半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2相关新基因Rcet3的克隆

目的 利用NCBI中的DDD(数字差异显示)数据库及RT-PCR技术克隆睾丸等组织中特异表达的新基因.方法 利用NCBI中的DDD数据库首先电子克隆了Rcet3基因,并从成年小鼠睾丸组织中利用RT-PCR克隆出Rcet3全长基因,然后测序及序列分析.结果 序列分析显示,Rcet3基因全长cDNA为610bp,含4个外显子,编码一个140个氨基酸残基的蛋白,该蛋白含一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,但缺少半胱氨酸蛋白酶抑制剂关键的作用位点,而这些位点对半胱氨酸蛋白水解酶的抑制作用足重要的.Rcet3在成年老鼠睾丸、附睾和大脑等生殖域中特异表达,睾丸中的表达高于附睾和大脑,Rcet3与半胱氨酸蛋白酶抑制家族2的Cres亚家族具有相似的特征.结论 Rcet3可能是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2,Cres亚家族中的一个新成员.     

人Smac基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的分析线粒体促凋亡蛋白(Smac)基因启动子区结合蛋白,预测其转录调控因子。方法从基因参考序列数据库获取Smac基因启动子区序列,使用TFSEARCH程序对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。结果成功获得了长度为2 kb的人Smac基因启动子区序列。该启动子区Threshold score≥90的共有71个转录因子结合位点,涉及STAT家族、bZIP家族、叉头蛋白家族、锌指蛋白Kruppel家族、POU家族、runt家族、MYB家族、GATA结合蛋白家族、SOX家族、同源异型框基因家族10个家族的转录因子和1个TATA box。结论 Smac表达的调控是在一定时间或空间上、一种或多种调节蛋白作用的复杂过程。调控Smac的转录因子绝大部分与胚胎发育、性别决定、个体生长密切相关。     

人睾丸细胞中一种新的辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶mRNA剪接变体

目的:研究辅酶II依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)在生殖细胞中的剪接亚型,并对表达蛋白进行预测分析。方法:用快速cDNA末端扩增法从人睾丸细胞株(Hs 181.Tes)中克隆NRDR全长cDNA序列;对获得的序列进行生物信息学分析,通过查找开放阅读框架(ORF),预测并分析剪接新亚型的蛋白质序列和功能:从Hs 181.Tes中克隆了一种新的全长1 164bp的cDNA片段,序列分析表明其属于NRDR缺失4、5外显子的截短剪接体,其ORF可编码237个氨基酸,拥有短链醇脱氢酶家族的保守模序和过氧化物体定位信号。结论:NRDR在不同细胞的基因转录表达调控具有选择性差异,进而表达不同蛋白,构成SDR家族,该新亚型可能参与生殖系统相关酶类的代谢,控制生殖细胞增殖分化。     

大鼠睾丸中SNPH基因表达分析的研究

目的 观察大鼠睾丸不同发育阶段SNPH基因的mRNA表达水平及蛋白分布情况,研究在精子发生中该基因所起的作用,同时也观察SNPH基因在不同组织的蛋白表达水平。方法 提取大鼠中脂肪、心脏、睾丸、脑组织中的蛋白,观察SNPH基因在各组织的表达水平。取出生后21个时间点的大鼠睾丸组织,每个时间点取三只,从中提取总RNA并逆转录成cDNA,借助RT-PCR技术检测SNPH基因的转录表达水平。免疫组化分析65日龄的睾丸组织,观察SNPH蛋白的表达分布情况。结果 SNPH蛋白在脑组织表达最高,其次是睾丸、脂肪,在心肌中表达最少;SNPH基因mRNA表达在第2-31天表达量少,基本不表达,从第35天开始逐渐增加,第45天表达急剧增加,到第65天转录表达最高;SNPH基因在65日龄睾丸生精小管中的精子细胞有阳性表达。结论 SNPH蛋白在脂肪、睾丸、脑、心肌中都有表达。在大鼠睾丸组织发育的后期,SNPH基因的转录表达逐渐升高,因此该基因可能参与精子成熟,且主要在精子细胞中表达。     

尤文肉瘤EWS—FLI1与特异序列结合并调节表达的研究

95％的尤文肉瘤家族（Ewing family of tumor，EFT）具有特异的EWS—FLI1融合基因。EWS—FLI1是一个比正常的FLI1强多许多倍的转录因子，并且可以与特异ACCGGAAGT基因序列结合。把该特异性结合序列插入到荧光素酶报告基因载体（pGL3-Promoter，promega公司）中，构建了新表达载体pS2。我们用脂质体法转染pS2到尤文肉瘤细胞系（RD—ES、SK—ES）及对照细胞系（NIH3T3、Hela），然后进行荧光定量检测，检测各组细胞系相对荧光强度。结果证实尤文肉瘤的EWS—FLI1确实能够与该特异序列结合并促进下游虫荧光素酶基因的高表达。     

一个含有25bp内含子的阴道毛滴虫Rabl-like新基因

目的 克隆和鉴定一个新的阴道毛滴虫Rabl-like基因（TvRabl-like）及其内含子。方法 我们从一阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出一个cDNA克隆,它与各物种的Rab家族蛋白有较高的同源性,因此我们进一步用BLASTP、RPS-BLAST、ClustalW和MEGA3等分析软件对该cDNA克隆进行了序列分析和进化树分析;用PCR和RT-PCR等技术分别对该基因组和mRNA进行了扩增和测序分析。结果 序列分析结果表明该eDNA克隆长705bp,开放阅读框具603bp,推测肽链含有200个氨基酸。序列比较分析结果提示该cDNA克隆所推测的蛋白质是一个Rabl亚家族的亚型。进化树分析也表明它属于阴道毛滴虫Rabl亚家族。基因组PCR扩增和测序分析表明该基因包含一个25bp的内含子,该内含子具有阴道毛滴虫和其它真核生物较大内含子所具备的典型的5’GT-AG-3’和分支位点基序。RT-PCR产物及其测序分析表明在该基因的转录本中存在着未剪切和剪切后的mRNA,说明确实有内含子的存在。结论 TvRabl-like基因属于阴道毛滴虫Rabl亚家族,该基因含有一个25bp的内含子。该内含子是至今发现的最小的阴道毛滴虫基因内含子之一,很可能也是真核生物中最小的内含子。对诸类最低等真核生物内含子的研究将有助于我们理解真核生物内含子的起源和进化。     

ZBTB5基因及其表达特征的初步研究

目的了解ZBTB5基因的序列和表达特征。方法运用生物信息学方法分析该基因的序列特征和染色体定位,分子生物学方法分析其表达特征和亚细胞定位。结果ZBTB5基因的N末端含一个BTB结构域,C末端含2个C2H2锌指结构域;根据人类基因组序列数据库搜索,将ZBTB5基因定位在人类基因组第9染色体上。Northern杂交结果表明,ZBTB5基因在不同组织中表达差异明显。免疫胶体金技术显示该蛋白定位于细胞核。结论该基因可能是一个转录因子。     

ZB TB 32生物学功能的研究进展

锌指蛋白家族是真核生物中重要的转录因子家族之一,参与调控多种生物学功能,其包含多个亚家族。ZBTB（zinc finger and BTB domain‐containing protein）属于其中的 POK （POZ and Krüppel）蛋白家族。该亚家族成员在 N 末端有一个B T B／POZ （Broad‐complex ,Tramtrack ,Bric‐a‐brac／Pocvirus and zinc fingers ）结构域,在哺乳动物中高度保守,主要介导蛋白与蛋白之间的相互作用。C末端有数个C2H2锌指结构域,介导蛋白与DNA 序列间的识别以此来发挥转录调节作用,3％的人类基因通过C2H2结构介导转录调节［1‐3］。ZBTB亚家族成员通常作为转录抑制子调节基因表达,该家族成员的生物学功能一直受到广泛关注与研究。     

利用电子差异展示方法克隆人类睾丸特异性新基因

目的 克隆一个新的人睾丸特异性基因.方法 运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达.然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学方法克隆一个人类新基因的全长eDNA序列.结果 新基因全长1197 bp,开放阅读框为504～806 bp,定位于6p21.1-p21.2.编码由100个氨基酸组成,相对分子质量为10 000,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性.克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRGI(restis development related gene 1),GenBank登录号为DQ168992.结论 电子差异展示方法与实验验证相结合用于发现人类功能新基因足行之有效的.     

一个含有25 bp内含子的阴道毛滴虫Rab1-like新基因

目的 克隆和鉴定一个新的阴道毛滴虫Rab1-like基因(TvRab1-like)及其内含子.方法 我们从一阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出一个cDNA克隆,它与各物种的Rab家族蛋白有较高的同源性,因此我们进一步用BLASTP、RPS-BLAST、ClustalW和MEGA3等分析软件对该cDNA克隆进行了序列分析和进化树分析;用PCR和RT-PCR等技术分别对该基因组和mRNA进行了扩增和测序分析.结果 序列分析结果表明该cDNA克隆长705 bp,开放阅读框具603 bp,推测肽链含有200个氨基酸.序列比较分析结果提示该cDNA克隆所推测的蛋白质是一个Rab1亚家族的亚型.进化树分析也表明它属于阴道毛滴虫Rab1亚家族.基因组PCR扩增和测序分析表明该基因包含一个25 bp的内含子,该内含子具有阴道毛滴虫和其它真核生物较大内含子所具备的典型的5'GT-AG-3'和分支位点基序.RT-PCR产物及其测序分析表明在该基因的转录本中存在着未剪切和剪切后的mRNA,说明确实有内含子的存在.结论 TvRab1-like基因属于阴道毛滴虫Rab1亚家族,该基因含有一个25 bp的内含子.该内含子是至今发现的最小的阴道毛滴虫基因内含子之一,很可能也是真核生物中最小的内含子.对诸类最低等真核生物内含子的研究将有助于我们理解真核生物内含子的起源和进化.