丹参酮合成相关的SmCYP81C16基因克隆和功能研究

目的:丹参(Salvia miltiorrhiza)根中所含的丹参酮为二萜醌类化合物,而鉴定参与丹参酮合成的CYP450基因成为解析丹参酮生物合成途径分子机制的关键步骤。方法:本实验从丹参基因组和转录组数据中筛选到SmCYP81C16基因,采用RT-PCR方法克隆获得基因cDNA全长序列,利用生物信息学分析方法分析其所编码蛋白质的理化性质,预测该蛋白质二级结构、保守结构域等,建立系统发育进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测了该基因的组织/器官表达特异性;通过遗传转化方法获得了该基因的过表达转基因毛状根株系,通过化学检测及代谢组学分析丹参酮类化合物在对照株系和过表达株系中的含量变化。利用实时荧光定量PCR方法检测了毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因中的相对表达量。结果:SmCYP81C16基因全长1497 bp,编码498个氨基酸残基,该蛋白质相对分子质量为55.8 kDa;SmCYP81C16在丹参茎和根的周皮部高表达;通过化学检测及代谢组学分析发现,与对照株系比较,在SmCYP81C16过表达阳性株系中,丹参酮类化合物的含量升高;过表达毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因的表达量显著上升。结论:本研究结果表明SmCYP81C16具有正向调控丹参酮生物合成的功能。本研究为利用生物技术方法提高丹参酮类化合物含量奠定基础。     

一个新的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶3基因的克隆及其表达分析

目的:对丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR3)基因的cDNA克隆并进行序列分析。方法:利用丹参转录组文库克隆一种新的丹参次生代谢途径上的功能基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Clustal W比对丹参中已有的3条HMGR的氨基酸序列,构建系统进化树,QRT-PCR检测丹参HMGR3基因在根、茎、叶中的mRNA水平,并检测Ag+诱导子诱导后丹参毛状根中该基因的转录水平。结果:克隆得到一个新的丹参HMGR3基因,该基因ORF全长1 692 bp,编码563个氨基酸,具有HMGR基因家族的特征序列,与SmHMGR1和SmH-MGR2分别具有75.04%,80.64%的同源性,QRT-PCR分析表明该基因在丹参根茎叶中均有表达,在叶中表达量最高,Ag+诱导24 h时mRNA水平达到最高值。结论:首次克隆得到了1条新的丹参HMGR家族基因SmHMGR3,这一结果为进一步研究丹参次生代谢途径提供了新的思路和靶点。     

丹参功能基因组学研究Ⅳ.丹参乙烯应答因子(ERF)基因的分析

目的：获得丹参乙烯应答因子结合蛋白基因序列，并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究。方法：利用cDNA芯片技术，从不同时期毛状根中获得目的基因。利用BLAST进行序列比对，ORF finder寻找开放读码框，Prosite分析蛋白质的基本结构域。用半定量RT-PCR检测其在丹参组培苗根、茎、叶中的表达情况。结果：得到一个乙烯应答因子结合蛋白基因全长序列，全长952 bp，具有一个699 bp的开放读码框和87 bp的5′非编码区、166 bp的3′非编码区，推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的AP2/ERF DNA结合域，GenBank EF667000，命名为SmERF。半定量RT-PCR表明，SmERF基因在丹参组培苗根、茎、叶中均有转录水平的表达，根中表达量高于茎和叶中的。结论：首次得到丹参乙烯应答因子结合蛋白基因，为其功能研究提供了基础。     

丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析

目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析.方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平.结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53;实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到最高值.结论:从丹参毛状根中克降得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因.     

白花丹参丙酮酸脱羧酶基因的克隆和表达分析

目的 获得白花丹参丙酮酸脱羧酶(SmPDC)全长基因,分析该基因在白花丹参不同组织部位,以及缺氧胁迫处理后的该基因表达差异.方法 利用cDNA文库筛选获得SmPDC基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmPDC基因在白花丹参不同部位的表达情况,及缺氧处理条件下的表达情况.结果 获得的SmPDC基因由2 190个核苷酸组成,编码605个氨基酸,蛋白相对分子质量药6.485×104,等电点pI 5.49;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎和叶;缺氧胁迫处理会诱导该基因的表达,随胁迫时间延长表达量逐渐增加.结论 白花丹参SmPDC基因是PDC家族新成员,其功能与植物耐缺氧代谢途径有关.     

白花丹参顺式还原酮加双氧酶基因的克隆、 分子特征和表达调控分析

目的:获得白花丹参参与乙烯和多胺合成的顺式还原酮加双氧酶(acireductone dioxygenase,ARD)基因(命名为SmARD)序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究.方法:利用全长cDNA文库技术,从两年生白花丹参根中获得目的基因SmARD序列.利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找该基因的开放读码框,prosite分析蛋白质的基本结构域.用半定量RT-PCR检测其在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花中的表达情况.结果:得到688 bp的SmARD基因全长序列.具有一个591 bp的开放读码框,编码196个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量23.27 kDa.使用预测的SmARD蛋白序列在NCBI中进行蛋白保守域分析,发现SmARD与ARD/ARD'家族具有很高的同源性.半定量RT-PCR表明,SmARD在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花等组织中均有转录水平的表达,但是在根部表达最强.水分亏缺处理3 d,150 mmol·L-1 NaCl处理1 d,4℃低温处理1 d和100 μmol·L-1 ABA处理1 d均抑制SmARD的表达,100 μmol·L-1茉莉酸甲脂(MJ)和10 μmol·L-1乙烯利(ETH)处理1 d诱导SmARD的表达.结论:首次得到白花丹参的顺式还原酮加双氧酶(ARD)基因序列,为其参与白花丹参响应逆境和次生代谢产物合成的信号调节功能研究奠定了基础.     

白花丹参鲨烯合酶SQS2的克隆与原核表达分析

该研究根据丹参的转录组数据提供的基因片段设计引物,采用逆转录聚合酶链式反应方法,从白花丹参中克隆鲨烯合酶SQS2的全长cDNA序列,命名为SmSQS2,GenBank注册号KM244731.序列长度为1 597 bp,包含1 245 bp的开放阅读框,推测编码414个氨基酸,含有115 bp的5'UTR和237 bp的3'UTR.利用生物信息学软件对获得的序列进行同源性分析,得出白花丹参SQS2的与紫花丹参SQS2的序列无明显差异.原核表达分析结果表明SmSQS2在大肠杆菌中能表达出与预测蛋白大小相当的目标蛋白,对影响蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度和诱导时宿主菌的吸光度(A600)进行了优化,得出SmSQS2蛋白表达的最佳条件为:IPTG终浓度0.2 mmol· L-1,宿主菌的吸光度(A600)为0.6,温度30℃,诱导时间20 h.这为进一步研究白花丹参鲨烯合酶SQS2在丹参萜类和甾醇类生物合成途径中的作用提供了理论依据.     

丹参功能基因组学研究Ⅳ——丹参乙烯应答因子(ERF)基因的分析

目的:获得丹参乙烯应答因子结合蛋白基因序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究.方法:利用cDNA芯片技术,从不同时期毛状根中获得目的基因.利用BLAST进行序列比对,ORF finder寻找开放读码框,Pmsite分析蛋白质的基本结构域.用半定量RT-PCR检测其在丹参组培苗根、茎、叶中的表达情况.结果:得到1个乙烯应答因子结合蛋白基因全长序列,全长952 bp,具有1个699 bp的开放读码框和87 bp的5'非编码区、166 bp的3'非编码区,推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的AP2/ERF DNA结合域,GenBank EF667000,命名为SmERF.半定量RT-PCR表明,SmERF基因在丹参组培苗根、茎、叶中均有转录水平的表达,根中表达量高于茎和叶中的.结论:首次得到丹参乙烯应答因子结合蛋白基因,为其功能研究提供了基础.     

丹参功能基因组学研究Ⅲ——丹参金属硫蛋白MT-2基因的分析

目的：获得丹参金属硫蛋白基因序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究。方法：利用cDNA芯片技术,从不同时期毛状根中获得目的基因。利用BLAST进行序列比对,ORF finder寻找开放读码框,Prosite分析蛋白质的基本结构域。用半定量RT-PCR检测其在丹参组培苗根、茎、叶中的表达情况。结果：得到2个MT基因全长序列,分别编码80和79个氨基酸,具有Type 2型金属硫蛋白的典型特征,分别命名为SmMT-2a和SmMT-2b,两者具有71.25%的同源性。半定量RT-PCR表明,MT基因在丹参组培苗根、茎、叶中均有转录水平的表达,叶中表达量高于根和茎。结论：首次得到丹参金属硫蛋白基因,为其功能研究提供了基础。     

白花丹参Cu/Zn SOD基因的克隆和表达分析

目的:获取白花丹参Cu/Zn SOD基因的全长cDNA序列,并分析其序列特征和不同外源胁迫下的表达特征。方法:利用已有白花丹参cDNA全长文库,随机测序获得SmCu/Zn SOD全长序列。BLAST进行序列比对,Motif Scan软件分析氨基酸序列的功能区段,RT-PCR技术分析基因表达特征。结果:获得ORF为459 bp的SmCu/Zn SOD全长cDNA序列,编码氨基酸152个,氨基酸序列分析发现其具有典型的Cu/Zn SOD PROSITE pattern,RT-PCR分析其在叶片中表达量最高。水分亏缺、盐胁迫、低温和ABA处理均能较强的诱导该基因的表达。结论:本研究首次获得白花丹参Cu/Zn SOD全长基因序列,该基因可能参与对干旱、盐碱和低温等非生物胁迫的抵抗。     

山东产丹参遗传多样性的扩增片段长度多态性指纹分析

目的研究山东产丹参的遗传多样性,初步探讨扩增片段长度多态性(AFLP)分子标记技术在丹参道地性鉴别上的应用。方法采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术对山东产15个丹参样本进行DNA多态性分析。结果利用4对引物组合构建了15个丹参样本的DNA指纹图谱,通过相似性和聚类结果分析,丹参和白花丹参样本的遗传相似性较低,聚类结果也划分为两大类群,证明它们之间的亲缘关系较远,分化明显。临沂地区的野生和栽培丹参样本聚在一类,且栽培品种和野生品种之间具有一定的遗传差异。结论山东产丹参具有一定的遗传多样性,AFLP技术可用于丹参道地性鉴别。     

大孔树脂在丹参毛状根培养生产丹参酮过程中的原位富集

目的：考察大孔树脂在丹参毛状根培养生产丹参酮过程中的原位富集。方法：在丹参毛状根培养过程中添加大孔树脂,利用高效液相色谱法检测根内、培养液和树脂3个不同位点中3种主要丹参酮(隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ_A)的含量。结果：在选择的3种大孔树脂(X-5,AB-8,XAD-4)中,树脂X-5对丹参毛状根培养过程中生产的丹参酮具有最好的吸附效果,吸附在树脂加入后的4 h达到平衡,最大吸附量达到1.2 mg·g^-1,总丹参酮吸附率达到92.4 %。结论：大孔树脂X-5可以在丹参毛状根培养生产丹参酮的过程中有效地对丹参酮进行原位富集,简化了后续的提取分离步骤。     

丹参功能基因组学研究Ⅱ——丹参毛状根不同时期基因表达谱分析

目的：研究丹参毛状根不同时期的基因表达谱,发掘丹参功能基因。方法：通过比较不同时期丹参毛状根的生长量和次生代谢产物含量确定用于cDNA芯片杂交的材料。采用间接标记法进行探针标记后进行杂交反应,GenePix Pro 4.0软件对芯片图像进行分析,数据用Lowess方法进行归一化处理。采用两倍差异标准结合T检验来确定差异表达基因。Northern点杂交检验4个基因与芯片杂交结果的一致性。差异基因单向测序后经过gap4软件拼接聚类,然后利用BLASTX,BLASTN进行比对分析,利用Gene Ontology和KEGG进一步预测基因的功能。结果：30~45 d为丹参毛状根的快速增殖期,45~60 d为丹参次生代谢产物的快速积累期。将45,60 d丹参毛状根分别与30 d材料进行杂交,得到203个差异基因。4个基因Northern点杂交的结果与芯片杂交结果一致。测序后得到172条EST,拼接聚类后形成114个Unigene,其中功能已知基因62个,功能未定的假想蛋白34个,相似性较低的未鉴定基因9个,无显著相似性的基因9个。 “GO”分类中67个基因得到注释,KEGG分析中74个基因得到注释,26个有详细的代谢途径分析。结论：得到一系列次生代谢相关基因如细胞色素P450、二萜合酶等基因片段,为深入开展丹参功能基因组学研究提供了基础。     

基于茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根酚酸类成分次生代谢机制研究

目的:研究外源茉莉酸甲酯诱导后丹参毛状根中酚酸类有效成分形成的次生代谢分子机制.方法:用茉莉酸甲酯(MJ,100μmol·L-1)对丹参毛状根进行诱导实验,分别在0,6,12,24,36h收获材料,运用实时定量PCR对丹参中迷迭香酸次生代谢途径上的关键酶基因的mRNA表达水平进行检测.同时,采用LC-MS测定各个时间点毛状根材料中迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(LAB)及咖啡酸(CA)的含量.结果与结论:外源性信号分子MJ作用于丹参毛状根,酚酸类成分迅速积累,表现为CA,RA均在诱导后24h达到最大值,LAB的含量36h后达到最高.其诱导机制可能与不同程度的激活RA合成中苯丙氨酸途径上关键酶基因PAL,4CL,C4H与酪氨酸途径中TAT,HPPR基因的表达有关,基因表达在时间呈现先后性,其中,4CL与PAL的贡献度较大.这为今后更深一步的研究丹参水溶性酚酸类成分的次生代谢途径机制提供了依据.     

不同丹参种质田间比较试验

目的　筛选具有优良性状的丹参种质。方法　用统计学方法比较各丹参种质的生物学性状和生物学产量的差异。结果　矮茎丹参在生产性状上均优于其它种质 ;圆叶丹参单果产籽率最高 ;高茎丹参易感染病害。结论　筛选出了在生产上具有优良性状的矮茎丹参     

白花丹参和紫花丹参茎叶微量元素含量分析比较 △

目的:分析比较白花丹参和紫花丹参茎叶微量元素含量。方法:用电感耦合等离子发射光谱法分别测定白花丹参和紫花丹参茎、叶两个部位17种微量矿质元素的含量,对两种丹参茎和叶中的微量矿质元素含量进行分析比较。结果:白花丹参叶中铁、锌、锡、铬、镉、硼、钡、锶、钒、镍和铅等11种元素含量高于紫花丹参,而镁、锂、锰、钴、铜、钛等6种元素含量低于紫花丹参;在白花丹参和紫花丹参的茎中,镍、锡、锂、铜、镉、钛等6种元素的含量几乎完全相同,铁、锌、锰、铬、钒等5种元素含量高于紫花丹参,铅、镁、钴、硼、钡、锶等6种元素含量略低于紫花丹参。结论:从微量元素角度分析,两种丹参都具有重要的药用价值,二者中部分微量元素含量存在一定差异。     

GC-MS法分析丹参花的化学成分

目的:对丹参花氯仿∶甲醇=2∶1提取物化学成分进行定性与定量分析。方法:提取丹参的白花、紫花共4个样品,将提取液上氧化铝硅胶柱(氧化铝∶硅胶=3∶9),用正己烷(100 mL)和二氯甲烷(50 mL)混合液冲洗,得到第一个流分,再用甲醇(100 mL)冲洗,得第二个流分,对两个流分进行GC-MS分析。结果:第一个流分的主要成分为正二十九烷和正三十一烷,第二个流分的主要成分为十六烷酸。结论:该结果为丹参花的进一步研究提供了理论依据。     

白花丹参和紫花丹参茎叶微量元素含量分析比较

目的:分析比较白花丹参和紫花丹参茎叶微量元素含量。方法:用电感耦合等离子发射光谱法分别测定白花丹参和紫花丹参茎、叶两个部位17种微量矿质元素的含量,对两种丹参茎和叶中的微量矿质元素含量进行分析比较。结果:白花丹参叶中铁、锌、锡、铬、镉、硼、钡、锶、钒、镍和铅等11种元素含量高于紫花丹参,而镁、锂、锰、钴、铜、钛等6种元素含量低于紫花丹参;在白花丹参和紫花丹参的茎中,镍、锡、锂、铜、镉、钛等6种元素的含量几乎完全相同,铁、锌、锰、铬、钒等5种元素含量高于紫花丹参,铅、镁、钴、硼、钡、锶等6种元素含量略低于紫花丹参。结论:从微量元素角度分析,两种丹参都具有重要的药用价值,二者中部分微量元素含量存在一定差异。