、CD34、CD45、HLA -DR表达阴性。细胞周期以G0/G1 期为主。细胞胞浆具丰富粗面内质网。结论 所建立的分离和培养方法可获取骨髓粘附细胞中一组独特的细胞群 ,具有MSCs的生物学特性。     

人正常宫颈组织CD3、CD4、CD8的免疫组织化学定量分析

目的:观察人正常宫颈组织中T细胞的分布、数量,为深入探讨宫颈病变组织、宫颈癌组织中相关T细胞的表达等提供实验资料。方法:采用免疫组织化学SP法和图像分析技术,检测人正常宫颈组织中表面分化抗原CD3、CD4、CD8阳性T细胞的分布、数量和表达强度。结果:CD3阳性细胞主要分布于人子宫颈黏膜上皮及近固有层结缔组织内。CD8阳性细胞广泛分布于人子宫颈黏膜固有层结缔组织内。CD4阳性细胞主要分布于人子宫颈黏膜上皮下固有层结缔组织内和宫颈黏膜腺样隐窝周围的结缔组织内。CD4阳性细胞数略高于CD8阳性细胞。结论:人正常宫颈组织中含有一定的比例的CD3、CD4、CD8阳性T细胞。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养条件,并探讨其生物学特性。方法取无恶性血液病的32~65岁的成人骨髓7例,经密度梯度离心得到单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,将细胞的密度调整到1×106个/mL,接种到12孔培养板中(1 mL/孔)进行培养,48 h后更换新鲜培养液,以后每3 d换液1次。当细胞铺满培养板底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。用流式细胞术检测培养细胞的CD29、CD44、CD166、CD105、CD34、CD45、HLA-DR表达情况。并且使用脂肪细胞诱导培养液诱导培养MSCs,油红O染色检测其能否被诱导分化为脂肪细胞。结果成人骨髓接种后24 h内细胞开始聚集成细胞集落,并从集落中长出少许长梭形细胞,6~15 d细胞进入快速增殖期,一般培养20~25 d后细胞汇合成片铺满培养板底;而传代培养的细胞每代约需10~15 d即可铺满瓶底。流式细胞术检测结果显示,此次培养的骨髓来源细胞高表达CD29、CD44、CD166、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR,符合骨髓MSCs细胞的特性。油红O染色显示MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。结论用密度为1.077 g/mL淋巴细胞分离液作为分离液,密度梯度离心法分离培养的人骨髓MSCs增殖力强,操作简单,是一种较好的分离和培养MSCs的方法。MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘HBV感染状态的免疫组织化学研究

目的：拟从观察胎盘乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染状态，探讨ＨＢＶ宫内传播发生的机制，以期为进一步预防ＨＢＶ宫内传播提供科学依据．方法：采用ＡＢＣ免疫组织化学染色检测ＨＢｓＡｇ阳性孕妇足月分娩胎盘ＨＢｓＡｇ和ＨＢｃＡｇ感染和分布状态．结果：在６２例足月分娩胎盘中，２１例检出了ＨＢｓＡｇ，８例检出ＨＢｃＡｇ．ＨＢｓＡｇ主要分布于蜕膜血管内皮细胞（１８例）、蜕膜细胞（２１例）、滋养层细胞（８例）、绒毛间质细胞（８例）和绒毛血管内皮细胞（５例）的胞浆和绒毛间隙（２１例）中．ＨＢｃＡｇ分布于蜕膜细胞（５例）、蜕膜血管内皮细胞（８例）和绒毛间质细胞（８例）的胞核内．结论：结果提示，ＨＢＶ可在胎盘组织中复制．ＨＢＶ经胎盘感染胎儿的主要途径可能是经血和（或）细胞传递方式实现的．即ＨＢＶ经蜕膜细胞和（或）绒毛间感染滋养层细胞，然后感染绒毛间质细胞，最终感染胎儿毛细血管内皮细胞     

MALT淋巴瘤临床病理分析

目的:观察黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)的临床和病理特点。方法:回顾性分析海南医学院附属医院病理科2000年1月~2010年8月29例MALT淋巴瘤的临床病理资料,通过HE染色和免疫组化染色进行病理组织学观察。结果:29例MALT淋巴瘤中,发生于胃肠道共25例,占86.21%,临床主要表现为胃肠道疾病非特异性症状,其中13例胃MALT淋巴瘤中,HP感染10例,感染率为76.92%;发生于眼眶3例,甲状腺1例。镜下肿瘤组织主要由小淋巴细胞组成,部分病例伴有少量大细胞和淋巴上皮病变。瘤细胞表达B淋巴细胞免疫标记CD20和CD79a,CD5和CD10无表达。结论:胃肠道是MALT淋巴瘤的好发部位,不同部位的MALT淋巴瘤具有共同的细胞形态和免疫表型特征。     

胃肠MALT淋巴瘤临床及病理分析

目的观察胃肠道粘膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤（MALT淋巴瘤）临床和病理特点。方法收集整理中山大学附属第二医院2000年1月-2006年12月间的MALT淋巴瘤的临床资料，通过光镜和免疫组化染色进行病理组织学观察。结果29例MALT淋巴瘤中，多发生于胃，临床主要表现为胃肠道疾病非特异性症状。镜下主要由小淋巴细胞组成，可伴有少量大细胞和淋巴上皮样病变。瘤细胞表达B淋巴细胞免疫标记：CD20和CD79α，部分病例表达CIM3和bcl-2。结论胃肠道MALT淋巴瘤好发于胃，临床症状无特异性，通过常规病理检查和免疫组化染色可以确诊。     

胃肠道粘膜相关淋巴组织型边缘区B细胞淋巴瘤病理观察

目的 探讨胃肠道粘膜相关淋巴组织型边缘区B细胞淋巴瘤(MALT-MZL)的临床病理特点。方法 分析30例MALT-MZL的临床资料，HE光镜特点，应用免疫组化S-P法标记CD20、CD45RO、CD3、CD5、CDl0、CD23、bcl-2以及bcl-10。结果 患以中老年居多，平均51．2岁。临床症状以腹部胀痛为主(占88．9％)。病变粘膜呈脑回状或结节状(50％)、溃疡(43．3％)，活检弹性差(93．3％)。组织学特点：瘤细胞为边缘区B细胞、单核样B细胞．多少不等的小淋巴细胞、浆细胞及转化的大细胞；淋巴上皮病变19例；滤泡克隆化14例。22例免疫组化中，瘤细胞均表达CD20，10例bcl-2 ，均不表达CD45RO、CD3、CD5、CDl0、CD23。16例bcl-10中，5例胞核阳性，11例阴性病例中9例出现胞质着色。12例获得随访资料，1例死于化疗后4年，11例均健在。结论 胃肠道MALT-MZL为低度恶性淋巴瘤，具有一定临床特征，病理以HE形态学为要点，结合免疫组化有助于正确诊断和鉴别诊断。     

粘附分子CD44在舌癌癌旁组织中的表达及意义

目的评价舌鳞状细胞癌癌旁无瘤上皮(ANTE)中粘附分子CD44的表达及与临床病理指标之间的关系。方法应用免疫组织化学的方法分析52例舌癌癌组织和ANTE中CD44的表达。结果CD44在正常口腔粘膜上皮基底细胞层和近基底1/3上皮细胞膜上表达,而在上皮表层细胞无表达。大部分癌组织中CD44低表达或高表达的病例,其ANTE中CD44亦呈相应的低表达或高表达。统计学分析表明,ANTE中CD44的表达水平与临床分期、淋巴结转移、生存周期存在明显的相关性(P<0.05)。结论CD44在ANTE中的表达下调或缺失表达可被认为是舌癌发生和浸润的标志之一,对舌癌的治疗和预后评估有一定的指导意义。     

人胎盘间充质干细胞对脐血淋巴细胞转化的影响

目的从人胎盘中分离间充质干细胞(MSC),研究胎盘MSC在脐血移植中的免疫调节作用。方法分离人胎盘组织灌流液中单个核细胞(MNC)贴壁培养、集落筛选,鉴定表面标志及纯度,向脂肪、成骨诱导鉴定多向分化潜能。应用3HTdR掺入法,观察胎盘MSC对成人外周血淋巴细胞及脐血淋巴细胞的免疫抑制作用。将不同数量胎盘MSC分别与成人外周血和脐血淋巴细胞共培养,加入植物血凝素(PHA)刺激淋巴细胞增殖,观察胎盘MSC对淋巴细胞转化的影响。结果从人胎盘组织中分离获得的贴壁细胞,具有同骨髓MSC相同的细胞表型及多向分化能力,可以显著抑制成人外周血和脐血淋巴细胞转化,抑制作用与MSC的数量呈正相关。与无MSC作用相比,当MSC为2×105/孔时对成人外周血和脐血淋巴细胞转化的抑制率分别为79.97%和64.06%,而当MSC为1.25×104/孔时抑制率则分别为46.83%和12.19%。结论从人胎盘中可以成功地分离出MSC,利用其对脐血淋巴细胞的免疫调节作用,除了可以作为与脐血造血干/祖细胞相适应的培养基质,还有望降低脐血移植中困扰已久的移植物抗宿主疾病(GVHD)问题,促进脐血移植的广泛应用。     

乙肝病毒宫内传播与胎盘感染的关系

目的：母亲乙肝病毒（ＨＢＶ）感染在宫内即可造成其胎儿感染，但其机理尚不清楚，作者试图了解胎盘细胞中ＨＢＶ的感染情况，宫内传播的危险因素和母胎传播的可能途径。     

Retroviral-mediated transfer and functional expression of multidrug resistance gene in human placenta mesenchymal stem cells

Background Most of gynecologic malignancies are sensitive to chemotherapy. Myelosuppression is the main dose-related toxicity of many chemotherapeutic drugs. The human multidrug resistance （mdrl） gene is well known for its ability to confer drug resistance. This study aimed to explore the feasibility of expression and resistance of mdrl gene transduction into human placenta mesenchymal stem cells （P-MSCs） by retrovirus vector. Methods Human P-MSCs were isolated from trypsin-digested term placentas, and their immunophenotypes and differentiation potential were evaluated. Human P-MSCs were transduced by reconstructed retroviral vector containing the mdrl gene and green fluorescent protein （GFP） reporter gene. The integration and expression of the mdrl gene were observed indirectly by the expression of GFP, and fluorescence-activated cell sorter was used to evaluate the functional activity of permeability glycoprotein （P-gp） encoded by the mdrl gene. The stimulating test was made in vitro to show pleiotropic drug resistance of transfected cells. Results The isolated, cultured and expanded P-MSCs expressed stem cell markers such as CD29, CD44 and CD73, and showed osteogenic and adipogenic differentiation potentials under appropriate conditions. The expression of P-gp in the non-transfected P-MSCs cells was （0.4±0.1）%, but increased to （28.1±4.7）% after gene transfection （P〈0.01）. And positive staining of P-gp located mainly at cell membrane and cytoplasm. Accumulation and extrusion assays showed that P-gp expressed by the transfected cells had pump-functional activity and could efflux daunomycin out of cells. The analysis of cell survival confirmed that transfected P-MSCs had a characteristic of multidrug resistance with a significant increase in the resistance to anticancer agents. Conclusions Transfer and expression of human mdrl gene mediated by retrovirus vector conferred P-MSCs drug resistance. It might provide a new alternative to chemoprotection strategies.     

人脂肪干细胞向脂肪细胞的定向分化

目的：分离和培养人脂肪干细胞（hADSCs）,并在体外定向诱导hADSCs分化为脂肪细胞。方法：利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs;应用地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及胰岛素定向诱导hADSCs分化为脂肪细胞。结果：体外分离、培养出高度同源性的hADSCs,hADSCs具有相对特异的细胞表面标志,即CD29、CD73、CD105及CD166呈阳性表达,而CD31及HLA-DR呈阴性表达;hADSCs具有典型的干细胞增殖特点,大部分处于静息期,只有少数细胞处于增殖活跃期;hADSCs能被诱导分化为脂肪细胞。结论：成功地分离、培养出高度同源性的、未分化的hADSCs;体外定向诱导hADSCs可分化为脂肪细胞。