地榆皂苷Ⅰ基于自噬升高白细胞作用研究

目的研究地榆皂苷Ⅰ(ZgⅠ)升高外周血液中白细胞数量的作用机制。方法昆明种小鼠按体质量随机分为对照组、模型组、3-甲基腺苷(3-MA)组、ZgⅠ(20 mg/kg)组、ZgⅠ(20 mg/kg)+3-MA组。实验第1天以120 mg/kg剂量ip环磷酰胺诱导小鼠骨髓抑制模型并ig给药,连续给药6 d。实验第6天采用全自动血球计数仪测定小鼠血液中白细胞和中性粒细胞数量;采用透射电镜和免疫荧光显微镜观察造血干细胞自噬程度;流式细胞仪测定造血干细胞凋亡率;Western blotting法检测Atg5、Atg7和Beclin-1蛋白表达水平。结果与模型组和3-MA组比较,ZgⅠ可显著升高骨髓抑制小鼠白细胞数量(P0.05)和中性粒细胞数量(P0.05),激发其造血干细胞自噬的发生,并显著上调造血干细胞中Atg5、Atg7和Beclin-1蛋白的表达水平(P0.01)。结论 ZgⅠ是一种高效的自噬激活剂,其升高白细胞机制可能与促进骨髓抑制小鼠造血干细胞自噬有关。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路的三七总皂苷调控自噬抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制研究

目的探讨三七总皂苷(PNS)能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬从而减轻H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制。方法将H9c2细胞分为正常组、缺氧/复氧(A/R)组、A/R+PNS组、A/R+PNS+雷帕霉素(Rapa)组、A/R+Rapa组、A/R+羟氯喹(HCQ)组、A/R+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。通过缺氧6 h、复氧2 h建立H9c2细胞A/R模型。CCK-8法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞损伤,Western blot检测自噬相关蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、m TOR的表达,荧光法观察细胞自噬流。结果与正常组比较,A/R组H9c2细胞存活率明显下降,细胞损伤率明显升高(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P0.05),自噬体和自噬溶酶体数量显著增加,自噬流显著增强(P0.05);与A/R组比较,用PNS预处理后,H9c2细胞存活率明显上升,细胞损伤率明显降低(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P0.05),p62蛋白表达明显升高,与自噬抑制剂HCQ、3-MA作用相似,荧光结果显示,PNS对自噬流有明显抑制作用(P0.05);PNS预处理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高(P0.05)。结论 PNS能有效减轻H9c2细胞A/R损伤,其机制与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路从而抑制自噬流相关。     

苦参碱诱导人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的研究

目的观察苦参碱对人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的影响。方法 (1)苦参碱及伊马替尼对细胞增殖及自噬情况检测:分别设空白对照组、不同浓度(0.25、0.50、1.00、2.00、5.00mg/mL)苦参碱组和(0.05、0.25、0.50、5.00、20.00μmol/L)伊马替尼组,MTT检测K562细胞和K562/IM细胞抑制率。分别设置空白对照组、0.4 mg/mL苦参碱组和0.5μmol/L伊马替尼组,免疫荧光激光共聚焦检测K562细胞和K562/IM细胞自噬现象,Western Blot检测细胞中自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62的表达。(2)苦参碱联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)或雷帕霉素(rapamycin,Rapa)诱导K562/IM细胞自噬及凋亡情况变化的检测:实验分6组,空白对照组、苦参碱组(0.4mg/mL苦参碱处理)、3-MA组(5mmol/L 3-MA处理)、Rapa组(0.5μmol/L Rapa处理)、苦参碱+3-MA组(0.4mg/mL苦参碱+5mmol/L3-MA处理)、苦参碱+Rapa组(0.4mg/mL苦参碱+0.5μmol/L Rapa处理),采用MTT检测细胞的抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡水平;Western Blot检测细胞自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62及凋亡相关蛋白Caspase-3表达。结果 (1)苦参碱和伊马替尼作用K562、K562/IM细胞,细胞增殖受抑制明显(P0.05),LC3-Ⅱ/Ⅰ的聚集明显增加,Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高,P62蛋白表达减少(P0.05),以K562/IM细胞更明显(P0.05)。(2)苦参碱组K562/IM细胞增殖抑制率(36.32±2.21)%,凋亡率(15.35±0.39)%。苦参碱+3-MA组K562/IM细胞增殖抑制率升高[(65.25±2.06)%,P0.01)],凋亡率升高[(21.70±0.48)%,P0.05],同时Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达下降,P62蛋白表达增强,Caspase-3表达增强(P0.05);而苦参碱+Rapa组作用则相反。结论苦参碱和伊马替尼均可抑制K562、K562/IM细胞增殖的同时可诱导自噬,以耐药K562/IM细胞株自噬明显。通过3-MA抑制自噬可增强苦参碱对细胞K562/IM作用的敏感性,而雷帕霉素减弱苦参碱作用。     

丹红注射液对动脉粥样硬化小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化及PI3K/Akt/mTORC1信号通路的影响

目的观察丹红注射液对动脉粥样硬化(AS)小鼠自噬基因Atg13启动子区甲基化及自噬信号通路PI3K/Akt/mTORC1的影响,探讨其可能的作用机制。方法 40只8周龄雄性ApoE~(-/-)小鼠高脂饲料喂养6周,随机分为模型组、阳性对照组和丹红注射液低、高剂量组,每组10只,各给药组给予相应药物干预。6周后RT-PCR检测AS小鼠主动脉自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a的mRNA表达;Westernblot检测AS小鼠主动脉Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、p-Akt、mTORC1和p-mTORC1的蛋白表达;采用亚硫酸氢盐测序法检测AS小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化水平。结果与模型组比较,丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉Beclin1蛋白表达明显升高,丹红注射液低剂量组小鼠主动脉LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显升高(P0.01),丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表达显著升高(P0.01),丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化水平明显降低(P0.01),丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉p-Akt蛋白表达明显降低(P0.01),丹红注射液高剂量组小鼠主动脉p-mTORC1蛋白表达明显降低(P0.01)。结论丹红注射液防治AS的机制可能与降低模型小鼠主动脉Atg13启动子区甲基化水平、抑制PI3K/Akt/mTORC1信号通路和促进细胞自噬有关。     

益气活血解毒中药对梗阻性肾病细胞自噬的调控作用

目的:观察益气活血解毒中药对梗阻性肾病中细胞自噬的作用。方法:将48只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、缬沙坦组和中药组,除假手术组外,其余各组结扎大鼠单侧输尿管复制梗阻性肾病的动物模型。缬沙坦组和中药组分别给予10 mg/(kg·d)缬沙坦和14 g/(kg·d)益气活血解毒中药,10天后摘取梗阻侧肾脏。通过Western blot和免疫组化检测血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶(Serum and glucocorticoid induced kinase,SGK-1)、自噬相关基因5 (Autophagy associated gene 5,Atg5)、自噬相关基因Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3 (Microtubular-associated protein 1 light chain 3,LC3)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(Phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase,P-ERK1/2)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated target of rapamycin,P-mTOR)的表达。结果:与假手术组比较,模型组自噬蛋白Atg5、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、SGK-1与P-ERK1/2表达增强,P-mTOR表达减弱,差异均有统计学意义(P 0.01)。与模型组比较,缬沙坦组和中药组自噬蛋白Atg5、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、SGK-1及P-ERK1/2表达降低,P-mTOR表达增强,差异均有统计学意义(P 0.05,P 0.01)。结论:益气活血解毒中药可以通过调控SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR通路,抑制盐皮质激素受体(Mineralocorticoid receptor,MR)的活化,从而纠正梗阻性肾病中细胞自噬的异常。     

当归补血汤对再障小鼠骨髓造血及线粒体自噬的实验研究

目的:探讨当归补血汤对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血及骨髓单个核细胞线粒体自噬的影响。方法:化学方法制备再障小鼠模型,观察2.7g/kg、5.4g/kg、10.8g/kg当归补血汤对再障小鼠一般症状、外周血白细胞(WBC)、血红蛋白(HCG)、血小板(PLT)和单侧股骨骨髓单个核细胞(BMMNC)数量的影响,光学显微镜下观察其对再障小鼠骨髓病理的影响,估算造血组织增生度,透射电镜下观察其对小鼠骨髓单个核细胞线粒体自噬的影响。结果:当归补血汤可有效改善再障小鼠的骨髓病理形态,提高造血组织增生度,抑制再障造成的线粒体过度自噬。结论:当归补血汤可以促进再障小鼠骨髓造血功能恢复,线粒体自噬的改变可能是机制之一。     

熊果酸对肺癌细胞A549自噬相关蛋白的影响

目的研究自噬在熊果酸抑制人肺癌A549细胞增殖中的作用及机制。方法应用CCK8法检测熊果酸对A549细胞增殖的影响;实时荧光定量PCR法检测自噬相关基因LC3、 Beclin-1及p62的表达情况;Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、 Beclin-1及p62的表达情况。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌(3-MA)观察熊果酸对A549细胞增殖的抑制作用。结果熊果酸可以显著抑制人肺癌A549细胞的活力(P0.01)且随着熊果酸剂量增加,对细胞的生长抑制率显著上升。熊果酸可诱导A549细胞自噬发生,诱导自噬相关基因、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1表达的增加;p62表达降低(P0.01);3MA使得自噬相关基因、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1表达明显降低;p62表达明显增加(P0.01)。自噬抑制剂3-MA提高了熊果酸对A549细胞的抑制作用(P0.01)。结论熊果酸抑制A549细胞的增殖,可能通过调节LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1及p62蛋白表达诱导细胞发生自噬。自噬抑制剂3-MA能够增强熊果酸抑制A549细胞的增殖抑制作用,有望为肺癌的临床治疗提供新的联合治疗方案。     

艾灸对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞自噬功能的影响

目的:观察艾灸对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心功能及自噬相关蛋白LC3、p62表达的影响,探讨艾灸防治CHF的可能机制。方法:SD大鼠随机分为正常组12只与造模组48只,采用腹腔注射盐酸多柔比星复制CHF模型,将建模成功的大鼠随机均分为模型组、艾灸组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、自噬激动剂雷帕霉素(RAPA)组。艾灸组用艾条温和灸双侧"肺俞""心俞"穴,每日1次,每次20min,治疗3周。3-MA组按15 mg/kg给予3-MA混悬液腹腔注射,每日1次,共3周。RAPA组按2mg/kg给予RAPA混悬液灌胃,每日1次,共3周。观察大鼠的一般情况及行为体征;心功能测量仪检测大鼠心率(HR)、心输出量(CO)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升或下降速率(±dp/dtmax);HE染色法观察心肌病理变化;Western blot法检测心肌细胞自噬相关蛋白LC3及p62表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠心肌细胞出现肿胀、空泡,肌纤维断裂、溶解,排列紊乱;与模型组比较,艾灸组和3-MA组大鼠心肌细胞的数量正常,心肌纤维排列相对整齐,RAPA组心肌细胞出现肿胀、空泡,心肌纤维断裂、溶解,排列紊乱等状况。与正常组比较,模型组HR和LVEDP明显升高(P0.01),CO、LVSP及±dp/dtmax明显下降(P0.01),LC3-Ⅱ表达、LC3-Ⅱ/Ⅰ明显升高(P0.01),而p62表达明显下降(P0.01)。与模型组比较,艾灸组和3-MA组HR和LVEDP明显下降(P0.05),CO、LVSP及±dp/dtmax明显升高(P0.05),LC3-Ⅱ表达、LC3-Ⅱ/Ⅰ明显降低(P0.01),p62表达明显升高(P0.01),而RAPA组LC3-Ⅱ/Ⅰ明显升高(P0.01),p62表达明显降低(P0.01)。结论:艾灸可以改善CHF大鼠心肌损伤,其作用可能与降低心肌细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ、升高p62蛋白表达水平,发挥类似于3-MA的自噬抑制作用,抑制心肌细胞过度自噬、减轻心肌损伤有关。     

当归多糖干预调节再生障碍性贫血小鼠骨髓单个核细胞线粒体自噬稳态的实验研究

目的 探讨当归多糖对再生障碍性贫血(AA)小鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs)线粒体自噬造成的影响。方法 选取50只小鼠,按照体质量利用均衡随机法将小鼠随机分为正常组、模型组、当归多糖低剂量组、当归多糖中剂量组、当归多糖高剂量组,每组10只。除正常组外,其余组均采用化学方法制备AA小鼠模型。证实成模后,正常组、模型组小鼠每天给予0.2 mL生理盐水灌胃1次;当归多糖低、中、高剂量组分别每天给予当归多糖40 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg灌胃1次。各组均连续灌胃14 d,观察各组小鼠外周血白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(Plt)、BMMNCs计数和BMMNCs线粒体膜电位及骨髓细胞线粒体自噬情况。结果 模型组小鼠外周血WBC、Hb、Plt、BMMNCs计数和BMMNCs线粒体膜电位均明显低于正常组(P均0.05);当归多糖各剂量组各指标均明显高于模型组(P均0.05),且高剂量组明显高于中、低剂量组(P均0.05),中剂量组明显高于低剂量组(P均0.05)。电镜下观察,模型组小鼠骨髓细胞内线粒体损伤,存在过度自噬现象;而当归多糖各剂量组小鼠骨髓细胞内线粒体损伤明显较模型组减轻,自噬泡数量较模型组明显减少。结论 当归多糖能够促使AA小鼠骨髓造血功能的恢复,线粒体自噬的改变可能是其机制之一。     

喜树碱对小鼠骨髓中性粒细胞XIAP、TLR4、CXCR2表达及细胞凋亡影响的研究

目的:观察喜树碱对小鼠骨髓中性粒细胞X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、Toll样受体4(TLR4)、CXC趋化因子受体2(CXCR2)mRNA的表达和细胞凋亡的影响。方法:使用percoll不连续密度梯度离心法分离纯化小鼠骨髓中性粒细胞,对得到的中性粒细胞使用不同浓度的喜树碱加药处理1h。使用荧光定量PCR检测喜树碱对小鼠骨髓中性粒细胞XIAP、TLR4、CXCR2 mRNA表达的影响;采用Annexin V-FITC/PI染色法,使用流式细胞仪检测喜树碱对小鼠骨髓中性粒细胞凋亡的影响。结果:与空白组相比,喜树碱作用1h后,小鼠骨髓中性粒细胞XIAP、TLR4、CXCR2 mRNA表达水平下降,其中喜树碱浓度为2μmol/L和20μmol/L时,上述指标表达水平明显下降(P0.001);与空白组相比,喜树碱作用1h后,小鼠骨髓中性粒细胞凋亡比例略有升高。结论:喜树碱因其具有的拓扑异构酶I毒性诱导骨髓造血干细胞凋亡而导致中性粒细胞数量减少,同时还可能通过抑制骨髓中性粒细胞的迁移和诱导其凋亡,减少进入血液前往炎症和肿瘤部位的中性粒细胞数量。     

痰瘀同治方对心肌缺血再灌注损伤过程中自噬与凋亡相关基因调节作用研究

目的:观察痰瘀同治方对心肌缺血再灌注损伤(IR)不同阶段自噬与凋亡相关基因的调控作用。方法:将80只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、痰瘀同治方组(43 g·kg~(-1)ig)及3-MA干预组(13.5 mg·kg~(-1)iv)。可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min,再灌注2 h复制心肌缺血(MI)及IR模型,利用全自动生化仪检测血清肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)含量;采用RT-PCR法检测各组大鼠心肌自噬基因Beclin-1,心肌微管相关蛋白轻链3蛋白(LC3)及抗凋亡蛋白Bcl-2表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠在缺血及再灌注阶段血清CK,LDH含量及心肌Beclin-1,LC3 mRNA表达均显著增强,且Bcl-2 mRNA表达减弱(P0.01);与模型组比较,痰瘀同治组能降低缺血期血清CK及再灌注期CK,LDH含量(P0.05),抑制缺血期Beclin-1 mRNA及再灌注期Beclin-1,LC3 mRNA表达,上调缺血期及再灌注期Bcl-2 mRNA表达(P0.05,P0.01);与假手术组,3-MA组比较,痰瘀同治组在缺血期可上调Beclin-1,LC3 mRNA表达(P0.01)。经相关性检验,缺血期及再灌注期Beclin-1与Bcl-2均呈负相关表达(P0.01)。结论:痰瘀同治方通过促进缺血期自噬发生及抑制再灌注期自噬过表达,同时促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达而发挥其对缺血再灌注损伤心肌的保护作用。     

补肾活血方对血管性痴呆大鼠海马神经细胞自噬的影响＊

目的 探究补肾活血方对血管性痴呆（Vascular Dementia， VD）大鼠模型自噬的影响。方法 52周龄SD雄性大鼠50只，随机分为假手术组（Sham组）、模型组（VD组）、模型+补肾活血方组（BSHX组）、模型+雷帕霉素组（Rap组）和模型+3-甲基腺嘌呤组（3-MA组），每组10只大鼠。除Sham组外其余各组采用两血管阻断法（2-VO）建立VD模型。BSHX组中药灌胃治疗28天；自噬干预组于造模前30 min侧脑室给药。运用Morris水迷宫测试各组大鼠的学习记忆能力；通过尼氏染色和透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）观察大鼠海马区病理形态及自噬变化；采用蛋白免疫印迹（Western blot）法和反转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测大鼠海马Beclin-1、P62以及微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白及mRNA表达情况。结果 与VD组比较，BSHX组大鼠学习记忆能力显著提升（P<0.05），镜下观察BSHX组和3-MA组的细胞形态及数量均有改善，自噬小体鲜见，Beclin-1以及LC3蛋白和mRNA表达水平显著降低（P<0.05），P62蛋白和mRNA表达水平明显升高（P<0.05）结论 补肾活血方可以降低VD大鼠海马区Beclin-1和LC3蛋白及mRNA的表达，提高P62的表达，通过抑制自噬的发生，减轻对神经细胞的损伤，改善学习记忆能力。     

基于益肾填精法的茸菖胶囊对无镁诱导癫痫模型自噬相关蛋白影响的研究

[目的]探讨中药茸菖胶囊抗癫痫和神经保护作用的自噬调控机制,为临床应用提供实验依据。[方法]将无镁诱导的新生SD大鼠海马神经元放电模型分为模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、5%茸菖胶囊组、10%茸菖胶囊组、20%茸菖胶囊组,另设正常组,给予相应处理6、12、24、72 h后,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测自噬活性相关蛋白Beclin-1、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的表达。[结果]1)Beclin-1蛋白:4个时间点模型组较正常组无显著变化(P0.05),6 h 20%茸菖胶囊组及72 h 5%茸菖胶囊组较同时点模型组显著升高(P0.05)。2)Bcl-2蛋白:6 h模型组较正常组显著降低(P0.05);12、24 h 20%茸菖胶囊组,72 h 5%、10%及20%茸菖胶囊组较模型组显著增强(P0.05或P0.01),20%茸菖胶囊组较5%及10%茸菖胶囊组增强(P0.05)。[结论]基于益肾填精法的茸菖胶囊对无镁诱导的癫痫模型神经元抗癫痫及神经元保护作用的机制可能与影响Beclin-1蛋白的表达干预自噬过程,促进Bcl-2蛋白的表达抑制细胞自噬有关。     

清金化痰汤通过调节自噬对COPD大鼠炎症反应的影响

目的:通过观察清金化痰汤对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠的自噬调节作用,探讨其对COPD大鼠的炎症反应的影响。方法:采用50只SPF级雄性SD大鼠随机分成5组,分别为正常组、模型组、清金化痰汤高、低剂量组(30,10 g·kg~(-1)),罗红霉素组(0. 017 5 g·kg~(-1)),每组10只,除正常组10只外,余40只用单纯烟熏方法建立COPD大鼠动物模型28 d。苏木素-伊红(HE)染色鉴定模型成立后,5组分别灌胃给药14 d,1次/d,模型组、正常组同体积生理盐水灌胃。末次灌胃1 h后处死大鼠提取气道,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),蛋白免疫印迹法(Western blot)检测其自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3),Beclin~(-1)表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测炎症因子白细胞介素-6(IL-6),IL-8的含量变化。结果:Real-time PCR分析显示,与正常组比较,模型组自噬因子Beclin~(-1),LC3 mRNA表达均有不同程度升高(P 0. 05);与模型组比较,清金化痰汤处理后能够明显改善COPD大鼠气道上皮细胞自噬反应,自噬表达明显减少(P 0. 05),高剂量组与罗红霉素组比较差异不显著。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组自噬蛋白表达明显升高(P 0. 05);与模型组比较,清金化痰汤药物处理组自噬蛋白Beclin~(-1),LC3表达下降(P 0. 05);清金化痰汤高剂量组与罗红霉素组比较差异不显著。ELISA结果显示,模型组大鼠的炎症水平升高,用药处理后大鼠气道上皮细胞内的炎症因子IL-6,IL-8含量均明显下降(P 0. 05)。结论:清金化痰汤能够减轻COPD大鼠支气管的炎症反应,其机制可能与清金化痰汤抑制气道上皮的自噬水平有关。     

月华胶囊对耐多药结核分支杆菌感染自噬的影响

目的:以月华胶囊含药血清对耐多药结核分支杆菌感染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)进行干预,探讨其对耐多药结核分支杆菌感染巨噬细胞自噬的作用及其机制。方法:低温冷冻干燥法制备月华胶囊,大鼠按3.02 g·kg^-1灌胃给药7 d,制备月华胶囊含药血清。体外培养RAW264.7,耐多药结核分子杆菌。以细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)检测含药血清对RAW264.7的增殖能力并选定其有效浓度。细胞分为模型组(10%胎牛血清);月华胶囊含药血清组(10%月华胶囊);自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)+月华胶囊含药血清组(5 mg·L^-1的3-MA+10%月华胶囊含药血清);雷帕霉素(Rap)组(200 mg·L^-1的Rap+10%胎牛血清);正常组(10%胎牛血清)。除正常组外,各组细胞培养24 h后,按细胞-细菌1∶10感染4 h。透射电镜观察细胞自噬体的出现和形成;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中I型微管相关蛋白轻链3(LC-3Ⅰ),Ⅱ型微管相关蛋白轻链3/I型微管相关蛋白1轻链3(LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ),Beclin-1蛋白的表达;间接免疫荧光染色法观察细胞中LC3B荧光颗粒、斑点及亮度;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞中LC3,Beclin-1 mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组细胞未见自噬体,细胞中LC-3Ⅱ,LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ,Beclin-1蛋白及LC3,Beclin-1 mRNA的相对表达量均无显著变化,细胞无荧光颗粒、斑点,无荧光亮度。与模型组比较,月华胶囊含药血清组及Rap组细胞,均可观察到自噬体的形成,细胞LC-3Ⅱ,LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ,Beclin-1蛋白及LC3,Beclin-1 mRNA的相对表达量值均明显升高(P<0.05),月华胶囊含药血清组细胞荧光颗粒和荧光斑点明显增多,Rap组细胞荧光颗粒和荧光斑点增多非常明显,荧光闪亮,可判定细胞荧光呈现为阳性;自噬抑制剂3-MA+月华胶囊含药血清组细胞未见自噬体,细胞中LC-3Ⅱ,LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ,Beclin-1蛋白及LC3,Beclin-1 mRNA的相对表达量值均无明显升高。结论:月华胶囊含药血清能使耐多药结核分支杆菌感染细胞产生自噬而发挥抗结核的免疫效应,其机制是通过调控自噬相关蛋白LC3,Beclin-1蛋白及其mRNA的表达水平,促使LC3-I趋向LC3-Ⅱ的转化加快而实现的。     

当归多糖对糖尿病肾病KK-Ay小鼠肾脏AMPK信号通路及线粒体自噬的影响

目的 研究当归多糖对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）KK-Ay小鼠肾脏磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase,AMPK）信号通路及线粒体自噬的影响。方法 SPF级雄性KK-Ay小鼠用高糖高脂饲料喂养,随机分为模型组、厄贝沙坦（25 mg/kg）组和当归多糖高、中、低剂量（400、200、100 mg/kg）组,每组10只;将10只雄性C57BL/6J小鼠作为对照组。给予药物干预4周,观察小鼠一般情况,每周称定体质量并检测血糖;末次给药后,心脏取血并处死小鼠,分离血清检测尿微量白蛋白（urine microalbuminuria,U-ALB）、肌酐（creatinine,SCr）、尿素氮（urea nitrogen,BUN）;采用苏木素-伊红（HE）染色观察肾组织病理变化;采用Western blotting检测肾组织线粒体自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62、Nix]和线粒体裂变蛋白[线粒体动力相关蛋白1(dy...     

迷迭香酸通过AMPK/mTOR通路减轻新生大鼠缺血缺氧性脑损伤研究

目的 探讨迷迭香酸对新生大鼠缺血缺氧脑损伤（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）的影响,及其对单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路的调控作用,初步探讨其脑保护机制。方法 取7 d龄SD新生大鼠,随机分为对照组、模型组、迷迭香酸（300 mg/kg）组、AMPK/mTOR激动剂MT6378（10 mg/kg）组、AMPK抑制剂GSK-690693（30 mg/kg）组和迷迭香酸（300 mg/kg）+MT6378（10 mg/kg）组,每组20只。建立HIE模型,给予相应药物进行干预,采用TTC染色法检测大鼠脑梗死情况;透射电镜（TEM）观察大鼠海马神经元结构损伤及自噬状况;免疫荧光法检测大鼠海马神经元自噬标记物微管相关蛋白1轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B）阳性表达;TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡率;免疫组化法检测大鼠海马神经元磷酸化AMPK（p-AMPK）阳性表达;Western blotting检测大鼠海马组织活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、mTOR及其磷酸化蛋白（p-mTOR）、Unc-51样自噬激活激酶1（uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1,Ulk1）及其磷酸化蛋白（p-Ulk1）、LC3B表达。结果 与对照组相比,模型组大鼠脑梗死严重,海马神经元结构损伤及自噬空泡形成较多,细胞自噬及凋亡水平升高,AMPK/mTOR通路活化（P<0.05）。与模型组相比,迷迭香酸组及GSK-690693组大鼠脑梗死、海马神经元结构损伤、凋亡及自噬减弱,AMPK/mTOR通路被抑制（P<0.05）;MT6378组海马组织AMPK/mTOR通路进一步激活,大鼠脑梗死、海马神经元结构损伤、凋亡及自噬进一步加重（P<0.05）;MT6378可逆转迷迭香酸的上述作用（P<0.05）。结论 迷迭香酸可能通过抑制AMPK/mTOR通路激活,降低海马神经元自噬及凋亡进程,发挥抗HIE脑损伤作用。     

绿原酸通过影响自噬及耐药蛋白表达逆转5-氟尿嘧啶结肠癌细胞的耐药性

[目的] 观察绿原酸（ChA）对耐5-氟尿嘧啶（5-FU）结肠癌细胞（HCT116-R）中多药耐药及自噬蛋白的影响，探讨绿原酸对HCT116-R细胞系的耐药逆转作用及相关作用机制。[方法] 体外传代培养HCT116、HCT116-R细胞系，采用CCK8法检测了ChA和5-FU对HCT116细胞增殖活力的影响；采用100、400 mg/L ChA干预HCT116-R细胞系48 h后，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western Blot）分析细胞中耐药、自噬相关基因及相关蛋白的表达。[结果] ChA可以诱导5-FU对结肠癌HCT116细胞增殖活力的抑制作用；Western Blot实验结果表明HCT116-R细胞中P-糖蛋白（P-gp）、肺抗药性相关蛋白（LRP）、自噬相关基因Beclin-1及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）表达相对于HCT116细胞显著上调（P<0.05）；进一步分析发现ChA呈剂量性的抑制HCT116-R细胞中P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1 mRNA和蛋白表达（P<0.05），并且ChA还降低了p-Akt1、Akt1、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR表达（P<0.05）。[结论] ChA通过影响Akt1/mTOR分子通路活化降低耐药相关蛋白P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1、HMGB1表达，进而逆转5-FU结肠癌细胞系的耐药性。     

自噬对苯丙素苷逆转耐药作用的影响

目的探讨自噬对苯丙素苷(PPG)逆转大肠癌耐药株LoVo/Adr细胞耐药作用的机制。方法 MTT法检测PPG对LoVo/Adr细胞增殖及耐药性的影响;Western-blotting检测P-糖蛋白(P-gp)的表达;流式细胞术测定阿霉素(ADR)在LoVo/Adr细胞中的摄入;单丹磺酰尸胺(MDC)染色后在荧光显微镜下观察细胞自噬体及通过流式细胞仪定量分析自噬率;ATP检测试剂盒测定细胞内的ATP水平。结果 80、160 mg/L的PPG可抑制LoVo/Adr细胞增殖,20、40 mg/L的PPG无明显细胞毒作用;20、40 mg/L的PPG对ADR的逆转倍数分别为5.31和7.51倍,加入自噬特异抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)后,2组的逆转倍数分别增至11.84和19.25倍;20、40 mg/L的PPG及5 mmol/L的3-MA均不影响P-gp的表达;20、40 mg/L的PPG作用于LoVo/Adr细胞后,细胞内ADR荧光强度显著增加(P<0.01),联合3-MA后,细胞内ADR的荧光强度进一步增加;在荧光显微镜下,LoVo/Adr细胞很少或几乎没有点状绿色荧光,自噬率为(3.17±0.52)%,20、40 mg/L的PPG作用后,均可见大量点状绿色荧光即自噬体分布于胞浆及核周,自噬率分别升至(45.82±5.47)%、(76.23±8.28)%(P<0.01);当3-MA与PPG合用时,自噬泡的数量较单用PPG明显减少,自噬率分别降至(24.87±2.43)%、(39.56±4.64)%(P<0.05);对照组LoVo/Adr细胞中ATP的浓度为(1.92±0.23)nmol/mg,20、40 mg/L的PPG作用后,细胞内ATP的水平分别下降至(0.97±0.14)、(0.63±0.13)nmol/mg;联合3-MA后,细胞内ATP水平分别进一步降至(0.58±0.12)、(0.33±0.10)nmol/mg。结论 PPG具有诱导大肠癌耐药LoVo/Adr细胞自噬和逆转耐药的特性,这种特性与PPG降低细胞ATP水平,激活自噬、抑制ATP依赖性P-gp的外泵功能有关;同时抑制自噬可导致细胞内ATP水平进一步降低,加重抑制P-gp功能,提高PPG的逆转作用。     

通膝散对急性高尿酸血症小鼠血尿酸的影响

目的 考察通膝散对急性高尿酸血症小鼠的降血尿酸作用.方法 实验分成模型组,别嘌呤醇(10 mg/kg)阳性对照组,通膝散高、中、低剂量(500、300、100 mg/kg)组.除模型组外,其他各组小鼠每天给予相应药物1次,连续给药3d,末次给药后2hip尿酸(450 mg/kg)建立小鼠急性高尿酸血症模型,80 min后检测血尿酸水平.结果 与模型组相比,通膝散高、中剂量组可显著降低小鼠血尿酸水平(P＜0.01),别嘌呤醇也有显著作用(P＜0.01),通膝散高剂量的作用强度与别嘌呤醇相当.结论 通膝散对小鼠急性血尿酸升高具有抑制作用.