酸浆种子蛋白提取方法的比较研究

目的:建立适用于酸浆种子的SDS-PAGE和2-D PAGE蛋白样品提取方法。方法:比较直接提取法、TCA-丙酮法、Tris-丙酮法、饱和酚法、改良饱和酚法等7种提取方法所获酸浆种子总蛋白含量以及SDS-PAGE电泳的谱带数目、强度和电泳分辨率等方面的差异。结果:HEPES buffer直接提取法提取蛋白效率较高,杂质少,电泳谱带清晰,分辨率高;PVP buffer和Lysis buffer A直接提取法次之,但杂质较多;TCA-丙酮法、Tris-丙酮法、饱和酚法和改良的饱和酚法差别不大,蛋白纯度较高,但提取效率低,谱带数目少;此外,Lysis buffer A法、丙酮法和酚法易产生高丰度蛋白的干扰。结论:直接提取法中的HEPES buffer法最好,优于丙酮法、酚法和其它直接提取法。     

瓜蒌种子蛋白质6种提取方法比较

目的:建立适合于瓜蒌种子的蛋白质提取方法。方法:比较水溶液直接提取法(3种)、三氯乙酸(TCA)-丙酮法、三羟甲基氨基甲烷(Tris)-丙酮法、蛋白质提取液提取法等6种蛋白质提取方法所获瓜蒌种子总蛋白含量、聚丙烯酰胺凝胶电泳的谱带等方面的差异。结果:蛋白质提取液提取法、TCA-丙酮法提取蛋白含量较高,但杂质多,电泳谱带严重展宽而且明显拖尾;Tris-丙酮法提出的蛋白质种类缺失严重;直接提取法提取蛋白含量少,但杂质少,电泳谱带清晰,离心2次谱带更加清晰。结论:水溶液直接提取法最适合用于聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质提取液提取法提出蛋白质含量最多。     

不同来源黄芪药材蛋白质电泳鉴别研究

目的 :探讨利用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术鉴别黄芪药材的可行性。方法 :超声提取黄芪药材的水溶性蛋白质,对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,并采用凝胶成像系统分析电泳图谱。结果:黄芪药材的蛋白电泳图谱信息量丰富,不同来源黄芪药材的电泳图谱相似,存在11条明显的共有特征带,同时在条带数目、迁移率和蛋白质相对含量方面存在一定的差异性。结论:PAGE电泳具有分辨率高、谱带稳定、重现性好等优点,可用于黄芪药材的鉴别。     

不同产地桔梗的聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图谱鉴别研究

 目的建立不同产地桔梗药材的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)指纹图谱鉴别方法。方法蛋白质(Pro)、过氧化物酶同工酶(POD)、酯酶同工酶(EST)PAGE指纹图谱分析。结果不同产地桔梗的Pro-PAGE图谱差异极小;POD-PAGE与EST-PAGE图谱在谱带分布及数量上均具有显著性差异,分别具有各自的鉴别谱带。结论POD-PAGE与EST-PAGE指纹图谱可作为鉴别不同产地桔梗的有效方法。     

半夏总蛋白提取及其动态变化研究

目的优选出半夏总蛋白提取的最适方法并研究不同生长时期总蛋白量及成分的变化,为半夏药用成分的监控及合理采收提供科学依据。方法采用丙酮沉淀法、95%(NH4)2SO4盐析法、TCA-丙酮法和Tris-饱和酚法提取半夏总蛋白,筛选半夏总蛋白提取的最佳方法。分别于半夏出芽期、全苗期、珠芽期、佛焰苞期及倒苗期采集样品,分为新鲜组和干燥处理组,提取样品总蛋白,进行SDS-PAGE电泳检测及Bradford浓度测定。结果丙酮沉淀法、95%(NH4)2SO4盐析法、TCA-丙酮法和Tris-饱和酚法提取的半夏总蛋白量分别为0.369、0.678、1.082、0.493 mg/mL;新鲜半夏5个不同生长时期总蛋白量占块茎的质量分数分别为出芽期4.53 mg/g、全苗期2.28 mg/g、珠芽期2.79 mg/g、佛焰苞期7.61 mg/g、倒苗期10.21 mg/g;干燥半夏5个不同生长时期总蛋白量占块茎的质量分数分别为出芽期31.85 mg/g、全苗期18.52 mg/g、珠芽期42.08 mg/g、佛焰苞期28.56 mg/g、倒苗期56.84 mg/g;新鲜半夏块茎中蛋白含有15条蛋白带,干燥处理半夏块茎中蛋白含有5条蛋白带。结论 TCA-丙酮法是半夏总蛋白提取的最佳方法,不同生长时期的半夏块茎中蛋白成分各异,倒苗期总蛋白量最高。     

雪莲组织中蛋白质提取方法比较

目的:比较雪莲组织中蛋白质的提取方法.方法:采用酚法、TCA/丙酮法、尿素法提取雪莲组织中蛋白质,所得蛋白质进行一维SDS-PAGE和双向电泳检测,通过比较电泳图谱确定雪莲组织中蛋白质的最佳提取方法.结果:酚法提取的雪莲组织蛋白质杂质量最少、纯度最高,一维SDS-PAGE和双向电泳图谱显示其具有较多的蛋白质点,且蛋白质种类较多.结论:3种提取方法均有一定的蛋白质损失,建议采用酚法从雪莲组织中提取蛋白质,为雪莲蛋白质组学研究提供参考.     

白首乌蛋白质及同工酶电泳实验研究

目的：建立自首乌电泳指纹图谱，作为中药白首乌药材鉴定及质量检测标准之一。方法：对泰山白首乌Cynanchum bungei Decne、耳叶牛皮消C.auriculatum Royle ex Wight及其栽培种、隔山消C．wilfoldii (Maxim．) Hemsl．等一组白首乌进行了蛋白质及同工酶电泳分析，用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法并扫描电泳结果，测绘上述各样品的蛋白质及同工酶电泳指纹图谱，并与何首乌进行了对比。结果：各样品的指纹图谱均有差异，并具有各自的主要特征谱带与特征峰，白首乌与何首乌差异显著，白首乌种间亦有明显差异。结论：其指纹图谱可以作为白首乌的药材种类鉴定、检测方法之一。     

不同产地红花药材的高效毛细管电沪指纹图谱研究

 目的建立红花道地药材的高效毛细管电泳指纹图谱，并对不同产地红花药材的指纹图谱进行比较。方法以60 %甲醇溶液提取，采用毛细管区带电泳法，运行电压24 kV，运行缓冲液为50 mmol·L^-1硼砂(pH 9.7)其中含18%甲醇，以利福平为参照物(IS)，建立了10批红花道地药材的指纹图谱，并与9个产地的红花药材以及红花的对照药材加以比较。结果在红花道地药材的指纹图谱中，共有峰的相对迁移时间的RSD＜1.8%，相对峰面积的RSD＜6.2% (n=5)。不同产地红花药材的指纹图谱中，共有峰的相对峰面积有一定的差别。结论HPCE指纹图谱分析法可作为红花药材的质量控制方法。     

山东不同产地单叶蔓荆子聚丙烯酰胺凝胶电泳实验研究

目的 建立山东省两种生境下3个不同产地的单叶蔓荆子药材的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)指纹图谱,探讨蔓荆子种内变异规律.方法 蛋白质、过氧化物酶同工酶PAGE指纹图谱分析.结果 两种生境3个产地的单叶蔓荆子的Pro-PAGE、POD-PAGE图谱无显著差异.结论 两种生态环境对蔓荆子遗传特征无影响.     

GC法测定用于生脉注射液中五味子药材挥发性成分指纹图谱的建立

目的建立用于生脉注射液的五味子药材挥发性成分指纹图谱方法。方法采用水蒸气蒸馏法结合固相萃取法提取五味子药材挥发性成分;利用GC法建立指纹图谱检测方法;通过GC-MS联用技术确认指纹图谱中参照物峰;并在生脉注射液中验证五味子药材挥发性成分指纹图谱的控制意义。结果五味子挥发性成分指纹图谱中有9个特征峰,其中5、6号峰分别为4-萜品醇和α-松油醇;生脉注射液中存在五味子药材挥发性成分指纹图谱信息。结论 GC法用于生脉注射液中五味子挥发性成分指纹图谱建立方法稳定可靠,指纹信息在生脉注射中显著,能有效控制生脉注射液中五味子挥发性成分质量。     

黄芪提取物对结肠腺癌Caco-2细胞葡萄糖吸收的影响

目的:探讨黄芪提取物对Caco-2细胞葡萄糖吸收的影响,并探讨其作用机制。方法:采用系统溶剂法提取黄芪各部位,以Caco-2细胞为研究对象,设立空白组和黄芪各提取部位组(乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇4个部位组)。以荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)做为光学探针检测黄芪各提取部位对Caco-2细胞葡萄糖吸收能力的影响。筛选出黄芪中促进Caco-2细胞葡萄糖吸收的药效部位后,对这一药效部位有效作用浓度进行考察。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)法测定Caco-2细胞钠依赖葡萄糖转运蛋白(SGLT1)和2型葡萄糖转运蛋白(GLUT2)蛋白表达。结果:黄芪正丁醇提取部位可以促进Caco-2细胞葡萄糖的吸收,与空白组比较,黄芪正丁醇提取部位100,150 mg·L-1组Caco-2细胞葡萄糖含量升高(P0.05,P0.01);且黄芪正丁醇部位可以上调Caco-2细胞GLUT2和SGLT1蛋白的表达(P0.05,P0.01)。结论:黄芪正丁醇萃取部位可以促进Caco-2细胞葡萄糖的吸收,这一作用机制可能与SGLT1和GLUT2蛋白的调节有关。     

ROC曲线方法确定恒山仿野生黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量限度

目的:探索确立黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量限度的受试者工作特征(ROC)曲线数理统计方法,以区分山西恒山仿野生芪与甘肃移栽芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量差异。方法:选取45批共225个山西恒山仿野生芪样本与42批共210个甘肃移栽芪样本为研究对象,采用2015年版《中国药典》黄芪项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法测定黄芪样本毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。统计分析数据并采用ROC曲线判定山西恒山仿野生芪与甘肃移栽芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷临界值。结果:恒山仿野生芪和甘肃移栽芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均质量分数分别为0. 107%和0. 039%,两者差异有统计学意义(P 0. 01)。ROC曲线判定恒山仿野生芪与甘肃移栽芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量分数差异的临界值为0. 069%。该曲线的灵敏度为100%,特异度为93. 33%,模型诊断准确率为0. 978,说明预测结果准确。结论:ROC曲线法可确定山西恒山仿野生芪与甘肃移栽芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷临界值,提高恒山仿野生芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量限度,体现市场"优质优价"规律,为建立优质黄芪中药材标准提供理论基础。     

基于多种组效模型组合的黄芪组效关系研究＊

目的 基于多种组效模型组合的组效关系，辨识黄芪药材中潜在的活性成分群。方法 以甘肃黄芪与山西黄芪中可辨识的代谢物作为黄芪药材的化学成分组，以小鼠给予黄芪干预后血清中可被鉴定的内源性代谢物，经系统聚类后作为药效指标；对多种组效模型进行组合分析，并基于非参数回归方法来确定组效模型筛选的化学组分个数。结果 组合方法相比传统单一组效模型在均方根误差和分类准确率两种评价指标上表现较好；基于组效关系得出黄芪黄酮包括芒柄花素和毛蕊异黄酮葡萄糖苷以及黄芪皂苷Ⅱ能够保护细胞膜，促进能量代谢，这也恰好是黄芪实现“补气”功效的重要机制。如黄芪针对“肾病综合征”、“疲劳”、“慢性萎缩性胃炎”、“心力衰竭”等发挥“益气”作用均与调控能量代谢有关，且皂苷和黄酮类成分发挥重要作用。结论 本研究采用组合方法对黄芪的化学成分与药效的相关性进行分析，准确辨识了黄芪药材中潜在的活性成分群，为黄芪质量评价提供一定的选择依据，也为其他中药的药效成分的辨识提供方法参考。     

不同产地和不同部位的壁虎药材蛋白质比较研究

目的:为中药壁虎质量标准的制订与资源开发提供科学的实验依据及可靠的实验方法.方法:提取不同产地的无蹼壁虎药材不同部位(壁虎体与壁虎尾)的水溶性蛋白质,并对其进行含量测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳,比较壁虎药材蛋白质含量和组成的产地差异和部位差异.结果:不同产地壁虎药材的蛋白质含量不同,同一产地壁虎药材的不同部位蛋白质含量也存在差异.蛋白质电泳图谱显示,除共有条带外,同一提取部位的蛋白条带的分布位置和数量随产地存在一定差异.结论:考马斯亮蓝染色法简便、快速,标准曲线线性关系良好,可以用来进行蛋白质含量的测定.聚丙烯酰胺凝胶电泳实验快速、准确、重复性好,得到的蛋白质电泳指纹图谱可作为壁虎药材质量评价和资源开发的重要依据之一.     

黄芪与其混伪品的ITS序列分子鉴定研究

目的:研究黄芪与其混伪品之间的DNA分子鉴别方法.方法:采集不同产地的黄芪药材13份,替代品红芪2份,混伪品紫花苜蓿3份和蜀葵1份,所有样品进行总DNA的提取,PCR扩增,并对扩增产物进行测序得到相应的序列,同时从GenBank下载蓝花棘豆、锦鸡儿2种伪品的ITS序列.用MEGA 4计算其种间的K-2-P距离,最后利用ITS序列构建其系统发育树.结果:测得了19份样品的ITS序列全长,分别为蒙古黄芪646 ～ 650 bp,膜荚黄芪为646～650 bp;红芪为664 bp;紫花苜蓿为659 bp;蜀葵为728 bp,在GenBank中注册,获得登记号.通过以ITS序列重建系统进化树进行的聚类分析可以将黄芪与其混伪品有效的区分开.结论:ITS序列能够成功鉴定黄芪及其易混伪品,可以作为黄芪与其混伪品的分子鉴定方法.     

苍耳子配伍黄芪的HPLC-DAD指纹图谱研究

目的 建立苍耳子配伍黄芪的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱分析方法,研究配伍对各单味药主要特征峰的影响.方法采用HPLC分析苍耳子、黄芪单煎及苍耳子配伍黄芪合煎样品,选用Diamonsil C18色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),以甲醇-0.2%甲酸水为流动相进行线性梯度洗脱,流量为0.8 mL/min,检测波长为260 nm.结果 建立了苍耳子配伍黄芪的HPLC指纹图谱,基本为两单味药特征峰的加和,无明显新特征峰的增加,但配伍合煎对某些成分的溶出有明显的相互抑制作用.结论 本方法简便、快捷,为临床类方的配伍应用以及制定复方质量标准提供了参考.     

基于位点特异性PCR的黄芪与红芪鉴别方法研究

研究黄芪与红芪药材之间的DNA分子鉴别方法。采集不同产地的黄芪药材30份、红芪28份,所有样品进行总DNA的提取,通过对黄芪及红芪药材trnL-trnF片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。并对位点特异性PCR方法进行条件优化。通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现黄芪可扩增出136 bp 片段,红芪可以扩增出323 bp片段。黄芪中掺入10% 以上红芪可以扩增出红芪特异鉴别条带。通过位点特异性PCR的方法实现了黄芪与红芪药材的快速、准确鉴别。     

黄芪药材不同干燥方式对其饮片的提取动力学影响

目的 考察在自然干燥、热风干燥、减压真空干燥方式下的黄芪药材经炮制成饮片后，药效成分的提取动力学。方法 以传统水煎煮法对黄芪饮片进行提取，建立提取动力学模型，比较黄芪药材经自然干燥、热风干燥、减压真空干燥3种初加工方式对饮片中4个评价指标（浸出物、黄芪多糖、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷）提取效率差异。结果 3种干燥方式导致黄芪药材切面品相不一，提取动力学均与一级动力学模型拟合效果最佳，其中减压干燥动力学拟合方程斜率最大，提取效率最高。结论 减压干燥方式4个评价指标的药材-饮片转移率高，干燥、提取速率快，可作为传统干燥方式的替代干燥方式。不同干燥方式不仅对药材品相有影响，同时对药材制成饮片及后续饮片制成制剂过程中评价指标的提取效率也有影响，说明干燥等药材初加工是药材-饮片-制剂品质传递过程中的重要环节，应引起足够的关注。     

正交试验法研究补阳还五汤中保护OGD损伤PC12细胞的主要药味

目的:研究补阳还五汤中保护缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤PC12细胞的主要药味。方法:将补阳还五汤中7种单味药(黄芪、赤芍、当归尾、地龙、川芎、桃仁、红花)作为实验因素,每个因素选取有或无2个水平,按L8(27)正交试验表设计8种拆方。普通级新西兰兔分为9组,空白血清组和8个拆方含药血清组,分别ig蒸馏水和临床等效剂量5倍的拆方药液,24 h内连续ig 3次后,提取血清。运用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和微量酶标法,以细胞活力和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量为指标,观察10%补阳还五汤及其拆方含药血清对OGD损伤18h的PC12细胞的影响。结果:PC12细胞OGD损伤后,其LDH释放量增加(P<0.01),补阳还五汤能显著抑制OGD损伤PC12细胞的LDH释放量(P<0.01)。正交试验结果显示,含黄芪、当归尾、赤芍的拆方组其细胞活力显著增加(P<0.01),LDH释放量显著降低(P<0.01);而含桃仁的拆方组其细胞活力显著下降(P<0.01),含地龙的拆方组其LDH释放量显著升高(P<0.01);红花、川芎对细胞活力及LDH释放量的作用不明显。结论:补阳还五汤对OGD损伤PC12细胞具有保护作用,其中黄芪、当归尾、赤芍是保护OGD损伤PC12细胞的主要药味,桃仁、地龙可加重PC12细胞OGD损伤,红花、川芎对细胞的作用不明显。     

当归药材不同提取部分的指纹图谱分析

目的： 将当归药材用不同溶剂处理,得到当归水提醇沉（SCS）部分、醇提取物（CTW）部分以及挥发油部分,建立当归不同提取部分的HPLC和GC指纹图谱,比较当归不同提取部分中化学成分的差异,为全面评价当归药材的质量提供参考。 方法： 采用HPLC和GC对10批当归药材的不同提取部分的指纹图谱进行研究。用中药色谱指纹图谱计算机辅助相似性评价系统软件对数据进行分析,并对方法进行评价。 结果： 建立了10批当归药材不同提取部分的指纹图谱,鉴别了SCS部分的4个成分、CTW部分的7个成分、以及挥发油部分的3个成分。 结论： 该实验方法准确、可靠、重复性好,建立的当归模式指纹图谱可以全面反映当归药材中化学成分的分布,可以作为当归药材及其制剂质量控制的参考依据。