脂质体介导c—myc反义核酸对HL—60细胞作用的研究

原癌基因ｃ－ｍｙｃ参与调控细胞的增殖、分化和凋亡过程,在白血病细胞株ＨＬ－６０ 中有很高的表达。ｃ－ｍｙｃ通过扩增活化或基因重排而异常激活,在白血病的发生和发展中可能起着重要的作用。　目的　通过脂质体介导ｃ－ｍｙｃ反义核酸转染ＨＬ－６０ 细胞,观察其抑制细胞生长增殖、促进分化、诱导凋亡,降低ｃ－ｍｙｃｍ ＲＮＡ 和蛋白表达水平,探讨反义核酸的抗肿瘤作用机制。　方法　ＨＬ－６０ 细胞在３７℃、５％ＣＯ２ 条件下,培养于１０％ 小牛血清１６４０ 培养液中,细胞接种密度为４×１０７／Ｌ,反义核酸终浓度为１μｍ ｏｌ／Ｌ,反义核酸与脂质体比例为１ μｍ ｏｌ（６．５ μｇ）∶１０ μｇ,无血清转染６ ｈ。实验同时设置空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体无义组等对照组。连续培养４ 天。通过锥虫蓝拒染实验测定细胞的生长能力;ＮＢＴ还原实验和瑞特－姬姆萨染色测定细胞的分化能力;免疫细胞化学染色检测ｃ－ｍｙｃ蛋白表达;ＲＴ－ＰＣＲ法检测ｃ－ｍｙｃ ｍ ＲＮＡ 水平;吖啶橙／溴化乙锭染色观察凋亡细胞形态;流式细胞仪检测凋亡率;ＤＮＡ抽提及电泳观察凋亡细胞ＤＮＡ降解片段的形成。　结果　脂质体转染ｃ－ｍｙｃ反义核酸的作用：（１）抑制ＨＬ－６０     

反义bcl─2RNA促进HL─60细胞的凋亡

目的：分析反义ｂｃｌ－２对ＨＬ－６０细胞凋亡的作用，为进一步研究凋亡机制打基础．方法：我们用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将插有反义ｂｃｌ－２基因片段的重组逆转病毒载体ｐＤＯＲ－ＡＢ转染ＨＬ－６０细胞，用核酸打点杂交方法检测转染效果和载体表达效果，用流式细胞仪检测ｂｃｌ－２的改变及细胞周期的变化，用光镜和电镜观察转染细胞的形态学改变，并用转染的细胞对足叶乙甙敏感性的变化间接证明反义ｂｃｌ－２的作用．结果：ｐＤＯＲ－ＡＢ转入ＨＬ－６０细胞并表达ｂｃｌ－２反义ＲＮＡ；细胞内Ｂｃｌ－２蛋白含量明显下降；细胞周期分析可见凋亡峰；电镜下可见凋亡细胞；ＤＮＡ凝胶电泳出现梯状电泳带．结论：反义ｂｃｌ－２瞬时表达可促进ＨＬ－６０细胞的凋亡，ｂｃｌ－２在ＨＬ－６０细胞凋亡的调节中起重要作用     

c-myb反义核酸对急性白血病细胞系HL-60细胞的作用

目的探讨运用反义核酸技术来封闭或阻断原癌基因ｃ－ｍｙｂ的表达的机制。方法利用急性白血病ＨＬ－６０细胞株，运用人工合成的硫代正义、反义核酸处理５天后及未经处理的细胞，观测细胞生长情况，细胞超微结构及ＭＹｂ癌基因蛋白表达的变化情况。结果未经处理的ＨＬ－６０细胞呈指数生长，经过正义核酸处理的细胞生长未受影响；经反义核酸处理的细胞生长被抑制，被抑制达６０％，差别显著（Ｐ＜０．０１）。而未处理及正义组无差别（Ｐ＞０．０５），免疫组化示经反义核酸处理后细胞ｃ－ｍｙｂ蛋白表达受抑制，阳性率从６６．７％±２．２％下降至２３．７％±１．１％。电镜观察，经过正义核酸及未处理的细胞形态无明显改变，经反义核酸处理后的细胞发生不同程度改变，部分损伤性改变，部分诱导凋亡。结论ｃ－ｍｙｂ癌基因蛋白产物对ＨＬ－６０细胞增殖至关重要，硫代反义核酸抑制癌基因蛋白表达，具有细胞毒及诱导凋亡作用，达到抑制ＨＬ－６０细胞增殖目的。     

反义bcl—2RNA促进HL—60细胞的凋亡

目的：分析反义ｂｃｌ－２对ＨＬ－６０细胞凋亡的作用，为进一步研究凋亡机制打基础，方法：我们用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将插有反义ｂｃｌ－２基因片段的重组逆转病毒载体ｐＤＯＲ－ＡＢ转染ＨＬ－６０细胞，用核酸打点杂交方法检测转染效果和载体表达效果，用流式细胞仪检测ｂｃｌ－２的改变及细胞周期的变化，用光镜和电镜观察转染细胞的形态学改变，并用转染的细胞对足叶乙甙敏感性的变化间接证明反义ｂｃｌ－２的作用，结果：ｐ     

反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL－60细胞中bcl－2基因表达的研究

目的：研究ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２基因的表达并探索ｂｃｌ－２基因ｍＲＮＡ特异的反义寡聚脱氧核苷酸（反义ＯＤＮ）对ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２基因表达的影响．方法：采用细胞原位杂交和免疫细胞化学染色技术检测ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２基因的表达，人工合成ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ特异性反义ＯＤＮ片段与ＨＬ－６０细胞共培养，在作用一定时间后分别测定细胞中ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ和Ｂｃｌ－２蛋白表达的变化．结果：ｂｃｌ－２基因在ＨＬ－６０细胞中既有转录水平的高表达，又有翻译水平的高表达，人工合成的反义ＯＤＮ片段在一定浓度范围内，作用一段时间后细胞内ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达无显著改变，而蛋白表达却呈现了显著下降，与浓度和作用时间呈正相关．结论：人工合成的反义ＯＤＮ片段可以抑制ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２的转录作用．在进行白血病基因治疗的实验研究中，ｂｃｌ－２基因可以作为基因治疗的一个有用的靶基因．     

柔红霉素体外对HL-60细胞的凋亡作用

目的：了解柔红霉素（ＤＮＲ）体外作用于ＨＬ－６０　细胞时产生凋亡的规律及一些相关蛋白表达的变化。方法：应用光镜、ＤＮＡ电泳及ＦＣＭ检测ＨＬ－６０细胞发生的凋亡模式；用ＩＣ、ＦＣＭ观察相关蛋白的变化。结果：当ＤＮＲ浓度为０．２μＭ～２μＭ时，ＨＬ－６０细胞发生的凋亡率随浓度的增加与作用时间的延长而升高，可见典型的凋亡细胞及明显的ＤＮＡ梯度条带。１μＭ　ＤＮＲ作用２ｈ时，ｂｃｌ－２与ｃ－ｍｙｃ的荧光强度指数（ＦＩ）降低，ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ－３　的　ＦＩ　升高；而作用５ｈ时，ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ－３的ＦＩ值反而降低。结论：一定浓度的ＤＮＲ在体外可诱导ＨＬ－６０细胞凋亡，它可抑制ｂｃｌ－２与ｃ－ｍｙｃ蛋白的表达，而激活ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白的表达。     

急性白血病Bcl-2反义寡核苷酸基因治疗的实验研究

目的选用２０ｎｔＢｃｌ－２反义硫代磷酸寡核苷酸（Ａｓ－Ｐｓ－ＯＤＮ，ＡＳＰＯ），并以其正义寡核苷酸（ＳＰＯ）为对照做如下问题探讨：（１）普通剂量（５～２０μｍｏｌ）ＡＳＰＯ对ＨＬ６０细胞、正常及缺铁性贫血患者骨髓细胞及急性白血病病人骨髓细胞或外周白血病细胞（幼稚细胞≥８５％）的作用；（２）大剂量（１６０μｍｏｌ）正义或反义寡核苷酸对ＨＬ６０细胞作用的特点，并通过ＡＳＰＯ引起ＨＬ６０细胞Ｂｃｌ－２蛋白表达变化和ＳＰＯ对ＨＬ６０细胞毒性的变化，寻找可能的最佳效应剂量和最小毒性剂量；（３）ＡＳＰＯ联合化疗药物对ＨＬ６０细胞和原代急性白血病细胞的作用。方法台盼蓝拒染试验和克隆培养测定细胞的生长能力；免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测Ｐ２６Ｂｃｌ－２蛋白表达，ＲＴ－ＰＣＲ法检测Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ（Ｂｃｌ－２／β－ａｃｔｉｎ）相对水平；光、电镜下观察凋亡细胞形态，吖啶橙染色及流式细胞仪检测细胞凋亡率，ＤＮＡ提取及电泳观察凋亡细胞ＤＮＡ降解片段的形成；ＭＴＴ法检测ＰＳ－ＯＤＮ及化疗药物的细胞毒作用。结果（１）普通剂量的ＡＳＰＯ即能降低ＨＬ６０细胞及白血病细胞Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ的表达，并抑制ＨＬ６０细胞及１８／２０例白血病细     

bcl-xL基因介导白血病细胞多药耐药的形成

观察ｂｃｌ－ｘＬ基因可否介导白血病细胞的多药耐药,并探讨其机制。方法采用脂质体法将ｂｃｌ－ｘＬｃＤＮＡ转导入ＨＬ－６０细胞,免疫印迹法检测Ｂｃｌ－ｘＬ及抗凋亡蛋白Ｂａｘ的表达;ＭＴＴ法测定呈足乙甙、柔红霉素、阿霉素对转染细胞的细胞毒性;流式细胞仪定量检测凋亡细胞及细胞内药物浓度。     

足叶乙甙诱导HL—60细胞凋亡及其bcl—2基因表达

目的：研究ＨＬ－６０细胞在足叶乙甙诱导的细胞凋亡中ｂｃｌ－２基因表达，以说明药物致凋亡的分子机制。方法：采用细胞存活率，形态改变，ＤＮＡ梯形片段分析和原位缺口标记法，分析药物引起的细胞凋亡，以细胞原位杂交和免疫组化分析ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ及其蛋白的表达水平。     

抗bcl-2核酶在HL-60细胞中的表达及促进其凋亡的研究

抗ｂｃｌ－２核酶在ＨＬ－６０细胞中的表达及促进其凋亡的研究［赵永同，王剑波，朱峰ｅｔａｌ．中华血液学杂志，１９９６；１７（１２）：６１９～６２２］为消除白血病细胞中ｂｃｌ－２基因对细胞凋亡的抑制作用，开辟白血病基因治疗的途径．将合成的针对ｂｃｌ－２ｍ...     

反义核酸对人白血病HL—60细胞中c—myc基因表达的抑制

研究两个反义核酸（１８ｍｅｒ，２１ｍｅｒ）对人白血病ＨＬ－６０细胞中ｃ－ｍｙｃ基因表达的抑制作用。用ＨＬ－６０活细胞计数，ＲＮＡ含量的ＲＴ－ＰＣＲ测定和ｃ－ｍｙｃ基因蛋白的免疫组化染色检查，结果：两个反义核苷酸都以抑制ＨＬ－６０细胞的增殖，增殖抑制率为１１－７５％。反义核酸还抑制ｃ－ｍｙｃＲＮＡ和Ｍｙｃ蛋白的表达，而对ｃ－ｍｙｃ基因正常表达的红白血病细胞Ｋ５６２的增殖和ＰＨＡ刺激的人淋巴细胞的增殖     

表达反义bcl-2的重组腺病毒诱导BT325细胞凋亡

目的 构建携带反义ｂｃｌ－２的重组腺病毒并观察其对ＢＴ３２５细胞生长和凋亡的影响。方法 利用细胞内同源重组的方法构建携带反义ｂｃｌ－２的重组腺病毒，利用反转录ＰＣＲ和免疫组化法检测反义ｂｃｌ－２在细胞内的表达及细胞Ｂｃｌ－２蛋白表达的变化，用ＭＴＴ法和集落形成试验观察重组腺病毒对细胞生长和集落形成能力的影响，用电镜观察、ＤＮＡ片段化分析和流式细胞仪技术检测细胞的凋亡。结果 成功构建了携带反义ｂｃｌ     

切割bcl－2mRNA核酶诱导HL－60细胞凋亡的形态学研究

切割ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ核酶诱导ＨＬ－６０细胞凋亡的形态学研究赵永同，朱峰，金明，王刚，王成济（第四军医大学生物化学教研室西安７１００３３）关键词核糖核酸，凋亡，ｂｃｌ－２中图号Ｑ５２２；Ｑ７８１核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅ，ＲＺ）是一类具有酶活性的ＲＮＡ分...     

C－myc反义寡聚脱氧核苷酸抑制人脑胶质瘤细胞系BT_（325）Myc蛋白合成和细胞增殖并诱导其分化的研究

目的：探讨在体外ｃ－ｍｙｃ反义核酸是否可通过阻断人脑胶质瘤细胞中ｃ－ｍｙｃ基因的表达而抑制细胞增殖并诱导分化．方法：人工合成与ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ起始码及其后四个密码子互补的寡聚脱氧核苷酸（简称反义核酸）片段，用它处理培养的ＢＴ３２５细胞，观察它对细胞增殖的影响．同时用免疫细胞化学方法检测细胞中Ｍｙｃ蛋白的水平以及能反映胶质瘤细胞分化的Ｓ－１００和ＧＦＡＰ两种蛋白的水平，分析这些指标的变化．结果：发现４ｕｍｏｌ／Ｌ的ｃ－ｍｙｃ反义核酸明显抑制ＢＴ３２５细胞的增殖和Ｍｙｃ蛋白的合成，且后者发生在加入反义核酸后１ｈ，并持续２４ｈ以上，而细胞增殖受抑制要到第５日才明显．从第２日到第５日细胞中Ｓ－１００和ＧＦＡＰ染色明显加深，反映细胞有分化趋势．用同样长度的无关序列寡聚脱氧核苷酸作对照，则未见上述变化，表明ｃ－ｍｙｃ反义核酸的作用是序列特异性的．结论：ｃ－ｍｙｃ反义核酸可特异地抑制ＢＴ３２５细胞中Ｍｙｃ蛋白的合成和细胞增殖，并能诱导其分化．     

霍奇金淋巴瘤细胞STAT3的活化对bcl—2蛋白表达的调控作用

目的：探讨霍奇金淋巴瘤（ＨＬ）细胞信号转导物与转录激活剂３（ＳＴＡＴ３）的活化对ｂｃｌ－２蛋白表达的调控作用。方法：采用ＳＰ免疫组织化学方法检测了４０例不同亚型ＨＬ之ＲＳ／Ｈ细胞及１３例反应性增生淋巴结（ＲＨ）的ＳＴＡＴ３和抗凋亡基因蛋白ｂｃｌ－２的表达。结果：ＳＴＡＴ３及ｂｃｌ－２蛋白拓ＨＬ不同亚型的ＲＳ／Ｈ细胞中均呈过度表达＊阳性率分别为６５％和６７．５％）,且两者的阳性率呈明显的正相关（Ｐ〈     

显示切割bcl－2mRNA的核酶在HL－60细胞内表达的免疫组织化学和原位杂交双染色法

显示切割ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ的核酶在ＨＬ－６０细胞内表达的免疫组织化学和原位杂交双染色法王剑波，赵永同，王伯（第四军医大学病理学教研室西安７１００３３第四军医大学生物化学教研室）关键词凋亡；核酸；原位杂交；免疫组织化学中图号Ｒ４４６．６２核酶（ｒｉｂｏ...     

bcl－2反义RNA对白血病细胞株程序化死亡的调变

探讨内源性ｂｃｌ－２蛋白水平降低对白血病细胞程序化死亡的调变。方法采用基因转染技术，观察ｂｃｌ－２反义ＲＮＡ介导的靶基因抑制，对足叶乙甙诱发人Ｔ淋巴细胞白血病（ＣＥＭ）细胞株程序化死亡的影响。结果反义ｂｃｌ－２基因瞬时表达能有效地降低ＣＥＭ内源性Ｂｃｌ－２蛋白水平，并使其对足叶乙甙的细胞毒效应更为敏感；再则，足叶乙甙杀伤ＣＥＭ过程中总是伴有大量细胞凋零小体与梯状脱氧核糖核酸片段（ｌａｄｄｅｒＤＮＡ）形成，尤其是以ｂｃｌ－２反义ＲＮＡ阳性表达的ＣＥＭ作为靶细胞时，其梯状ＤＮＡ诱生量明显高于阴性对照，达４０％左右。结论足叶乙甙杀伤白血病细胞的主要机理之一是诱导程序化细胞死亡，并受靶细胞内源性ｂｃｌ－２蛋白的调变。     

乳腺癌中抗凋亡基因bel—2蛋白产物的表达及意义

ｂｃｌ－２通过抑制细胞凋亡过程，从而导致肿瘤发生。为了检测ｂｃｌ－２在乳腺癌中的表达情况及与临床病理的关系，应用枸橼酸－ＡＢＣ－微波免疫组化技术，对８７例福尔马林固定、石蜡我埋乳腺癌组织进行ｂｃｌ－２癌基因蛋白表达的测定。结果显示：ｂｃｌ－２蛋白在乳腺癌原发灶中的阳性表达率６３．２２％，其表达与ＥＲ、ＰＲ状况关系密切；随着肿瘤病理学级别是的升高，ｂｃｌ－２蛋白表达率下降。ｂｃｌ－２蛋白在区域淋巴结     

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

原发性中枢神经系统恶性淋巴瘤bcl-2基因产物的表达

本研究运用免疫组织化学方法，观察１６例中枢神经系统Ｂ细胞淋巴瘤ｂｃｌ－２蛋白的表达，结果表明，１２例滤泡中心性淋巴瘤ｂｃｌ－２蛋白阳性，１例淋巴浆细胞性淋巴瘤ｂｃｌ－２蛋白阳性，阳性率为８１．２５％。１２例ｂｃｌ－２蛋白阳性者中１０例表达为Ⅱ～Ⅲ级。阳性细胞分布主要呈弥漫性，亦有围绕血管呈袖套状分布。ｂｃｌ－２基因产物高表达介导的细胞凋亡障碍，可能与中枢神经系统淋巴瘤的发生有关。ｂｃｌ－２蛋白在中枢神经系统小圆细胞肿瘤的鉴别诊断中，不失为一种较为简便、可靠的技术